Bahan baku yang digunakan adalah kacang komak. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis kimia adalah etil asetat, kloroform, metanol, HCl, NaOH 2N, etanol 95 %, air bebas ion, aquades, reagen Folin-Ciocalteau 50 % (v/v), Na2CO3 5 % (b/v), asam tanat, buffer fosfat (0.2M, pH 6.60), K3Fe(CN)6 1 %, larutan trikhloroasetat (TCA) 10 %, larutan FeCl3, buffer asetat 100 mM (pH 5.50), DPPH 3 mM, asam askorbat, K2SO4, HgO, H2SO4, H3BO3, indikator merah metil dan metilen blue, NaOH-Na2S2O3, H2SO4 2N, iodin, kalium iodida, HgCl2, asam asetat glasial, Pb-asetat jenuh, etanol 70 %, HNO3 0.5M, Amonium tiosianat, Ca-fitat 0.2 mM dan amil alkohol.
Peralatan yang digunakan untuk pembuatan tepung kacang komak adalah oven, wileymill dan ayakan. Peralatan untuk ekstraksi diantaranya adalah shaker, magnetic stirrer, penyaring vakum, dan rotavapor. Peralatan untuk analisis adalah tabung reaksi, sudip, pipet tetes, pipet mohr, vorteks, spektrofotometer, labu takar, inkubator, sentrifuse, pHmeter, water bath, gelas piala, pHmeter, termometer, labu Kjeldahl, alat destilasi lengkap, buret, erlenmeyer, aluminium foil, mikropipet, tips, neraca kasar dan neraca analitik.
B. METODOLOGI PENELITIAN a. Penyediaan Sampel
1. Pembuatan Tepung Kacang Komak
Kacang komak disortir dahulu, kemudian dicuci sampai bersih sebelum direndam dalam larutan alkali (NaOH 2N) selama tiga jam untuk mengurangi aktivitas tripsin inhibitor dan tanin, serta menghilangkan aktivitas hemaglutinin. Kacang yang telah direndam lalu ditiriskan dan dicuci dengan air untuk menghilangkan sisa larutan alkali. Pengeringan
2. Pembuatan Fraksi Protein dan Nonprotein Kacang Komak
Pembuatan fraksi protein dan nonprotein kacang komak dapat dilihat pada Gambar 7 (Suwarno, 2003):
ditambah 1 liter aquades (1:10) bersuhu 60ºC
diaduk dengan magnetic stirrer
diatur pH 8.5 – 8.7 dengan NaOH 2N
diekstrak 60ºC selama 30 menit
disentrifuse 2000 rpm selama 15 menit Æ endapan (fraksi nonprotein)
diatur pH supernatan menjadi 4.5 dengan HCl 2 N
disentrifuse 2000 rpm selama 15 menit Æ supernatan (fraksi nonprotein)
ditambah endapan dengan air 200ml (dicuci)
disentrifuse
dikeringkan
digiling
Gambar 7. Proses pembuatan fraksi protein dan nonprotein kacang komak fraksi protein
3. Pembuatan Ekstrak Air
Sejumlah tepung kacang komak direndam dengan akuades dan diekstrak selama 4 jam sambil diaduk dengan magnetic stirrer. Campuran kemudian disaring atau disentrifuse. Ekstrak yang diperoleh dikeringbekukan menggunakan freeze dryer.
4. Pembuatan Ekstrak Kloroform-metanol (Monago dan Alumanah, 2005)
Sejumlah tepung kacang komak direndam dengan pelarut kloroform-metanol dengan perbandingan 2:1 dan diekstrak selama 18 jam pada alat shaker. Campuran disaring dan filtrat diekstrak ulang dengan air dengan volume yang sama. Ekstrak yang diperoleh dihilangkan residu pelarutnya menggunakan rotavapor lalu dikeringkan dengan oven vakum.
5. Pembuatan Ekstrak Etil Asetat
Sejumlah tepung kacang komak direndam dalam pelarut etil asetat dan diekstrak semalam pada alat shaker. Campuran disaring dengan penyaring vakum dan ekstrak yang diperoleh dihilangkan residu pelarutnya menggunakan vacuum evaporator.
b. Perhitungan Rendemen Ekstrak
Rendemen menunjukkan jumlah ekstrak kacang komak yang diperoleh dari setiap gram sampel tepung kacang komak yang diekstrak (%w/w). Perhitungan rendemen adalah sebagai berikut:
% rendemen = berat ekstrak x 100 % berat tepung yang diekstrak
c. Analisis
1. Analisis Kadar Air Metode Oven (AOAC, 1995)
Mula-mula cawan kosong dikeringkan dengan oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Sebanyak 4 – 5 gram contoh dimasukkan dalam cawan yang telah ditimbang dan selanjutnya dikeringkan dalam oven bersuhu 1000C – 105 0C selama 6 jam. Cawan yang telah berisi contoh tersebut dipindahkan ke desikator, didinginkan, dan ditimbang. Pengeringan dilakukan kembali sampai diperoleh berat konstan. Kadar air dihitung berdasarkan kehilangan berat yaitu selisih berat awal dengan berat akhir. Penetapan kadar air berdasarkan perhitungan:
Kadar air (% bb) = ( a – b ) x 100% a
(% bk) = ( a – b ) x 100% b
Keterangan : a = berat bahan awal b = berat bahan akhir
bb = berat basah bk = berat kering
2. Analisis Kadar Protein Metode Kjeldhal (AOAC, 1995)
Sampel sebanyak 0.2 gram ditimbang dan dipindahkan ke labu kjeldahl, ditambahkan 1.9 gram K2SO4, 40 mg HgO dan 2.0 ml H2SO4
pekat. Campuran didestruksi di ruang asam selama + 1.5 jam sampai cairan menjadi bening. Setelah dingin, campuran ditambahkan akuades secara perlahan. Isi labu kjeldhal dipindahkan ke dalam alat destilasi dan dibilas beberapa kali dengan aquades. Erlenmeyer yang berisi larutan 5 ml H3BO3 3 % dan 3 tetes indikator merah metil dan metilen blue dipasang di bawah kondensor (ujung tabung kondensor harus terendam dalam H3BO3). Larutan NaOH-Na2S2O3 sebanyak 8-10 ml ditambahkan
destilat dalam erlenmeyer. Destilat yang tertampung kemudian dititrasi dengan HCl 0.02N sampai terjadi perubahan warna. Hal yang sama dilakukan terhadap blanko. Perhitungan kadar protein adalah sebagai berikut:
% N = (ml HCl-ml blanko) x N HCl x 14.007 x100 mg sampel
% protein = % N x faktor konversi Faktor konversi = 6.25
3. Analisis Kadar Total Fenol dengan Metode Chandler dan Dodds yang Dimodifikasi (Shetty et al., 1995 di dalam Radianti, 2005)
Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih dan ditambahkan 1 ml etanol 95 % dan 5 ml air bebas ion. Selanjutnya ditambahkan pada masing-masing sampel 0.5 ml reagen Folin-Ciocalteu 50 % (v/v) lalu diencerkan dengan air bebas ion. Setelah 5 menit, 1 ml Na2CO3 5 % (w/v) ditambahkan dan diencerkan kembali dengan air bebas ion (jika terlalu pekat). Setelah itu divorteks dan disimpan pada ruangan gelap selama 60 menit. Sampel dihomogenisasi (divorteks) kembali, dan absorbansinya diukur pada 725 nm.
Sebagai standar digunakan asam tanat. Pembuatan standar asam tanat yaitu dengan cara membuat larutan induk 200 ppm. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan total fenol sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Seri larutan standar dipersiapkan seperti tabel di bawah ini:
Tabel 3. Seri larutan standar asam tanat Konsentrasi (ppm) 0 25 50 75 100 125 Larutan induk (ml) 0 0.125 0.25 0.375 0.500 0.625
4. Analisis Fitokimia ( Houghton dan Raman, 1998, Dep Kes RI, 2000, di dalam Azima, 2004)
a. Fenol hidrokuinon (Pereaksi FeCl3)
Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram dilarutkan dalam 1 ml etanol 70 %. Ekstrak sampel diambil 0.5 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5 %. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Senyawa fenol kemungkinan terdapat dalam tanaman dalam bentuk bebas atau dalam bentuk glikosidik.
b. Flavonoid
Ekstrak kacang komak sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian larutan ditambahkan beberapa tetes Pb-asetat jenuh. Terbentuknya larutan berwarna merah atau jingga tua menunjukkan reaksi positif. Warna jingga tua menunjukkan adanya senyawa kalkon dan warna merah menunjukkan adanya senyawa auron.
c. Tanin (Pereaksi FeCl3)
Ekstrak kacang komak sebanyak 50 mg ditambahkan air dan dididihkan selama beberapa menit, kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCl3 1 %. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.
d. Alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N. Kemudian diuji dengan pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner.
Pereaksi Wagner, dibuat dengan cara: dipipet 1.25 ml akuades ditambahkan 0.31 gram iodin dan 0.25 gram kalium iodida. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 25 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat.
Pereaksi Meyer, dibuat dengan cara: 0.136 gram HgCl2
ditambahkan 0.05 gram kalium iodida. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 10 ml dalam labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna.
e. Triterpenoid (Uji Liebermann-Burchard)
Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram ditambahkan 0.2 ml asam asetat glasial, kemudian ditambahkan 3 tetes asam sulfat pekat. Apabila sampel mengandung terpenoid maka reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah dan berubah ke biru.
f. Steroid (Uji Liebermann-Burchard)
Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram dilarutkan dalam 0.5 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 0.125 ml asam asetat glasial dan 0.038 ml asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali, kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.
g. Saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N, menunjukkan adanya saponin.
disaring untuk mendapatkan filtratnya. Sebanyak 0.5 ml filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi kering, ditambahkan 0.9 ml HNO3
0.5 M dan 1 ml FeCl3 (dalam tabung reaksi bertutup), divorteks dan direndam dalam penangas air mendidih selama 20 menit, lalu didinginkan. Campuran dipindahkan ke tabung sentrifuse dan ditambahkan 5 ml amil alkohol lalu divorteks. Sebanyak 0.1 ml amonium tiosianat ditambahkan ke dalam campuran (15 menit sebelum pengukuran absorbansi). Campuran kemudian divorteks dan disentrifuse 1500 rpm selama 2 menit. Lapisan amil alkohol diukur absorbansinya pada panjang gelombang 465 nm (15 menit setelah penambahan amonium tiosianat).
Sebagai standar digunakan Ca-fitat. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan fitat sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Seri larutan standar dipersiapkan seperti pada Tabel 4.
Tabel 4. Seri larutan standar Ca-fitat Konsentrasi (mM) 0 0.04 0.08 0.12 0.166 0.20 Larutan induk (ml) 0 1 2 3 4 5 HNO3 0.5 M (ml) 5 4 3 2 1 0 6. Aktivitas Antioksidan
a. Uji DPPH (Kubo et al., 2002 di dalam Radianti, 2005)
Buffer asetat 100 mM 1 ml (pH 5.50), 1.87 ml metanol dan 0.1 ml radikal bebas DPPH 3 mM dalam metanol dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung reaksi tersebut dan diinkubasi 25ºC selama 20 menit. Absorbansi yang dihasilkan dibaca pada 517 nm. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging (aktivitas antioksidan). Untuk pembuatan kurva standar digunakan asam askorbat, sehingga satuannya dinyatakan dalam AEAC
b. Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi dengan Metode Baku (Oyaizu, 1986 di dalam Kardono dan Dewi, 1998)
Ekstrak (10-1000 µg) dalam 1 ml air suling dicampur dengan dapar fosfat (2.5 ml, 0.2M, pH 6.60 dan kalium ferri sianida (K3Fe(CN)6) (2.5 ml, 1 %) dan campuran diinkubasi pada suhu 50ºC selama 20 menit. Sebanyak 2.5 ml larutan trikholoasetat (TCA) 10 % ditambahkan pada campuran, kemudian disentifuse pada 3000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas dari larutan (2.5 ml) ditambahkan dengan air suling (2.5 ml) dan larutan FeCl3 (0.5 ml, 0.1%) dan serapan diukur pada panjang gelombang 700 nm. Peningkatan absorbansi menunjukkan kekuatan mereduksi yang tinggi.
7. Analisis Statistik
Analisis statistik yang dilakukan pada penelitian ini adalah analisis statistik dengan program SPSS. Metode yang dipakai adalah metode ANOVA Oneway dengan dua kali ulangan dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada selang kepercayaan 95%.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN