Radikal bebas yang berlebihan dapat membahayakan tanaman. Namun secara normal, tanaman mempunyai strategi yang sistematis untuk menanggulangi pembentukan radikal bebas atau untuk mempercepat degradasi senyawa tersebut yaitu sistem pertahanan preventif bersifat enzimatis seperti enzim superoksida dismutase (SOD). Teknologi rekayasa genetik memberikan peluang untuk mengetahui ekspresi gen SOD dengan mengintroduksikannya ke tanaman. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi vektor ekspresi berlebih gen CuZn-SOD dari Melastoma malabathricum (MmCuZn-SOD) dan mengintroduksikannya ke tanaman model Nicotiana benthamiana dan N. tabacum. Vektor ekspresi telah berhasil dikonstruksi yaitu pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD, dan masing-masing telah diintroduksikan ke Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 melalui metode triparental mating (TPM). Tanaman transgenik N. benthamiana dan N. tabacum yang mengandung gen MmCuZn-SOD telah diperoleh melalui A. tumefaciens. Analisis segregasi pada tanaman N. benthamiana dan N. tabacum transgenik generasi T1 berdasarkan analisis Khi-Quadrat () menunjukkan bahwa tanaman transgenik T1 yang diuji sesuai dengan pola pewarisan Mendel 3 : 1.
Abstract
Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as by products of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic mechanisms such as superoxide dismutase (SOD). While genetic engineering technology provides the opportunity to study expression of SOD in plant. This study aimed to construct the overexpression vector of MmCuZn-SOD and introduce into Nicotiana benthamiana and N. tabacum. Overexpression vectors (pMSH-MmCuZn-SOD and pGWB-MmCuZn-SOD) was successfully constructed and each has been introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 by triparental mating (TPM). N.benthamiana and N. tabacum transgenic plants that overexpress MmCuZn-SOD gene have been obtained by mediated-A. tumefaciens. Analysis of segregation of T1 transgenic plants based on analysis of Khi-Quadrat () showed that the T1 transgenic plants accordance with 3:1 of Mendelian inheritance pattern.
Key words: Overexpression vector, CuZn-SOD, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum.
Pendahuluan
Radikal bebas sangat diperlukan bagi kelangsungan beberapa proses fisiologis dalam tanaman, terutama untuk transportasi elektron. Pada kondisi normal, radikal bebas yang merupakan derivat reactive oxygen species (ROS)
terdapat di dalam sel tanaman sebagai produk sampingan dari proses metabolisme (Foyer & Noctor 2005). Namun radikal bebas yang berlebihan dapat membahayakan tanaman karena dapat merusak makromolekul dalam sel seperti karbohidrat, protein, DNA dsb. Kerusakan makro molekul selanjutnya dapat mengakibatkan kematian sel (Halliwel & Gutteridge, 1999; Apel & Hirt 2004). Salah satu faktor yang dapat menyebabkan meningkatnya radikal bebas pada tanaman adalah cekaman lingkungan abiotik.
Secara normal, tanaman mempunyai strategi yang sistematis untuk menanggulangi pembentukan radikal bebas atau untuk mempercepat degradasi senyawa tersebut, yaitu sistim pertahanan preventif yang bersifat enzimatis seperti enzim superoxide dismutase, catalase, dan glutation peroxidase (Fridovich 1975; Bowler et al. 1992; Fridovich 1995; Apel & Hirt 2004; Dong et al. 2008). Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Pada kondisi normal, radikal bebas superoksida yang merupakan derivat reactive oxygen species (ROS) terdapat di dalam sel tanaman sebagai produk sampingan dari proses metabolisme. Ada tiga tipe SOD sesuai dengan kofaktornya, yaitu copper/zinc (CuZn-SOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (Mn-SOD). CuZn-SOD pada umumnya ditemukan di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di mitokondria, dan Fe-SOD di kloroplas tanaman (Bannister et al. 1987).
MmCuZn-SOD adalah gen CuZn-SOD yang telah berhasil diisolasi dari tanaman Melastoma malabathricum L. Pentingnya peran gen SOD dalam merespon cekaman lingkungan termasuk cekaman Al mendorong penelitian untuk menguji ekspresi gen MmCuZn-SOD. Teknologi rekayasa genetik memberikan peluang untuk mengetahui ekspresi gen ini di dalam tanaman. Transgenesis biasa digunakan dalam pengujian peranan suatu gen melalui ekspresi secara berlebih (over expression) atau peniadaan ekspresi (knock-out) dari gen tersebut. Untuk mengetahui fungsinya, gen CuZn-SOD dari Melastoma perlu diuji ekspresinya di tanaman model Nicotiana benthamiana dan N. tabacum.
Perkembangan teknologi rekayasa genetika yang sangat pesat memberikan harapan baru dalam memanipulasi tanaman agar dihasilkan varietas-varietas baru dengan sifat-sifat unggul termasuk tanaman yang tahan terhadap cekaman
abiotik. Transformasi genetika dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens sebagai perantara transformasi merupakan salah satu metoda yang banyak digunakan karena pola integrasinya yang stabil di dalam tanaman (Zupan & Zambryski 1995; Dai et al. 2001; Travella et al. 2005; Bartlett et al. 2008; Bhattacharjee et al. 2010).
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan crown gall pada tanaman. Bakteri ini mampu mentransfer segmen DNA dari plasmid Ti ke dalam sel tanaman dan mengintegrasikannya ke dalam kromosom tanaman. Kemampuan ini menjadikan A. tumefaciens banyak digunakan sebagai cara untuk mentransfer gen ke dalam genom tanaman (Raj et al. 2005; Bartlett et al. 2008; Muzuni 2011). Metode ini mempunyai beberapa keunggulan diantaranya efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal lebih tinggi dan dapat dilakukan dengan peralatan laboratorium yang sederhana serta biaya yang murah dibandingkan dengan metode transformasi yang lain seperti penembakan partikel (microprojectile bombardment) (Travella et al. 2005; Gao et al. 2008).
Konstruksi plasmid dan metode transfer yang tepat merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perakitan tanaman transgenik. Dalam penelitian ini gen MmCuZn-SOD disisipkan ke dalam plasmid biner untuk mengatasi sulitnya menemukan sisi pemotongan yang unik dengan enzim restriksi pada plasmid Ti yang sangat besar (Slamet-Loedin 1994). Transformasi plasmid biner ke dalam A. tumefaciens dilakukan dengan metode triparental mating.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan plasmid biner yang mengandung gen MmCuZn-SOD, dan tanaman N.benthamiana dan N. tabacum transgenik yang membawa gen MmCuZn-SOD.
Bahan dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Plasmid pGEM-MmCuZn-SOD digunakan sebagai sumber gen MmCuZn- SOD. Plasmid biner pMSH1 dan pGWB5 digunakan sebagai vektor ekspresi gen MmCuZn-SOD, plasmid pENTR-D/TOPO (Invitrogen, USA) sebagai entry clone ke plasmid biner pGWB5, A. tumefaciens LBA 4404 digunakan untuk mentransfer gen ke genom tanaman, E. Coli HB 101 yang membawa helper pRK 2013 sebagai plasmid konyugasi untuk memindahkan plasmid biner rekombinan yang mengandung gen MmCuZn-SOD dari bakteri E.coli ke A. tumefaciens.
E.coli DH5α digunakan untuk memperbanyak plasmid biner rekombinan yang telah mengandung gen MmCuZn-SOD, dan kultur invitro N.benthamiana dan N. tabacum digunakan sebagai bahan tanaman.
Metode Penelitian
Konstruksi Vektor Ekspresi pMSH1 untuk MmCuZn-SOD. Fragmen MmCuZn-SOD diperoleh dengan mengamplifikasi plasmid rekombinan pGEM- MmCuZn-SOD dengan primer spesifik (MmSODXba-F : 5’-GCT CTA GAA TGG TGA AGG CTG TGG TTG TTC-3’ ; MmSODSpe-R : 5’-GAC TAG TTT AAC CCT GGA GAC CAA TG-3’). Primer didesain memiliki situs pemotongan enzim restriksi XbaI untuk primer forward dan site pemotongan SpeI untuk primer reverse. Komposisi PCR untuk amplifikasi plasmid pGEM-MmCuZn-SOD adalah 1µl plasmid sebagai cetakan, 1x buffer Taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (RBC Bioscience), dan dH2O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR pada 94oC selama 5 menit, denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada 55oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 1 menit, dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72oC selama 5 menit, diikuti dengan 15oC, selama 10 menit. Hasil PCR MmCuZn-SOD dan plasmid biner pMSH1 (koleksi Yokota laboratories, NAIST, Japan) masing-masing dipotong dengan enzim restriksi XbaI dan SpeI. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi dipurifikasi dengan GenJETTM Gel Extraction Kit (Fermentas, Lithuania) sesuai protokol kit. Fragmen MmCuZn-SOD diligasikan dengan plasmid pMSH1 dengan enzim T4 DNA ligase (Invitrogen, USA). Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli strain DH5α. Klon rekombinan di verifikasi dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik (MmSOD-F1 : 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT-3’).
Konstruksi Vektor pGWB5 Ekspresi untuk MmCuZn-SOD. Fragmen MmCuZn-SOD diperoleh dengan PCR terhadap plasmid rekombinan pGEM- MmCuZn-SOD menggunakan primer spesifik (MmSODpENTER F: 5’-CAC CAT GGT GAA GGC TGT GGT-3’ dan MmSODpENTER R: 5’-ACC CTG GAG ACC AAT GAT CC-3’). Primer didesain dengan penambahan CACC pada ujung 5’ untuk primer forward, supaya dapat disisipkan pada plamid pENTR-D/TOPO sebagai entry vektor dalam metode gateway cloning (Gambar 2). Komposisi
PCR untuk amplifikasi plasmid pGEM-MmCuZn-SOD adalah 1µl plasmid sebagai cetakan, 1x buffer taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase (RBC Bioscience), dan dH2O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan pada kondisi pra PCR 94oC selama 5 menit, denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada 55oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 1 menit, dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72oC selama 5 menit, diikuti dengan 15oC, selama 10 menit. Hasil PCR MmCuZn-SOD direaksikan dengan plasmid pENTR- D/TOPO (Invitrogen, USA) sesuai manual protokol Invitrogen. Hasil reaksi diintroduksikan kedalam E. coli DH5α. Koloni yang tumbuh di media seleksi kanamisin diperbanyak sebagai sumber plasmid yang membawa MmCuZn-SOD. Plasmid diisolasi dengan GenJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) sesuai protokol kit.
Plasmid pENTR-D/TOPO yang membawa gen MmCuZn-SOD (pENT- MmCuZn-SOD) direaksikan dengan plasmid biner (destination vektor) pGWB5 (Invitrogen, USA) dengan ezim LR sesuai dengan protokol gateway cloning (Invitrogen, USA). Hasil ligasi diintroduksikan kedalam E. coli strain DH5α. Klon rekombinan di verifikasi dengan PCR koloni menggunakan perimer spesifik (MmSOD-F1 : 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT-3’).
Triparental Mating (TPM). Introduksi plasmid biner yang mengandung gen MmCuZn-SOD ke dalam A. tumefaciens LBA4404 dilakukan dengan cara triparental mating (Liberty et al. 2008). Transformasi menggunakan 3 macam bakteri yaitu E.coli yang mengandung plasmid pMSH1 atau pGWB5 rekombinan (mengandung gen MmCuZn-SOD), bakteri E.coli HB 101 yang mengandung helper pRK 2013, dan A. tumefaciens LBA 4404. Ketiga bakteri ini ditumbuhkan di dalam media LB padat (Lampiran 2). E. coli yang membawa masing-masing plasmid pMSH1 rekombinan dan pGWB5 rekombinan ditumbuhkan dalam media LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L dan higromisin 50 mg/L, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. E. coli yang membawa plasmid helper ditumbuhkan pada media LB padat dengan penambahan antibiotik kanamisin 50 mg/L. Bakteri A. tumefaciens ditumbuhkan dalam media LB padat yang mengandung antibiotik 50 mg/L streptomisin dan diinkubasi pada suhu 28oC selama 32 jam. Biakan diambil satu gores dan dilarutkan didalam 1
ml media LB cair. Biakan dicampur di media LB padat dengan memasukkan 20 µl secara berurutan E.coli yang membawa pMSH1 atau pGWB5 rekombinan, E. coli yang membawa helper pRK 2013 dan A. tumefaciens. Biakan diinkubasi pada suhu 28oC selama 32 jam. Biakan yang tumbuh diambil satu gores dan dilarutkan dalam 500 µl media LB cair dan 5 µl biakan ini dicampur dengan 495 µl LB cair. Sebanyak 10 µl dari hasil pengenceran disebarkan dalam media seleksi LB + 50 mg/L kanamisin + 50 mg/L higromisin + 50 mg/L streptomisin, dan diinkubasi pada suhu 28oC selama 32 jam. A. tumefaciens transforman diverifikasi dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik (MmSOD-F1 : 5’- ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT-3’).
Perbanyakan Benih dan Tanaman In Vitro. Sterilisasi permukaan biji N.benthamiana dan N. tabacum dilakukan dengan cara merendam biji di dalam larutan alkohol 70% dengan digoyang selama beberapa menit. Selanjutnya biji dicuci menggunakan air steril dan direndam dalam larutan pemutih-desinfektan komersial (NaClO 5,25%, Jhonson) 20% selama 10 menit dan digoyang. Biji dicuci kembali menggunakan air steril sebanyak lima kali. Biji ditumbuhkan dalam media dasar Murashige dan Skoog (MS0) yang mengandung garam- garam MS (Lampiran 3), vitamin, 30 g/L sukrosa, dan 3 g/L agar, lalu diletakkan di ruang gelap selama 2 hari dan kemudian dipindahkan ke ruangan bercahaya, suhu 26º-27ºC. Setelah berumur 1 bulan, tanaman disubkultur ke botol yang lebih besar. Daun diambil dari tanaman yang berumur 2 bulan sebagai eksplan.
Perbanyakan Biakan Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens LBA 4044 yang telah membawa gen MmCu/Zn-SOD diperbanyak dengan menumbuhkan koloni tunggal di dalam 10 mL Luria broth (LB) cair yang mengandung 50 mg/L higromisin, 50 mg/L kanamisin dan 50 mg/L streptomisin, digoyang pada 160 rpm, suhu 28ºC selama 30 jam. Sebanyak 1.5 ml biakan diendapkan menggunakan alat mikrosentrifus pada 5000 rpm selama 5 menit. Endapan Agrobacterium diresuspensi menggunakan larutan media cair yang mengandung garam-garam MS (Caisson), 0,1 mg/L naphthalene acetic acid (NAA), 1 mg/L N6-benzyl adenine purin (BAP) (Ma et al. 2007) dan 40 mg/L asetosiringon hingga OD600 mencapai 0.5 – 0.8.
Transformasi, Seleksi, dan Regenerasi Tanaman. Transformasi dilakukan dengan menggunakan A. tumefaciens menurut prosedur Akashi et al.
(2005) yang dimodifikasi. Daun dari tanaman N. benthamiana dan N. tabacum hasil perbanyakan in vitro berumur 8 minggu dipotong dengan ukuran 1cm x 1cm. Ko-kultivasi dilakukan dengan merendam eksplan dalam suspensi A. tumefaciens OD600 0.5 – 0.8 selama 15 menit, digoyang 100 rpm pada suhu ruang. Selanjutnya eksplan dikeringkan dengan kertas tissue steril dan diletakkan pada media MS0 dengan penambahan 0,1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP dan 40 mg/L asetosiringon, lalu diinkubasi selama 3 hari di ruang gelap. Setelah ko- kultivasi, eksplan dicuci dengan air steril sebanyak tiga kali dan dilanjutkan dengan larutan 500 mg/L carbenicillin dan 200 mg/L cefotaxime. Eksplan dikeringkan dan dipindahkan ke dalam media MS0 yang mengandung 1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP, 100 mg/L kanamisin, 30 mg/L higromisin, 200 mg/L carbenicillin dan 100 mg/L cefotaxime. Biakan tanaman disimpan di ruang dengan suhu 26º-27ºC, 16 jam penyinaran dan 8 jam tanpa cahaya (gelap).
Setelah 3-4 minggu eksplan yang berkalus atau bertunas dipindahkan ke dalam media MS0 yang mengandung 30 mg/L higromisin dan 100 mg/L kanamisin. Setiap 3 minggu sekali eksplan yang masih hidup disubkultur (regenerasi) ke media yang sama sampai eksplan tunas menjadi besar. Jumlah eksplan yang digunakan sebanyak 50.
Tanaman yang telah berumur 2 bulan dan telah membentuk akar diaklimatisasi dalam media sekam selama 2 minggu. Selanjutnya dipindahkan dalam media tanam dan ditumbuhkan di rumah kaca PPSHB IPB (Pusat Penelitian Studi Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor) sampai menghasilkan biji.
Identifikasi Tanaman Transgenik. Tanaman transgenik diidentifikasi menggunakan PCR dengan primer spesifik MmSOD-F1 : 5’- ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R2 : 5’-CAT CTC CAA CGG TGA CAT TG-3’ untuk N. benthamiana dan primer spesifik primer spesifik 35S-F : 5’-AAA CCT CCT CGG ATT CCA TT-3’ dan MmSOD-R2 : 5’-CAT CTC CAA CGG TGA CAT TG-3’ untuk untuk N. benthamiana. DNA tanaman diisolasi dengan menggunakan DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Komposisi PCR yang digunakan adalah 100 ng DNA, 0.5 µM MmSOD-F1, 0.5 µM MmSOD-R2, 1x buffer Taq, 0.2 mM dNTP mix, 1.25 U Taq DNA polymerase (RBC Bioscience) dan ddH2O hingga volume akhir 20 µl. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi pra-PCR 94oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 1 menit; penempelan
primer 55oC, 30 detik; pemanjangan 72oC, 1 menit, dan pasca –PCR 72oC, 5 menit.
Uji Segregasi Tanaman Transgenik T1. Biji tanaman transgenik generasi T1 disterilisasi dan ditumbuhkan dalam media dasar Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung garam-garam MS, vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L agar, dan antibiotik 50 mg/L higromisin. Biji ditumbuhkan di ruang gelap selama 2 hari dan kemudian dipindahkan ke ruangan bercahaya, suhu 26º-27ºC. Setelah berumur 1 bulan, tanaman yang tumbuh diamati dan dihitung berapa yang masih tumbuh dengan baik dan berapa yang mati. Uji segregasi generasi T1 dilakukan dengan uji statistik Khi-Kuadrat (2).
Hasil dan Pembahasan
Konstruksi Plasmid Biner pMSH1
Konstruksi plasmid biner pMSH1 dimulai dengan memotong plasmid menggunakan enzim restriksi XbaI dan SpeI, berdasarkan peta plasmid pMSH1 (Gambar 21). Gen MmCuZn-SOD telah disolasi dari klon pGEM-MmCuZn-SOD dengan PCR menggunakan primer spesifik. Primer forward didesain untuk bisa dipotong dengan enzim XbaI dengan penambahan nukleotida GCTCTAGA pada ujung 5’, dan primer reverse didesain untuk bisa dipotong dengan enzim SpeI dengan penambahan nukleotida GACTAGT pada ujung 5’. Hasil pemotongan plasmid pMSH1 adalah satu fragmen berukuran sekitar 14.000 pb. Sementara hasil PCR pGEM-MmCuZn-SOD adalah fragmen berukuran sekitar 450 pb (Gambar 19). Hasil PCR telah dipotong dengan enzim Xba dan SpeI untuk mendapatkan ujung-ujung fragmen yang tidak rata.
Fragmen gen MmCuZn-SOD dan plasmid pMSH1 dielusi dari gel agarose untuk digunakan pada proses ligasi. Enzim T4 DNA ligase digunakan utuk meligasikan fragmen MmCuZn-SOD dengan plasmid pMSH1. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam sel E.coli DH5α kompeten. E. coli ditumbuhkan pada media seleksi LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L dan higromisin 50 mg/L. Penambahan antibiotik pada media LB dimaksudkan agar koloni yang tumbuh pada media adalah koloni yang sudah membawa plasmid pMSH1, karena plasmid pMSH1 membawa gen antibiotik kanamisin dan higromisin.
Gambar 19. Hasil pemotongan fragmen PCR MmCuZn-SOD dan pMSH1 dengan dengan enzim restriksi Xba1 dan Spe1 (M= Marka. 1= fragmen MmCuZn-SOD, 2= pMSH1)
Delapan koloni yang tumbuh di media seleksi dikonfirmasi lagi dengan PCR koloni untuk memastikan bahwa koloni ini mengandung plasmid rekombinan yang membawa gen MmCuZn-SOD. Hasil PCR koloni dengan primer MmSOD-F1 dan MmSOD-R1 menunjukkan bahwa kedelapan koloni membawa fragmen gen penyandi MmCuZn-SOD yang berukuran sekitar 450 pb (Gambar 20). Hasil ini sesuai dengan ukuran gen MmCuZn-SOD yang telah disisipkan di plasmid pMSH1 (Gambar 19).
Gambar 20. Hasil PCR dengan primer spesifik MmCuZn-SOD dari koloni bakteri E.coli hasil transformasi dengan plasmid pMSH1 rekombinan. (M=Marka, 1-8 = koloni E.coli transforman)
Hasil PCR koloni tersebut menunjukkan bahwa plasmid biner rekombinan yang membawa gen MmCuZn-SOD di bawah promoter p35S CaMV telah berhasil dikonstruksi, dan selanjutnya plasmid ini disebut pMSH-MmCuZn- SOD (Gambar 21).
Gambar 21. Konstruksi plasmid biner pMSH1 yang membawa gen MmCuZn-SOD (pMSH-MmCuZn-SOD).
Konstruksi Plasmid Biner pGWB5
Fragmen MmCuZn-SOD yang berukuran 459 pb telah berhasil diisolasi dari plasmid pGEM-MmCuZn-SOD menggunakan PCR primer spesifik, yang didesain dengan menambahkan nukleotida CACC pada ujung 5’ sehingga ujungnya cocok dengan pENTRTM/D-TOPO® (Gambar 2). PCR dilakukan dengan menggunakan enzim Taq polymerase yang menghasilkan ujung yang tumpul (blunt end) yang tidak mengandung nukleotida A. Hal ini dimaksudkan agar ujung 5’ fragmen hasil PCR adalah CACC supaya dapat tersisipi ke vektor pENTRTM/D-TOPO®.
Fragmen gen MmCuZn-SOD dan plasmid pENTRTM/D-TOPO® telah diligasikan menggunakan reaksi LR (Invitrogen, USA). Hasil ligasi telah diintroduksikan ke dalam sel E.coli DH5α kompeten, dan ditumbuhkan pada media seleksi LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L. Penambahan antibiotik pada media LB dimaksudkan agar koloni yang tumbuh pada media adalah koloni yang sudah membawa plasmid pENTRTM/D-TOPO® rekombinan, karena plasmid pENTRTM/D-TOPO® membawa gen antibiotik kanamisin. Koloni bakteri E.coli yang tumbuh pada media seleksi diverifikasi lagi dengan PCR dengan primer spesifik untuk memastikan bahwa koloni tersebut mengandung gen MmCuZn-SOD. Hasil PCR dengan primer spesifik MmSOD-F1 : 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3’ dan MmSOD-R1: 5’-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT-3’ menunjukkan adanya pita berukuran sekitar 459 pb (Gambar 22). Hasil ini menunjukkan bahwa gen target MmCuZn-SOD yang berukuran 459 pb telah berhasil tersisipi ke dalam pENTR, selanjutnya disebut plasmid pENT-MmCuZn-SOD. cDNA yang tersisipi ke dalam pENTR dapat dipastikan memiliki arah yang tepat karena kesepesifikan pada ujung 5’nya.
Gambar 22. Hasil PCR dengan primer spesifik MmCuZn-SOD dari koloni bakteri E.coli hasil transformasi dengan plasmid pENTR rekombinan (M=Marka, 1-4 = koloni E.coli transforman).
Plasmid pENT-MmCuZn-SOD telah direaksikan dengan plasmid biner pGWB5 menggunakan enzim LR (Invitrogen, USA). Enzim LR membantu untuk memindahkan fragmen MmCuZn-SOD yang sudah tersisipi di pENTRTM/D- TOPO® ke plasmid biner pGWB5. Setelah inkubasi selama 5 jam pada suhu ruang, reaksi ditransformasikan ke E.coli kompeten dan ditumbuhkan pada media seleksi LB padat yang ditambah 50 mg/L kanamisin dan 50 mg/L higromisin. Sebanyak 6 koloni dari media seleksi telah dikonfirmasi dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik MmCuZn-SOD. Hasil PCR dari ke 6 koloni menunjukkan adanya pita target yang berukuran 459 pb (Gambar 23). Hasil ini menunjukkan bahwa gen target MmCuZn-SOD telah tersisipi di dalam plasmid ekspresi pGWB5 di bawah promotor 35S CaMV (Gambar 24), dan selanjutnya disebut plasmid pGWB-MmCuZn-SOD.
Gambar 23. Hasil PCR dengan primer spesifik MmCu/Zn-SOD dari koloni bakteri E.coli hasil transformasi dengan plasmid pGWB5 rekombinan (M=Marka; 1-6 = koloni E.coli transforman).
Gambar 24. Konstruksi plasmid biner pGWB5 yang membawa gen MmCuZn- SOD (pGWB-MmCuZn-SOD).
Introduksi Plasmid Biner pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD ke dalam Bakteri Agrobacterium tumefaciens
Plasmid biner pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD secara terpisah telah berhasil dimasukkan ke dalam A. tumefaciens LBA 4404 melalui triparental mating (TPM) (Lampiran). Masing-masing plasmid pMSH-MmCuZn-
SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD yang terdapat pada E.coli DH5α hasil
transformasi (sebagai donor) dipindahkan ke dalam A.tumefaciens LBA 4044 (sebagai resipien) melalui proses konyugasi dengan bantuan E.coli HB 101 (pRK 2013) yang resisten terhadap antibiotik kanamisin. Bakteri yang mampu hidup pada media seleksi yang mengandung 50 mg/L kanamisin +50 mg/L higromisin + 50 mg/L streptomisin hanya A. tumefaciens LBA 4404 yang mengandung plasmid pMSH-MmCuZn-SOD atau pGWB-MmCuZn-SOD.
Koloni hasil TPM yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya telah dianalisis dengan PCR untuk membuktikan adanya plasmid biner pMSH-
MmCuZn-SOD atau pGWB5-MmCuZn-SOD di dalam A.tumefaciens. PCR
dengan primer spesifik MmSOD-F1 dan MmSOD-R1 terhadap koloni A.
tumefaciens menghasilkan produk PCR berukuran 459 pb (Gambar 25). Hal ini
menunjukkan bahwa proses TPM telah berhasil dan menghasilkan A.tumefaciens
yang mengandung plasmid biner pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-