Tumbuhan yang hidup di tanah asam umumnya adalah tumbuh- tumbuhan yang dapat beradaptasi dengan lingkungan tersebut. Salah satu jenis tumbuhan yang banyak dijumpai pada Tanah Podsolik Merah Kuning yang bersifat asam adalah Melastoma. Tanaman ini tersebar di seluruh Indonesia. Salah satu spesiesnya adalah Melastoma malabathricum L. Tanaman M. malabathricum L. ini sangat tolereran terhadap tanah asam dengan kelarutan Al tinggi sehingga tanaman ini biasa disebut sebagai tanaman indikator tanah asam dan tanaman akumulator Al. Pertumbuhan akar tanaman M. malabathricum L. pada pH 4.0 tidak mengalami gangguan (Muhaemin 2008). Selain itu, telah dibuktikan pula bahwa M. affine D. Don. (sinonim M. malabathricum L.) yang mendapat cekaman 3.2 mM Al pada pH 4 dalam media cair menunjukkan akumulasi Al sebesar 8.82 mg Al/g daun tua setelah 2 bulan perlakuan (Mutiasari 2008). Karena tumbuh baik pada kondisi asam dan Al tinggi, maka tanaman ini dapat digunakan sebagai sumber gen ketahanan terhadap tanah asam dan Al tinggi. Untuk memanfaatkan sifat toleransi M. malabathricum L. terhadap pH rendah dan Al, beberapa gen telah berhasil diisolasi dari tanaman ini yang diduga terlibat dalam sistem toleransi tanaman terhadap cekaman pH rendah dan Al. Gen-gen tersebut adalah gen multidrug resistance associated protein (Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), dan H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010). Isolasi gen-gen tersebut sangat penting dilakukan agar perakitan tanaman transgenik yang toleran terhadap cekaman Al dan pH rendah dapat dilakukan. Tanaman ini diharapkan dapat dikembangkan di lahan marginal sehingga produksi tanaman pangan di lahan tersebut dapat ditingkatkan.
Secara umum, penelitian ini dibagi menjadi 4 percobaan. Percobaan pertama dalam penelitian ini adalah isolasi gen aktin dari M. malabathricum L. Percobaan ini sangat penting dilakukan karena belum ada informasi sekuen DNA yang menyandi aktin dari M.malabathricum di GenBank. cDNA aktin digunakan sebagai kontrol internal pada percobaan ke 2. Hasil percobaan 1 ini adalah empat fragmen MmACT yang telah didaftarkan di bank data GenBank/EMBL/DDBJ, masing-masing dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688, dan AB500689. Keempat fragmen gen aktin ini adalah gen aktin yang pertama diisolasi dari M. malabathricum L. Informasi urutan
nukleotida gen aktin ini sangat diperlukan untuk mendesain primer yang diinginkan untuk kontrol internal dalam menganalisis ekspresi gen-gen yang telah diisolasi dari tanaman M. malabathricum, khususnya analisis ekspresi gen secara kuantitatif. Informasi ini juga penting sebagai kontrol kontaminasi DNA ketika mengisolasi RNA dari tanaman M. malabathricum, karena posisi fragmen MmACT yang telah diisolasi berada pada posisi ekson 2 dan ekson 3.
Informasi fragmen gen aktin yang telah diperoleh, telah dijadikan sebagai sumber informasi untuk mendesain primer aktin. Primer ini telah digunakan untuk kontrol internal dalam analisis gen CuZn-SOD yang telah diisolasi dari M. malabathricum pada percobaan kedua.
Percobaan kedua adalah mengisolasi gen CuZn-SOD dari M.malabathricum L. Desain primer dilakukan terlebih dahulu untuk mengisolasi gen ini. Primer spesifik CuZn-SOD didesain dari daerah terkonservasi sekuen CuZn-SOD dari beberapa tanaman tingkat tinggi yang ada di GenBank. Hasil PCR dengan primer spesifik ini menghasilkan produk PCR berukuran 457 pb. Setelah memastikan bahwa fragmen tersebut adalah fragmen cDNA yang menyandi gen CuZn-SOD yaitu dengan sekuensing dan analisis kesejajaran, maka didesain lagi primer dari fragmen ini untuk memperoleh gen utuh (full length) dengan metode RACE (Rapid Amplification cDNA Ends) dari ujung 5’ dan 3’. Analisis kesejajaran (alignment) urutan nukleotida dari fragmen 5’RACE, fragmen 3’RACE, dan fragmen CuZn-SOD diperoleh full length CuZn-SOD M.malabathricum (MmCuZn-SOD) berukuran 824 pb. Fullength MmCuZn-SOD ini terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino, 114 pb daerah 5’UTR (untranslated regiaon), dan 251 pb daerah 3’UTR.
CuZnSOD adalah superoksida dismutase (SOD) yang memiliki kofaktor copper/zinc (CuZn) pada sisi aktif enzimnya. Protein gen ini umumnya ditemukan di sitosol dan kloroplas. Lokasi protein yang disandikan oleh gen CuZn-SOD yang telah diisolasi dari M. malabathricum (MmCuZN-SOD) adalah di sitosol. Hal ini berdasarkan pada analisis daerah 5’UTR MmCuZn-SOD yang mempunyai urutan kodon akhir (TAA) di depan kodon awal metionin, yang merupakan indikasi bahwa MmCuZn-SOD tidak mempunyai peptida transit untuk target kloroplast. Dugaan ini juga diperkuat dengan analisis filogenetik berdasarkan urutan asam amino, yang menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol tanaman tingkat tinggi lainnya, dibandingkan CuZn-SOD kloroplast.
Ekspresi MmCuZn-SOD pada M. malabathricum diuji dengan semikuantitatif RT-PCR. Aktin digunakan sebagai kontrol internal pada pengujian ini. Pada percobaan ini diketahui bahwa gen MmCuZn-SOD tereksperesi pada daun, batang, dan akar. Menurut Ezaki et al. (2000) gen SOD adalah salah satu gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al. Hasil percobaan kami dengan menguji ekspresi MmCuZn-SOD pada tanaman M.malabathricum L. yang diberi cekaman Al, menunjukkan bahwa tingkat ekspresi MmCuZn-SOD meningkat dengan perlakuan cekaman Al baik pada daun maupun akar. Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi MmCuZn-SOD diinduksi oleh Al pada tanaman M.malabathricum L.
Peranan gen pada tanaman dapat dipelajari dengan pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen antara lain dengan mengkonstruksi vektor over ekspression dan diekspresikan ke tanaman sensitif Al, serta menghentikan dan/atau menurunkan ekspressi gen antara lain dengan mengkonstruksi RNAi. Pendekatan pertama yaitu untuk meningkatkan ekspresi gen telah kami lakukan pada percobaan 3. Gen MmCuZn-SOD telah disisipkan ke vektor ekspresi pMSH1 dan pGWB5 yang mempunyai promotor CaMV dan gen penanda seleksi nptII dan hpt pada daerah T-DNAnya. MmCuZn-SOD dimasukkan ke dalam genom tanaman model Nicotian bentamiana dan N. tabacum melalui Agrobacterium tumefaciens. Hasil analisis tanaman transgenik dengan PCR menunjukkan bahwa tanaman yang tahan kanamisin dan higromisin mengandung DNA sisipan yaitu MmCuZn-SOD. Tanaman transgenik generasi T1 yang diuji dengan media seleksi 50 mg /L higromisin menunjukkan pola segregasi 3:1. Hal ini menunjukkan bahwa gen MmCuZn-SOD yang dimasukkan ke tanaman transgenik dapat diturunkan ke generasi berikutnya mengikuti hukum Mendel monohibrid.
Pendekatan kedua yaitu untuk menurunkan dan/atau menghentikan ekspresi gen dengan RNAi telah dilakukan pada percobaan 4. Bagian 3’UTR gen penyandi MmCuZn-SOD digunakan sebagai fragmen spesifik gen dalam konstruksi vektor RNAi. Fragmen ini telah disisipkan ke pENTRTM/D-TOPO® sebagai entry clone dan selanjutnya disisipkan ke pANDA sebagai vektor RNAi dengan enzim LR (enzim rekombinase). pANDA merupakan plasmid biner yang mempunyai promotor kuat ubiquitin dan gen penanda seleksi nptII dan hpt (Miki & Shimamoto 2004). Vektor RNAi dimasukkan ke A. tumefaciens LBA 4404 melalui triparental mating (TPM), dan selanjutnya bakteri inilah yang digunakan
untuk mengintroduksikan fragmen 3’UTR MmCuZn-SOD ke dalam genom tanaman M.malabathricum L. dan menghasilkan M.malabathricum L. transgenik.
Analisis PCR terhadap tanaman M.malabathricum L. transgenik menunjukkan bahwa tanaman mengandung gen hpt . Hasil ini mengindikasikan bahwa tanaman transgenik juga mengandung DNA sisipan 3’UTR MmCuZn-SOD yang telah difusikan pada daerah hulunya (Gambar 34). Uji tantang terhadap tanaman transgenik dengan cekaman 1 mM Al pada media MS menunjukkan hambatan pertumbuhan sampai pada kematian setelah 7 minggu perlakuan, sementara tanaman kontrol (non transgenik) masih tumbuh dengan baik (Gambar 38). Hal ini diduga karena pembungkaman gen penyandi CuZn-SOD pada tanaman transgenik, dan ini menunjukkan bahwa gen MmCuZn-SOD pada M. malabathricum berperan dalam toleransi terhadap Al. Menurut Cakmak dan Horst (1991) interaksi Al3+ dengan protein dan lipid membran dapat meningkatkan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) seperti superoksida (O2-), H2O2, dan peroksidasi lipid. Superoksida berasal dari beberapa proses metabolik seperti respirasi pada membran plasma, sedangkan H2O2 diproduksi oleh dismutase enzimatik. dan dismutase spontan dari superoksida. Kombinasi O2- dan H2O2 membentuk radikal hidroksi reaktif tinggi yang menginisiasi rantai reaksi radikal bebas yang menghasilkan peroksidasi lipid dan menyebabkan kerusakan membran. Sehingga ketika ekspresi gen CuZn-SOD pada M. malabathricum dibungkam, maka diduga terjadi peningkatan superoksida yang dapat menyebabkan peroksidasi lipid, karena aktivitas dismutase superoksida dikatalisis oleh enzim superoxide dismutase (SOD) (Bowler et al. 1992; Scandalios 1993). Hal yang sama juga dikemukakan oleh Yamamoto et al. (2001) bahwa cekaman Al pada tanaman Pisum sativum menyebabkan peroksidasi lipid.
Analisis ekspresi MmCuZn-SOD pada percobaan 2 dan uji tantang pembungkaman gen MmCuZn-SOD pada percobaan 4 telah membuktikan bahwa ekspresi gen CuZn-SOD diinduksi oleh Al pada tanaman M. malabthricum dan gen ini berperan dalam toleransi Al. Hasil ini berpotensi untuk menguji gen MmCuZn-SOD pada tanaman yang sensitive Al yang diberi cekaman Al, sehingga diharapkan dapat merakit tanaman-tanaman yang toleran Al. Vektor ekspresi berlebih gen MmCuZn-SOD yang telah diintroduksikan ke dalam bakteri A.tumefaciens pada percobaan 2 dapat dimasukkan ke berbagai tanaman yang diiinginkan.
SOD merupakan enzim antioksidan yang berada pada garis depan sebagai pertahanan terhadap radikal superoksida (Fridovich 1995). Enzim ini sangat berperan sebagai pertahanan ketika tanaman mendapat cekaman biotik dan abiotik. Ekspresi gen SOD juga telah dilaporkan meningkat dengan cekaman abiotik lainnya seperti cahaya tinggi (Allen et al. 1997) sulfur dioksida (Tseng et al. 2007; Tseng et al. 2008), ozon (Pitcher and Zilinskas 1996), kekeringan (Mittler & Zilinskas 1994; Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), suhu rendah (Hernandez-Nistal et al. 2002; Lee & Lee 2000; Gao et al. 2009), dan garam ( Sreenivasulu et al. 2000). Peranan SOD ini memberi peluang untuk menganalisis gen MmCuZn-SOD terhadap berbagai cekaman biotik dan abiotik, sehingga gen ini juga berpotensi untuk merakit tanaman toleran terhadap cekaman oksidatif.
Sampai saat ini belum ada laporan mengenai isolasi gen penyandi CuZn- SOD dari tanaman M. malabathricum L, dan ekspresinya terhadap cekaman Al. Oleh karena itu gen MmCuZn-SOD yang diisolasi dari M. malabathricum L. dan diduga berperan dalam toleransi Al tanaman M. malabathricum L. merupakan kebaruan dari penelitian ini (novelty). Hasil ini diharapkan dapat menunjang program pemuliaan tanaman pangan untuk memperoleh tanaman toleran Al dengan mengintroduksikan gen MmCuZn-SOD ke tanaman lain dengan teknik rekayasa genetika.