BAB III METODE PENELITIAN
H. Alat dan Bahan Penelitian
I. Cara Kerja
1. Pembuatan Sediaan Uji
Seduhan teh hijau diperoleh dengan menyeduh seduhan teh hijau produksi PT. Pagilaran Yogyakarta dalam air pada suhu 90°C selama 8 menit dengan konsentrasi yang ditentukan setelah dilakukan uji pendahuluan, kemudian teh diangkat dan ditunggu sampai suhu turun hingga 30°C.
Sampel klinis jamur diperoleh dari instalasi Laboratorium Parasitologi dan Mikologi Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta. Sampel dikirim ke Laboratorium Parasitologi dan Mikologi Fakultas Kedokteran UNS.Pemeriksaan yang dilakukan untuk identifikasi sampel adalah secara langsung atau dengan menggunakan kultur. Identifikasi langsung dilakukan dengan pengecatan Giemsa.Sampel diidentifikasi sebagai
Candida albicans dengan ditemukannya pseudohifa pada pewarnaan Giemsa.
Sedangkan identifikasi dengan kultur dilakukan dengan melihat pertumbuhan koloni jamur. Apabila didapatkan koloni yang berbentuk bulat dengan permukaan sedikit cembung, licin, berwarna krem, halus, berbentuk pasta, dan berbau asam, maka koloni jamur tersebut diidentifikasi sebagai koloni Candida (Geo et al., 2004). Pemeriksaan dilanjutkan dengan germ tube test dengan media serum. Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara meletakkan sedikit koloni pada tetesan serum di atas gelas obyek kemudian diinkubasi dalam suhu 37˚C selama 3 jam. Sampel kemudian diperiksa di bawah mikroskop.Apabila ditemukan perkecambahan dari yeast cell, sampel diidentifikasi sebagai Candida albicans.
Selanjutnya dilakukan pembiakan Candida albicans pada media Saboraud Dextrosa Agar dengan cara sebagai berikut: biakan Candida albicans klinis diambil dengan menggunakan oshe steril dan dimasukkan ke dalam larutan NaCL 0,9% sampai mencapai kekeruhan yang ekuivalen dengan standar 0,5 Mc Farland. Kemudian subkultur Candida albicanstersebut siap digunakan dalam tahap selanjutnya.
2. Uji Pendahuluan
a. Penentuan konsentrasi seduhan teh hijau
1) Kadar 100% diperoleh ketika 37 gram teh hijau diseduh dengan 100 cc air, sehingga diperoleh 80 cc seduhan teh hijau 35,5 cc seduhan teh hijau.
2) Kadar 40% diperoleh dengan mengambil 4 cc seduhan teh hijau + 6 cc air = 10 cc
3) Kadar 60% diperoleh dengan mengambil 6 cc seduhan teh hijau + 4 cc air = 10 cc
4) Kadar 80% diperoleh dengan mengambil 8 cc seduhan teh hijau + 2 cc air = 10 cc
b. Pembuatan media Saboraud Dextrosa Agar (SDA).
1) Untuk setiap 1L aquades dibutuhkan 65 gram bubuk agar SDA. 2) Cawan petri yang digunakan adalah 3 cawan petri berdiameter
10 cm. Larutan agar dituang ke dalam cawan petri hingga tebalnya mencapai 4 mm.
3) Persiapan SDA :
Perhitungan jumlah larutan agar yang dibutuhkan untuk satu kali percobaan pada cawan petri berdiameter 10 cm:
V = πr2
t
= (π . 52 . 0,4) cm3 ≈ 31,43 cm3
Satu cawan petri membutuhkan 31,43 ml larutan SDA, sehingga untuk 3 cawan dibutuhkan 94,29 ml larutan SDA.
1) SDA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan dingin, kemudian dibungkus dengan kertas.
2) Media SDA disterilkan dengan autoclave pada suhu 121˚C selama 15menit bersama peralatan lain yang akan digunakan. 3) Kemudian dibuat sumuran pada cawan petri dengan diameter
6mm, untuk masing-masing seri konsentrasi dibuat 2 sumuran, untuk kontrol positif dibuat 2 sumuran, untuk kontrol negatif dibuat 2 sumuran.
c. Persiapan larutan Kloramfenikol
Penambahan larutan kloramfenikol ke dalam media SDA bertujuan untuk mencegah tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml larutan SDA membutuhkan 400 mg kloramfenikol. Sehingga untuk 94,29 ml larutan SDA dibutuhkan:
94,29 ml x 400 mg = 37,72 mg 1000 ml
Setiap 250 mg bubuk kloramfenikol yang didapatkan dari kapsul kloramfenikol 37,72 mg dilarutkan ke dalam 10 ml NaCl 0,9%. Maka untuk 37,72 mg bubuk kloramfenikol dibutuhkan:
37,72 mg x 10 ml = 1,5 ml aquades 250 mg
d. Penanaman Candida albicans pada media
Beberapa koloni dari sampel klinisCandida abicans diambil menggunakan oshe steril, dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9% sampai mencapai kekeruhan yang ekuivalen dengan 0,5 standart Mc Farland, kemudian diinokulasi sebanyak 0,3 ml ke dalam tiap-tiap media. Suspensi jamur diratakan dengan menggunakan spreader. e. Persiapan preparat obat flukonazol
Preparat flukonazol yang dipakai adala diflucan. Satu kapsul diflucan mengandung 50 mg flukonazol.
Perhitungan :
N1 (konsentrasi awal) = 1,5 mg/ml
N2 (konsentrasi akhir yang digunakan dalam penelitian) = 25 µg/ml
N1.V1 = N2.V2
1,5 mg . 0,05 ml = 25 µg/ml .V2
V2 = 3 mg/ml
Jadi, untuk mendapatkan kadar flukonazol 25 µg, 1,5 mg flukonazol dilarutkan ke dalam 0,05 ml aquades. Kemudian diencerkan kembali sehingga menjadi 3 ml.
f. Pemberian perlakuan
Disiapkan media agar yang telah diinokulasi dengan Candida albicans sebanyak 4 cawan petri. Pada setiap cawan petri dibuat 4 sumuran dengan diameter 6 mm sehingga didapatkan 10 sumuran.
Pada setiap sumuran diisi 0,05 ml kontrol negatif, 0,05 ml seduhan teh hijau dalam konsentrasi yang telah ditentukan.
g. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 2 hari. h. Pengukuran diameter zona hambatan dalam satuan mm. i. Data dimasukkan dalam tabel.
j. Ditentukan hasil uji pendahuluan yang akan digunakan pada tahap penelitian.
3. Penelitian
a. Penentuan besar sampel
Dihitung dengan menggunakan rumus Federer (n-1)(t-1)>15
(n-1)(7-1)>15 6n-6>15 n>3,5
b. Pembuatan media Saboraud Dextrosa Agar.
1) Untuk setiap 1L aquades dibutuhkan 65 gram bubuk agar SDA. 2) Cawan petri yang digunakan adalah 3 cawan petri berdiameter
10 cm. Larutan agar dituang ke dalam cawan petri hingga tebalnya mencapai 4 mm.
3) Persiapan SDA :
Perhitungan jumlah larutan agar yang dibutuhkan untuk satu kali percobaan pada cawan petri berdiameter 10 cm:
= (π . 52 . 0,4) cm3 ≈ 31,43 cm3
«–» 31,43 ml
Satu cawan petri membutuhkan 31,43 ml larutan SDA, sehingga untuk 5 cawan dibutuhkan 157,15 ml larutan SDA.
4) SDA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan dingin, kemudian dibungkus dengan kertas.
5) Media SDA disterilkan dengan autoclave pada suhu 121˚C selama 15menit bersama peralatan lain yang akan digunakan. Kemudian dibuat sumuran pada cawan petri dengan diameter 6mm, untuk masing-masing seri konsentrasi yaitu konsentrasi 60%, 70%, 80%, 90%, 100% dibuat 4 sumuran, untuk kontrol positif dibuat 2 sumuran, untuk kontrol negatif dibuat 2 sumuran.
c. Penanaman Candida albicans pada media.
Beberapa koloni dari sampel klinisCandida abicans diambil menggunakan oshe steril, dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9% sampai mencapai kekeruhan yang ekuivalen dengan 0,5 standart Mc Farland, kemudian diinokulasi sebanyak 0,3 ml ke dalam tiap-tiap media. Suspensi jamur diratakan dengan menggunakan spreader. d. Persiapan preparat obat flukonazol.
Preparat flukonazol yang dipakai adalah diflucan. Satu kapsul diflucan mengandung 50 mg flukonazol.
Perhitungan :
N1 (konsentrasi awal) = 1,5 mg/ml
N2 (konsentrasi akhir/ yang digunakan dalam penelitian) = 25 µg/ml N1.V1 = N2.V2
1,5 mg . 0,05 ml = 25 µg/ml .V2
V2 = 3 mg/ml
Jadi, untuk mendapatkan kadar flukonazol 25 µg, 1,5 mg flukonazol dilarutkan ke dalam 0,05 ml aquades. Kemudian diencerkan kembali sehingga menjadi 3 ml.
e. Pemberian perlakuan.
Plate sumuran diberi seduhan teh hijau (Camellia sinensis L.) dengan konsentrasi yang ditentukan setelah dilakukan uji pendahuluan yaitu konsentrasi 60%, 70%, 80%, 90%, 100% masing-masing untuk 4 sumuran, dan preparat flukonazol untuk 2 sumuran sebagai kontrol positif, serta aquades steril untuk 2 sumuran sebagai kontrol negatif.
f. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 2 hari. g. Pengukuran diameter zona hambatan dalam satuan mm. h. Data dimasukkan dalam tabel.