METODE PENELITIAN 3.1. Desain Penelitian
3.4. Cara Kerja Penelitian
3.4.1. Alat dan Bahan Penelitian a. Tahap Nekropsi
Kapas, minor set surgeon, Zipline plastic bag, papan potong, dan eter untuk anastesi.
b. Tahap Perfusi dan Fiksasi
Alat perfusi menggunakan set infus dengan ukuran jarum 23G, PBS
(Phosphate Buffer Saline) dan Formalin. c. Tahap Dehidrasi
Gelas ukur 1000 ml dan 500 ml, Beaker glass 1000 ml dan 250 ml, corong kaca, aquades, alkohol absolut CH3CH2OH Mallinckrodt Chemicals, dan alkohol 95%.
d. Tahap Paraffinisasi
Incubator dan Paraplast Leica Microsystem.
e. Tahap Clearing dan Embedding
Hotplate stirer (sRS 710 HA), vials stopper tools neck.
f. Tahap Blocking
Cetakan blocking dan Spiritus g. Tahap Pemotongan
Bunsen, mikrotom geser, korek api gas, waterbath, kulkas, beaker glass 200 ml, putih telur, gliserin, dan es batu.
h. Tahap Pewarnaan
Object glass, cover glass, staining jar, mikroskop shimadzu T025A, spatula kaca, timer, Hematoksilin, eosin, xylol, canada balsam, aquadest, H2SO4, alkohol absolut CH3CH2OH, alkohol 95%.
i. Tahap Foto Jaringan
Kotak preparat, kamera preparat, komputer lab, DVD foto, mikroskop
Olympus BX41.
j. Tahap keseluruhan Tissue, tissue berpori.
3.4.2. Adaptasi Hewan Coba1,2
Setelah hewan coba tiba di laboratorium animal house, hewan coba diberikan makan dan minum ad libitum dan ditempatkan dalam kandang yang berisi 3 ekor. Kemudian diamati perilakunya serta diadaptasi selama 14 hari.18
3.4.3. Tahapan Nekropsi (Perfusi) 1,2,4
Siapkan alat dan bahan. Lakukan anastesi menggunakan eter. Keberhasilan anastesi dicek dengan memberikan rangsang nyeri pada kaki atau ekor tikus. Tikus diletakkan pada papan nekropsi dan dilakukan pembedahan pada bagian abdominothorakal. Setelah alat perfusi terpasang, suntikan jarum perfusi di bagian vena kava inferior dan potong vena kava inferior di bagian belakang jarum dengan hati-hati. Larutan perfusi formalin 10% dalam PBS (PBS-Formalin), dialirkan dengan kecepatan 20 ml/menit dan tekanan yang diperoleh dari ketinggian permukaan larutan terhadap vena kava inferior sekitar 72,5 cm. Perhatikan hingga pembuluh darah arteri dan vena intercostalis serta hepar menjadi pucat yang menandakan proses perfusi sudah selesai. Lakukan nekropsi organ-organ yang dibutuhkan (hepar, pankreas, ginjal). Organ dipotong dengan ketebalan 0,5 cm dan direndam kedalam larutan formalin 10%.
3.4.4. Tahapan Pemrosesan Jaringan1,2
3.4.4.1.Dehidrasi1,2
Proses dehidrasi menggunakan alkohol dengan variasi konsentrasi 50%, 70%, 80%, 90%. Pengenceran alkohol dilakukan dengan cara penghitungan sebagai berikut:
1. Pengenceran alkohol 50% = 500 ml alkohol 95% + 450 ml aquades 2. Pengenceran alkohol 70% = 700 ml alkohol 95% + 250 ml aquades 3. Pengenceran alkohol 80% = 800 ml alkohol 95% + 150 ml aquades 4. Pengenceran alkohol 90% = 900 ml alkohol 95% + 50 ml aquades
Setiap konsentrasi larutan alkohol tersebut dimasukkan pada 3 buah pot plastik, masing-masing setinggi 2/3 pot plastik. Setiap pot dengan konsentrasi alkohol yang sama diberi label I, II, III untuk menandakan urutan proses dehidrasi.
Tahap dehidrasi dimulai dengan memasukkan potongan hepar, ginjal dan pankreas ke dalam pot plastik berlabel I, II, lalu III. Potongan organ direndam selama 15 menit secara berurutan ke dalam larutan alkohol 50%, 70%, 80%, 90% dan 95%.
3.4.4.2.Clearing1,2
Tahapan Clearing bertujuan untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan, karena alkohol dan paraffin tidak dapat menyatu, sehingga larutan yang akan dimasukkan ke dalam jaringan dapat berikatan dengan parafin. Pada tahapan ini digunakan larutan toluol:alkohol (1:1) dan toluol murni.
Pertama, potongan organ dimasukan ke dalam larutan toluol:alkohol (1:1) dan direndam selama 25 menit. Kemudian potongan organ tersebut dipindahkan dan direndam kedalam toluol murni selama 60 menit hingga menjadi bening. Perendaman dalam toluol murni diperpanjang sampai potongan menjadi bening. Waktu perendaman dalam toluol murni paling lama selama 120 menit, karena akan menyebabkan pengerasan pada jaringan sehingga sulit untuk dilakukan pemotongan.
3.4.4.3.Embedding1,2
Tahap embedding bertujuan untuk mengeluarkan cairan pada saat proses clearing dan menggantinya dengan paraffin karena cairan saat proses
clearing dapat mengkristal di dalam jaringan dan menyebabkan jaringan mudah robek saat tahap pemotongan.
Pertama, buat larutan toluol : paraffin (50 ml : 50 ml). Kemudian bungkus organ menggunakan tissue berpori lalu rendam dalam larutan tersebut dan diamkan pada suhu ruangan selama 24 jam. Setelah itu cairkan
paraffin dengan suhu diantara 56-62oC dan diberi label I, II, III dan IV. Masukkan potongan organ ke dalam larutan paraffin secara berurutan, masing-masingnya selama 15 menit.
3.4.4.4. Blocking1,2
Tahapan ini merupakan proses pembuatan blok preparat agar organ dapat dipotong dengan mikrotom. Cairkan paraffin lalu tuangkan sedikit ke dalam cetakan blok. Masukan potongan organ secara perlahan dan kemudian tuangkan kembali paraffin hingga merendam organ.
3.4.5. Pemotongan Jaringan1,2
Pemotongan jaringan dilakukan dengan menggunakan mikrotom. Pertama, rekatkan blok paraffin diatas blok kayu dengan cara memanaskan salah satu sisi blok paraffin hingga sedikit mencair kemudian langsung tempelkan. Letakan blok paraffin dan balok kayu tersebut pada holder (pemegang) di mikrotom dan kencangkan. Lakukan pemotongan jaringan ini dengan ketebalan 6 µm. Jika diperlukan sudut kemiringan pisau mikrotom diatur pada sudut 20-30o.
Hasil potongan blok paraffin kemudian di rendam dalam waterbath
dengan suhu air 37-40o C hingga potongan organ terlihat merengang. Kemudian oleskan putih telur yang dicampur dengan gliserin pada kaca objek secara tipis dan merata. Lalu ambil potongan tersebut menggunakan kaca objek ke dalam
waterbath. Letakan kaca objek tersebut pada hotplate dengan suhu 40-45oC hingga kering. Setelah kering dan potongan melekat dengan kuat pada kaca objek, angkat dari hotplate dan potongan siap untuk diwarnai.
3.4.6. Tahapan Pewarnaan HE1,2
Sebelum memulai proses pewarnaan masukkan xylol, alkohol dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, alkohol absolut, alkohol asam, hematoksilin, eosin dan aquades ke dalam staining jar dengan volume ¾ bagian.
Masukkan dan rendam cawan yang berisi preparat kedalam staining jar yang berisi xylol selama 10 menit sebanyak 2 kali. Lalu pindahkan dan rendam cawan ke dalam staining jar berisi alkohol absolut selama 5 menit
sebanyak 2 kali. Pindahkan dan rendam cawan ke dalam staining jar berisi alkohol konsentrasi 90% selama 1 menit.
Pindahkan dan rendam cawan ke dalam staining jar berisi alkohol konsentrasi 80% selama 1 menit. Pindahkan dan rendam cawan ke dalam
staining jar berisi alkohol konsentrasi 70% selama 1 menit. Pindahkan dan rendam cawan ke dalam staining jar berisi aquades selama 4 menit. Pindahkan cawan tersebut dan rendam ke dalam staining jar yang berisi Hematoksilin dengan durasi hepar 4 menit; ginjal 2 menit; pankreas 1 menit. Selama durasi itu dilakukan pengamatan dibawah mikroskop untuk menghindari terjadinya
overstainning hematoksilin. Lakukan perendaman cawan di dalam staining jar
berisi aquades sebanyak 3 kali dengan durasi 1 menit. Pindahkan dan rendam cawan ke dalam staining jar berisi alkohol asam selama 30 detik.
Kemudian pindahkan dan rendam cawan kedalam staining jar yang sudah dialiri air mengalir selama 1 menit. Pindahkan dan rendam cawan ke dalam staining jar berisi Eosin selama 1 menit. Selama durasi itu dilakukan pengamatan dibawah mikroskop untuk menghindari terjadinya overstainning
eosin.
Lakukan pemindahan dan perendaman cawan di dalam staining jar
berisi aquades sebanyak 3 kali dengan durasi 1 menit. Pindahkan secara berurutan dan rendam cawan ke dalam staining jar yang berisi alkohol dengan konsetrasi meningkat dari 70% sampai alkohol absolut selama 1 menit dan xylol sebanyak 2 kali 3 menit.
Teteskan dan ratakan canada balsam secukupnya di atas preparat dan ditutup dengan cover glass. Amati di bawah mikroskop dan jangan biarkan ada gelembung udara pada preparat. Berikan nama organ/kode organ serta tanggal pembuatan. Tunggu hingga kering. Preparat siap disimpan.
3.4.7. Foto Jaringan1,2
Preparat diamati dan difoto dengan menggunakan mikroskop Olympus BX41 dan software Olympus DP2-BSW yang dimulai dari perbesaran 4x, 10x, 20x, dan 40x.