METODE PRAKTIKUM A. Alat dan Bahan
B. Cara Pengerjaan Sampel 1. Penyiapan Sampel
Diucapkan basmalah. Diambil sampel berupa daun Ganjeng. Di cuci bersih daun Ganjeng, kemudian dipotong-potong kecil. Di keringkan dengan cara diangin-anginkan pada tempat yang tidak terkena sinar matahari langsung, kemudian disortasi kering.
2. Pembuatan Herbarium
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Dicuci herba di bawah air yang mengalir, agar kotoran yang melekat pada daun benar-benar hilang. Dikeringkan herba, yang tidak terkena oleh cahaya matahari, agar kandungannya yang ada disampel tidak rusak. Dioleskan dengan alkohol 70%, agar
sampel tidak ditumbuhi mikroba. Ditempelkan herba pada sasak dengan menggunakan selotip bebas asam dan ditutup sasak.
3. Ekstraksi a. Maserasi
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Dipotong kecil-kecil sampel daun Ganjeng. Ditimbang sampel sebanyank 150 gram. Kemudian dimasukkan 150 gram sampel ke dalam toples. Dibasahi sampel menggunakan larutan metanol. Ditambahkan pelarut metanol ke dalam toples hingga melewati sampel (sampel terendam). Ditutup toples menggunakan aluminium foil kemudian ditutup rapat dengan penutup toples. Dibiarkan sampel terendam selama ± 24 jam. Dilakukan proses penyarian setelah ± 24 jam menggunakan kain putih dan corong yang telah disumbat kapas. Dilakukan proses remaserasi sampel yang telah disaring tadi. Ditampung hasil maserasi.
4. Sokletasi
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang sampel daun Ganjeng sebanyak 50 gram. Dimasukkan sampel ke dalam labu alas bulat. Ditambahkan 500 ml metanol ke dalam labu alas bulat. Dirangkai alat sokletasi. Dimulai penyarian 20-24 siklus. Ditampung hasil ekstrak daun Ganjeng
5. Refluks
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang sampel daun Ganjeng 50 gram. Dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Ditambahkan 500 ml metanol ke dalam labu alas bulat. Dirangkai alat refluks. Dimulai penyarian dan ditunggu hingga 3-4 jam. Disaring hingga didapatkan ekstrak cair dan ampasnya.
6. Partisi a. Partisi Cair-Cair
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang ekstrak metanol daun Ganjeng sebanyak 2 gram. Dilarutkan ekstrak dengan 30 ml hexan dan dimasukkan ke dalam corong pisah. Disuspensikan ekstrak yang tidak larut dengan 10 ml air dan dimasukkan ke dalam corong pisah. Digojog corong pisah hingga homogen dan didiamkan beberapa saat hingga terbentuk dua lapisan pelarut. Dipipet lapisan n-hexan kemudian ditampung dalam wadah yang disaring terlebih dahulu menggunakan corong dan kertas saring. Ditambahkan kembali 30 ml n-hexan ke dalam corong pisah lalu digojog hingga terbentuk lagi dua lapisan pelarut. Dilakukan penggantian pelarut n-hexan sebanyak 5 kali. Diuapkan lapisan n-hexan yang diperoleh. Ditambahkan pelarut n-butanol jenuh air pada lapisan air dalam corong pisah sebanyak 10 ml kemudian digojok. Didiamkan corong pisah hingga terbentuk dua lapisan. Ditampung lapisan n-butanol jenuh air lalu disaring. Ditambahkan kembali pelarut n-butanol jenuh air dan penggantian pelarut n-butanol dilakukan pula sebanyak 5 kali. Diuapkan lapisan n-butanol jenuh air hingga kental. Ditimbang masing-masing ekstrak n-hexan dan n-butanol jenuh air. Dilakukan identifikasi senyawa dengan menggunakan teknik KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
b. Partisi Cair-Padat
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang ekstrak metanol sebanyak 2,067 gram. Dimasukkan ekstrak ke dalam lumpang kemudian dilarutkan dengan n-heksan sebanyak 15 ml dan digerus. Dimasukkan ke dalam 6 tabung sentrifuge yang telah disamaratakan tingginya. Disentrifuge hasil gerusan dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Dipisahkan antara ekstrak larut n-hexan dan tidak larut n-hexan. Dilakukan terus-menerus hingga
larutan n-hexan dalam tabung jernih. Digunakan larutan n-hexan sebanyak 1000 ml atau 1 liter dengan 10 siklus. Dihitung rendamen yang didapatkan.
7. Kromatografi Lapis Tipis a. Pengaktifan Lempeng silika
Disiapkan lempeng. Diukur batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm. Dimasukkan dalam oven hingga melengkung.
b. Penjenuhan chamber
Dimasukkan pelarut metanol dan etil 2:1 dan sebagainya. Digoyang-goyangkan chamber. Dimasukkan potongan kertas saring hingga mencapai tutup chamber. Ditandai chamber jenuh yang terelusi dengan pelarut pada kertas saring. c. Penyiapan sampel
Disiapkan alat dan bahan. Disiapkan sampel yang akan ditotol ke dalam 3 buah vial, vial pertama (ekstrak larut hexan), vial ke 2 (ekstrak tidak larut n-hexan), dan vial 3 (ekstrak larut metanol). Dilarutkan ekstrak n-hexan pada vial dengan n-hexan secukupnya hingga tidak terlalu pekat, kemudian ditutup dengan aluminium foil. Dilarutkan ekstrak tidak larut hexan dengan kloroform secukupnya hingga tidak terlihat pekat kemudian ditutup dengan aluminium foil. Dilarutkan ekstrak metanol pada vial 3 dengan metanol secukupnya hingga tidak terlihat pekat kemudian ditutup dengan aluminium foil. Divorteks ketiga vial hingga homogen. d. Pengujian Kromatografi Lapis Tipis
Diambil chamber yang akan digunakan. Diukur eluen hexan:etil dengan perbandingan 3:1. Dimasukkan eluen hexan:etil 3:1 ke dalam chamber secara bersamaan. Digerak-gerakkan chamber kemudian didiamkan hingga jenuh. Diambil sejumlah kecil sampel dalam vial lalu ditotol pada lempeng berbeda dan diangin-anginkan. Dimasukkan lempeng yang telah ditotol ke dalam chamber kemudian chamber ditutup. Diamati pergerakan noda tinggi eluen terelusi hingga batas atas
lempeng. Diamati dilampu UV 366 nm dan lampu UV 254 nm. Apabila tidak terdapat noda yang diinginkan maka lempeng disemprot dengan H2SO4 10% dan dipanaskan hingga noda menjadi bercak kehitaman. Dilakukan pengujian berulang dengan perbandingan pelarut berbeda sampai profil KLT ditemukan.
8. BSLT (Brine Shirmp Lethality Test) a. Pembuatan air bebas protozoa
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang garam tidak beriodium kira-kira 37 gram. Diukur aquadest 1000 ml (1 liter). Dilarutkan 38 gram NaCl (garam) tidak beriodium dalam 1 liter air. Diaduk kemudian disaring. Dimasukkan ke dalam toples kemudian ditutup.
b. Penyiapan larutan stok
Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang ekstrak metanol, ekstrak larut n-hexan, dan ekstrak tidak larut n-hexan masing-masing sebanyak 30 mg. Ditambahkan 3 ml pelarut metanol ke dalam ekstrak metanol, 3 ml pelarut n-hexan ke dalam ekstrak larut n-hexan dan 3 ml pelarut n-butanol untuk ekstrak yang tidak larut n-hexan. Ditutup setiap ekstrak yang telah ditambahkan pelarut.
c. Penyiapan sampel ekstrak
Dicuci vial sebanyak 80. Ditarer setiap vial dengan 5 ml air. Dimasukkan ekstrak metanol dengan konsentrasi 10 ppm ke dalam 5 vial, 100 ppm ke dalam 5 vial dan 1000 ppm ke dalam 5 vial. Dimasukkan ekstrak larut n-hexan dengan konsentrasi 10 ppm ke dalam 5 vial, 100 ppm ke dalam 5 vial dan 1000 ppm ke dalam 5 vial. Dimasukkan ekstrak tidak larut n-hexan dengan konsentrasi 10 ppm ke dalam 5 vial, 100 ppm ke dalam 5 vial dan 1000 ppm ke dalam 5 vial . Dimasukkan kontrol pelarut metanol, n-hexan dan n-butanol ke dalam 5 vial yang berbeda masing-masing sebagai pembanding. Dimasukkan kontrol air laut ke dalam 5 vial sebagai pembanding. Dibiarkan selama 24 jam hingga pelarutnya menguap.
d. Uji BSLT
Dimasukkan 10 ekor larva udang (Artemia salina L.) ke dalam vial dan dicukupkan dengan air laut sampai 5 ml. Ditambahkan 1 tetes suspensi ragi (9 mg/5 ml) ke dalam vial. Dihitung jumlah larva yang mati setelah 1x24 jam.
e. Penyiapan larutan uji
Ditetaskan larva udang dalam wadah penetas berbentuk kerucut berisi air laut yang dilengkapi dengan lampu sebagai sumber cahaya dan aerator sebagai sumber O2. Dibiarkan selama 1x24 jam. Dipindahkan ke dalam wadah gelap yang disisinya merupakan wadah terang. Ditandai larva uji yang baik dengan larva yang berada pada wadah yang terang.
9. Kromatografi Kolom (KK) dan Kromatografi Cair Vakum (KCV) a. Kromatografi Kolom
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Dibebas lemakkan dengan dibilas menggunakan metanol. Dimasukkan kapas pada bagian bawah dari kolom. Dimasukkan silika gel sampai mengisi ¾ dari kolom lalu ketuk-ketuk hingga tidak terbentuk gelembung gas. Dikeluarkan silika dan ditimbang. Ditimbang sampel dengan perbandingan 1:100 sampel dan silika . Disuspensikan silika gel dan ekstrak dengan eluen pertama. Dimasukkan ke kolom lalu mampatkan. Dimasukkan selapis kertas saring di bagian atas. Ditampung isolat dalam vial dengan kecepatan alir 20 tetes per menit. Ditotolkan pada lempeng. Dilihat penampakan noda pada lampu UV 254 nm dan 366 nm. Digabung sampel dengan profil KLT yang sama lalu hitung nilai Rf nya.
b. Kromatografi Cair Vakum
Diucapkan basmalah. Disiapkan alat dan bahan. Ditimbang 7 gram serbuk silika dan 1,5 ekstrak larut n-hexan lalu digerus dilumpang hingga homogen. Dimasukkan serbuk silika gel dan ekstrak larut n-heksan yang telah dihomogenkan
ke dalam senter glass lalu dimampatkan. Diletakkan kertas sering diatasnya. Difraksinasi sampel dengan kromotografi cair vakum menggunakan eluen n-hexan, etil, dan metanol dengan berbagai perbandingan yang telah diketahui. Dimasukkan eluen n-hexan 60 ml, hexan:etil, dan etil:metanol masing-masing perbandingan ke dalam senter gelas lalu hasil fraksinasinya ditampung dalam wadah yang telah disiapkan. Diuapkan hasil fraksi hingga diperoleh ekstrak kental. Difraksinasi masing-masing ekstrak yang diperoleh dari berbagai perbandingan eluen saat dimasukkan ke dalam vial lalu diencerkan dengan pelarut kloroform:metanol. Ditotol ekstrak yang telah larut pada lempeng kemudian dielusi dengan eluen hexan:etil dengan perbandinga 3:1. Dilihat penampakan noda pada lempeng di bawah UV 254 nm dan 366 nm. Digabungkan sampel yang mempunyai profil KLT yang sama hingga diperoleh 2 fraksi (fraksi A dan fraksi B). Diuapkan pelarut fraksi yang diperoleh kemudian ditimbang. Dimasukkan masing-masing fraksi ke dalam vial secukupnya lalu dilarutkan dengan kloroform:metanol. Ditotol masing-masing fraksi pada lempeng kemudian dielusi. Fraksi A dielusi dengan hexan:etil (3:1) dan fraksi B dielusi dengan eluen etil:metanol (7:1). Dilihat penampakan noda fraksi A dan fraksi B di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm.
10. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif a. Pembuatan lempeng
Dibaca basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang serbuk silika sebanyak 20 gram. Diukur 50 ml aquadest. Dihomogenkan serbuk silika dan aquadest ke dalam erlenmeyer hingga terbentuk bubur silika. Dituang bubur silika di atas lempeng kaca berukuran 20cm x 20cm dan diratakan. Didiamkan lempeng 1x24 jam. Diaktifkan lempeng dalam oven dengan suhu 1100 C selama 1-2 jam.
b. Penotolan sampel
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Dilarutkan ekstrak fraksi A dalam vial dengan pelarut kloroform:metanol (1:1). Ditotolkan ekstrak yang larut pada lempeng preparatif yang telah diaktifkan menggunakan pipa kapiler. Diukur eluen hexan:etil (3:1) masing-masing 45 ml dan 15 ml lalu dimasukkan ke dalam chamber lalu dijenuhkan. Setelah chamber jenuh, lempeng preparatif yang telah ditotol dimasukkan ke dalam chamber kemudian chamber ditutup dan ditunggu hingga proses elusi selesai. Setelah proses elusi selesai, lempeng dikeluarkan dari chamber lalu diangin-anginkan hingga eluennya menguap. Dilihat penampakan noda yang berbentuk pita pada UV 366 nm dan 254 nm. Diberi tanda noda yang berbentuk pita lalu dikeruk. Diperoleh 2 noda kemudian masing-masing noda di masukkan ke dalam 2 mangkok berbeda yang telah ditimbang dan diberi tanda noda 1 dan noda 2. Ditambahkan masing-masing noda dengan kloroform:metanol (1:1) sebanyak 10 ml, lalu dihomogenkan kemudian dipipet ke dalam tabung sentrifuge. Disentrifuge sampel dengan kecepatan 2500 rpm dalam waktu 5 menit. Setelah disentrifuge diperoleh dua lapisan yaitu cairan yang bening dan endapan. Dipipet cairan yang bening dari masing-masing noda ke dalam 2 vial yang berbeda yang telah ditimbang.
11. Multieluen dan dua dimensi a. Multieluen
1) Pengaktifan lempeng
Dibaca basmalah. Diambil lempeng yang akan digunakan yaitu lempeng silika gel F 254 yang berukuran 20cm x 20cm, dipotong dengan ukuran 7cm x 2cm. diaktifkan dalam oven pada suhu 1100C selama 30-60 detik. Setelah diaktifkan lempeng diukur batas atas dan batas bawahnya.
2) Penotolan sampel
Dibaca basmalah. Disiapkan alat dan bahan. Disiapkan 2 noda hasil kromatografi lapis tipis preparatif yang akan ditotol pada lempeng silika gel yaitu noda 1 dan noda 2. Ditotol masing-masing noda pada lempeng silika gel yang telah diaktifkan. Disiapkan eluen yaitu hexan:etil (5:1), kloroform:etil (1:1), dan etil:methanol (1:5). Dielusi masing-masing noda dengan eluen yang telah disiapkan. Kemudian diamati penampakan noda masing-masing di bawah lampu UV 366 nm. b. Dua dimensi
1) Pengaktifan lempeng
Dibaca basmalah. Diambil lempeng yang akan digunakan yaitu lempeng silika gel F 254 yang berukuran 20cm x 20cm, dipotong dengan ukuran 7cm x 2cm. diaktifkan dalam oven pada suhu 1100C selama 30-60 detik. Setelah diaktifkan lempeng diukur batas atas dan batas bawahnya.
2) Penotolan sampel
Dibaca basmalah. Disiapkan alat dan bahan yng akan digunakan. Ditotol kristal murni yang telah diperoleh pada lempeng KLT. Dielusi dengan menggunakan dua cairan pengelusi. Sebagai cairan pengelusi yang pertama adalah eluen n-heksan : etil asetat dan cairan pengelusi kedua adalah eluen benzene:etil asetat. Untuk proses elusi yang pertama dilakukan dengan cara menotolkan filtrat yang telah dilarutkan dengan pelarut yang cocok pada lempeng kemudian dielusi, selanjutnya proses elusi yang kedua dilakukan dengan cara memutar lempeng berlawanan arah jarum jam sehingga hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian untuk proses elusi yang kedua. Setelah proses elusi selesai, diamati penampakan noda pada lampu UV 366 nm.
12. Identifikasi Golongan Senyawa a. Pengaktifan Lempeng
Dibaca basmalah. Diambil lempeng yang akan digunakan yaitu lempeng silika gel F 254 yang berukuran 20cm x 20cm, dipotong dengan ukuran 7cm x 2cm. diaktifkan dalam oven pada suhu 1100C selama 30-60 detik. Setelah diaktifkan lempeng diukur batas atas dan batas bawahnya.
b. Uji Identifikasi Golongan Senyawa
Dibaca basmalah. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditotol noda 1 dan 2 pada lempeng silika gel sebanyak 12 totolan. Noda 1, 6 totolan dan noda kedua juga 6 totolan. Di masukkan eluen hexan : etil ke dalam chamber secara bersamaan, kemudian chamber dijenuhkan. Setelah jenuh, dimasukkan lempeng yang telah ditotol ke dalam chamber. Ditunggu hingga proses elusi selesai. Setelah proses elusi selesai, diamati lempeng di bawah lampu UV 366 nm. Setelah tampak noda yang diinginkan, lempeng kemudian dipotong-potong hingga menjadi 12 bagian yang terdiri atas 6 bagian noda pertama dan 6 bagian noda kedua. Setelah dipotong-potong, setiap lempeng disemprot atau ditetesi sejumlah pereaksi. Perekasi yang digunakan disini yaitu pereaksi Dragondorff untuk mengidentifikasi senyawa golongan alkaloid, perekasi Lieberman-Burchard untuk mengidentifikasi senyawa golongan steroid, pereaksi AlCl3 untuk mengidentifikasi senyawa golongan flavonoid, pereaksi FeCl3 untuk mengidentifikasi senyawa golongan fenol dan pereaksi KOH etanolik untuk mengidentifikasi senyawa golongan kumarin. Setelah disemprot dengan beberapa pereaksi tersebut, lempeng kemudian didiamkan. Hasil positif untuk senyawa golongan alkaloid ditandai dengan warna jingga dengan latar belakang kuning. Hasil positif untuk senyawa golongan steroid, setelah kromatogram dipanaskan dan diamati pada lampu UV 366 nm, ditandai dengan munculnya noda berflouresensi coklat atau biru, menunjukkan adanya triterpen, sedangkan warna
hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid. Hasil positif untuk senyawa golongan flavonoid ditandai dengan adanya noda berflouresensi kuning pada saat diamati pada lampu UV 366 nm. Hasil positif untuk senyawa golongan fenol, ditandai dengan adanya warna biru atau hitam. Hasil positif untuk senyawa golongan kumarin ditandai dengan adanya warna merah.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN