METODE PENELITIAN
3.4. Cara Pengujian Residu Antibiotika
Pengujian antibiotika dilakukan dengan metode biologik yaitu, metode
Bio-Assay/Screening test menggunakan spora bakteri Bacillus calidolactis,
Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Micrococcus luteus. Laboratorium Kesmavet
Bambu Apus DKI Jakarta menggunakan metode ini untuk pengujian residu antibiotika pada produk ternak seperti, daging, susu dan telur. Metode ini diadopsi dari beberapa literatur dengan beberapa modifikasi.
27 3.4.1. Golongan Penisilin
Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Bacillus calidolactis ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 550 C selama 2 (dua) minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan aquabides steril 20 ml, sebanyak 4 tabung sentrifuge, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 650C selama 30 menit. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit buang supernatan (lapisan atasnya).
Kedalam endapan tambahkan aquabides secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 40C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 650C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 5 gr tryptone, 12 gr yeast extract, 1 gr dextrose dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer)
Sebanyak 13,3 gr KH2PO4 dan 6,2 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
3.4.2. Golongan Tetrasiklin Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Bacillus cereus ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 300 C selama 1 (satu) minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml, sebanyak 4 tabung sentrifus, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 650C
selama 18-24 jam. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit buang supernatan (lapisan atasnya).
Kedalam endapan tambahkan NaCl fisiologis secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 40C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 650C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 6 gr peptone, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract, 1,35 gr KH2PO4, dan 15-16 bacto agar dalam 1000 ml aquadest, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer)
Sebanyak 3,5 gr KH2PO4 dan 3 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
3.4.3. Golongan Makrolida Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Micrococcus luteus ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 360 C selama 18-24 jam. Kemudian diambil 1 ose kuman biakan Micrococcus luteus ke dalam 10 ml media Heart Infusion Broth (HIB). Selanjutnya diinkubasikan selama 18-24 jam dalam inkubator suhu 360C. Kuman siap digunakan untuk pengujian.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 6 gr peptone, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract, 1 gr D(+)glukosa dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan
29 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer)
Sebanyak 7 gr KH2PO4 dan 6 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.4.4. Golongan Aminoglikosida Pembuatan Spora Bakteri Uji
Bakteri Bacillus subtilis ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 360 C selama 1 (satu) minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan aquabides 20ml, sebanyak 4 tabung sentrifuge, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 650C selama 30 menit. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit dibuang supernatan (lapisan atasnya).
Kedalam endapan tambahkan aquabides secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 40C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 650C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora.
Pembuatan Kultur Media Uji
Sebanyak 5 gr peptone, 3 gr beef extract, 3 gr yeast extract, dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada pH 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer)
Sebanyak 6,4 gr KH2PO4 dan 18,9 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.4.5. Kalibrasi Spora/Kuman
Media di panaskan dan simpan di dalam waterbath pada suhu 550C. Kemudian di ambil sebanyak 100 ml, tambahkan spora yang akan diuji dan di kocok hingga larutan media dan kuman tercampur rata. Di pipet kultur media masing-masing sebanyak 8 ml (dilakukan 3 kali pengulangan) dan dibiarkan memadat. Kertas cakram (paper disk) diletakkan diatas permukaan kultur media dan ditetesi dengan larutan baku standar antibiotika. Sebelum diinkubasikan spora dibiarkan pada suhu kamar selama 1 jam. Inkubasikan di dalam inkubator dengan suhu sesuai dengan spora yang diuji, selama 18-24 jam. Hasil ditentukan dengan mengukur diameter daerah hambatan dengan menggunakan jangka sorong/kaliper
3.4.6. Penghitungan Spora Bakteri
Dari contoh suspensi diatas dibuat pengenceran berseri sampai dengan 10-8 , setiap konsentrasi pengenceran ditu ang ke dalam cawan petri masing-masing 1 ml (dilakukan 2 kali pengulangan), kemudian di tambahkan media agar sebanyak 15-20 ml dan digoyang hingga merata dan ditunggu sampai memadat. Selanjutnya cawan petri di inkubasi selama 18-24 jam pada masing-masing temperatur tergantung jenis sporanya dan tiap cawan petri di hitung dan koloni yang di hitung jumlahnya antara 25-250.
Gambar 2. Bagan Penghitungan Spora
1 ml SPORA 100 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml
31
Masing-masing cawan petri diisi dengan 15-20 ml media agar dan 1 ml spora.
3.4.7. Cara Menyatakan Hasil
Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua dibelakang koma. Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua.
Tabel 3. Standar Penghitungan Cawan
Jumlah Koloni Per Pengenceran
Standar
Penghitungan Cawan Keterangan
10-1 10-2 10-3
200 23 1 20 x 10-4 23 dan 1 < 25
700 125 10 1,3 x 10-5 700>250 ; 10<25
Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 25 dan 250, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil dari atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil.
Tabel 4. Standar Penghitungan Cawan
Jumlah Koloni Per Pengenceran Standar Penghitungan Cawan Keterangan 10-2 10-3 10-4 250 41 4 4,1 x 10-4 Hitung rata-rata : 41000\25000=1,64 (<2) 140 32 2 1,4 x 10-4 Hitung rata-rata : 32000\14000=2,3 (>2)
3.4.8.Pembuatan Larutan Standar Kerja
Penisilin
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Penisilin dengan larutan dapar sampai konsentrasi 0,1 µg/ml.
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 100 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 0,1 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 0,01 µg/ml (sebagai larutan standar kerja)
Tetrasiklin
33
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1 µg/ml (sebagai larutan standar kerja)
Aminoglikosida
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Aminogliksida dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µg/ml.
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Makrolida
Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Makrolida dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µg/ml.
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 100 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 10 µg/ml
Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar
Konsentrasi menjadi 1 µg/ml (sebagai larutan standar kerja)
3.4.9. Pengujian Sampel
Sebanyak 10 gram contoh masing-masing sampel (daging paha, sayap, dada, hati, ginjal dan kaki bagian metatarsal) dimasukkan kedalam tabung sentrifuge, ditambahkan 20 ml larutan dapar dihomogenkan, kemudian di sentrifuge 3000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan larutan supernatannya. Sementara itu kultur media agar disiapkan untuk masing-masing kelompok antibiotika. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan di atas permukaan kultur media.
Tiap cawan petri berisi 5 buah kertas cakram, 4 buah kertas cakram ditetesi dengan mikro pipet steril berisi larutan sampel dan 1 buah kertas cakram ditetesi dengan larutan standar antibiotika. Selanjutnya kultur media diinkubasikan pada suhu 300 C untuk golongan tetrasiklin 300C, untuk golongan makrolida dan aminoglikosida pada suhu 360C sedangkan penisilin pada suhu 550C
35
pengulangan. Setelah itu hasil uji ditentukan dengan menggunakan jangka sorong/kaliper. Sampel yang terbentuk zona hambatan diplotkan pada kertas semi logaritma kurva standar masing-masing antibiotika.
3.4.10. Pengukuran Hasil
Diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong (kaliper). Sampel dinyatakan positif mengandung antibiotik apabila zona hambat yang terbentuk ≥ 2 mm dari tepi kertas cakram. Sampel dinyatakan negatif apabila zona hambat yang terbentuk 0 – 2 mm. Karena zona hambat yang terbentuk < 2 mm dianggap akibat adanya natural inhibitor. Kontrol positif harus membentuk zona hambat 15 – 30 mm, sedangkan kontrol negatif harus tidak membentuk zona hambat.
3.4.11. Pembuatan Standar Kurva Antibiotika
Kultur media disiapkan untuk masing-masing antibiotika. Kemudian di encerkan larutan stock solution standar untuk masing-masing standar antibiotika dengan komposisi konsentrasi bervariasi. Variasi konsentrasi untuk antibiotika oksitetrasiklina, aminoglikosida dan makrolida adalah 0,25 ; 0,5 ; 1,0 ; 2,0 dan 4,0. Sedangkan variasi konsentrasi untuk antibiotika penisilina adalah 0,01 ; 0,1 ; 0,25 dan 1 µg/ ml. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan diatas permukaan kultur media. Tiap cawan petri berisi 4 buah kertas cakram Sebelum di inkubasi, kultur media dibiarkan pada suhu kamar selama 30-60 menit. Inkubasikan di dalam inkubator, untuk oksitetrasiklin pada suhu 300C, makrolida dan tilosin pada suhu 360C dan penisilin pada suhu 550C, masing-masing selama 18-24 jam. Hasil uji ditentukan dengan menggunakan jangka sorong/kaliper dan dikonfirmasi pada kurva standar masing-masing anti biotika.
0.25 0 0 1.55 0.99 0.79 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Zo n a