ABSTRAK
Pustaka cDNA yang mengandung transkrip yang diekspresikan dalam kondisi tertentu merupakan material awal dalam berba gai studi biologi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi pustaka cDNA dari daun tanaman karet sebagai upaya penyediaan material genetik asal daun karet yang akan digunakan dalam studi ekspresi gen. Sebagai sumber RNA adalah daun karet klon AVROS 2037 yaitu salah satu klon karet resisten terhadap cendawan Corynespora cassiicola. RNA diisolasi dari daun setelah daun tersebut diinokulasi selama tiga hari dengan konidia C. cassiicola. Dari RNA total yang diperoleh dilakukan pemurnian mRNA, sintesis cDNA, ligasi fragmen cDNA utas ganda dengan vektor kloning serta introduksi hasil ligasi ke bakteri Escherichia coli DH5α
kompeten. Dari setiap gram jaringan daun berhasil diisolasi RNA sekitar 300 µg, dan dari jumlah tersebut sekitar 0,25% mRNA dapat dimurnikan. Sintesis cDNA dilaksanakan dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan (template), dan ligasi cDNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi SfiI ke vektor pGEM-T Easy yang dimodifikasi dengan menyisipkan situs enzim restriksi yang sama, telah berhasil dilakukan. Introduksi vektor rekombinan tersebut pada sel bakteri E. coli
DH5α kompeten, telah menghasilkan pustaka yang mengandung 8.000 klon cDNA. PCR koloni yang dilakukan secara acak terhadap 250 koloni mengindikasikan bahwa sekitar 93% koloni tersebut membawa cDNA sisipan dengan ukuran fragmen cDNA yang menyisip berkisar antara 300 sampai 1.200 bp. cDNA sisipan terbanyak terdapat pada ukuran antara 500 – 800 bp. Dalam tulisan ini dibahas tahap demi tahap proses yang dilakukan untuk membuat pustaka cDNA asal daun karet klon AVROS 2037 serta beberapa modifikasi yang diperlukan untuk mendapatkan hasil yang optimal.
Kata kunci: Hevea brasiliensis, pustaka cDNA, klon AVROS 2037, penyakit gugur daun, Corynespora cassiicola.
PENDAHULUAN
Identifikas i gen yang diekspresikan pada tahap perkembangan atau kondisi tertentu suatu tanaman serta pengujian pola ekspresinya merupakan tahapan penting untuk mendapatkan informasi tentang fungsi gen, baik yang berhubungan dengan proses diferensiasi, perubahan morfologi dan metabolisme serta respon
terhadap infeksi patogen. Salah satu cara yang dapat ditempuh untuk mengidentifikasi gen atau bagiannya adalah melalui penapisan (screening) terhadap pustaka cDNA (complementary DNA) yaitu suatu pustaka yang merepresenta sikan gen-gen yang diekspresikan dalam suatu jaringan, waktu, atau kondisi tertentu. Pustaka cDNA diperoleh melalui proses kloning sehingga ratusan gen berbeda dimungkinkan untuk dikoleksi dan diperbanyak secara terus menerus. Identifikasi cDNA spesifik dilakukan me lalui proses hibridisasi (Cowel 1998; Glick dan Pasternak 1994; Kleinsmith dan Kish 1995) ataupun melalui proses amplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk gen tertentu.
Dalam konstruksi pustaka cDNA, DNA polimerase yang memerlukan RNA (RNA-dependent DNA polymerase) yakni reverse transcriptase (RT) digunakan untuk meng-copy messenger RNA (mRNA) menjadi molekul cDNA utas ganda. Berbeda dengan mRNA yang dengan mudah terdegradasi dan menggambarkan proses transkripsi dari gen-gen yang aktif pada suatu jaringan atau sel tertentu, cDNA merupakan molekul yang lebih stabil sehingga sesuai untuk disisipkan ke dalam vektor kloning, baik berupa plasmid, cosmid, atau bakteriofage. Populasi mRNA yang telah di copy menjadi cDNA apabila diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang bersifat permanen. Keuntungan pustaka cDNA adalah hanya mengandung sekuen yang terekspresi dalam bentuk mRNA dalam suatu kondisi atau waktu tertentu (Kleinsmith dan Kish 1995).
Pada tahun 1980-an, penyakit gugur daun tanaman karet (Hevea brasiliensis) yang disebabkan oleh Corynespora cassiicola yaitu suatu cendawan patogen, telah menimbulkan kerugian besar pada pertanaman karet komersil di Indonesia (Soepena 1983; Sinulingga et al. 1996). Kerugian terjadi terutama disebabkan oleh penanaman klon karet yang sangat rentan terhadap serangan patogen, seperti klon RRIC 103 dan klon seri PPN. Klon tersebut merupakan klon dengan produksi tinggi sehingga mulai banyak ditanam di perkebunan karet komersil. Akibatnya ratusan hektar tanaman karet dibongkar dan dimusnahkan untuk menjaga agar sebaran penyakit tidak meluas. Belakangan ini dari survei di berbagai sentra perkebunan karet di Sumatera dan Kalimantan dilaporkan bahwa patogen tersebut terdapat hampir di sebagian besar area l perkebunan karet dengan tingkat keparahan penyakit yang berbeda ( Situmorang, 2002).
Cendawan C. cassiicola mempunyai kemampuan menyerang daun karet muda maupun daun karet tua, terutama di sepanjang tulang daun (Chee 1988). Dari penelitian terdahulu telah diketahui bahwa gejala awal yang teramati secara visual sebagai tanda bahwa patogen telah menginfeksi daun karet dapat dilihat pada hari kedua setelah daun diinokulasi dengan konidia C. cassiicola. Berbeda dengan klon rentan dimana gejala meluas dan akhirnya menyebabkan daun nekrosis, pada klon resisten tidak terjadi perkembangan gejala lebih lanjut pada hari-hari berikutnya. Keberhasilan cendawan menginfeksi tanaman merupakan hasil dari suatu interaksi yang bersifat sangat komplek antara tanaman inang dan patogennya. Saat terjadi kontak dengan tanaman, patogen mengaktifkan mekanisme untuk melakukan penetrasi ke jaringan tanaman. Pada kebanyakan cendawan patogen, perkecambahan konidia dan kemudian diferensiasinya menjadi apresoria, yaitu suatu struktur yang berfungsi untuk melakukan penetrasi ke jaringan tanaman, memerlukan sinyal fisik ataupun kimia dari tanaman inang (Emmett dan Parbery 1975). Namun respon tanaman selanjutnya sangat ditentukan oleh latar belakang genetik masing-masing tanaman.
Respon terhadap infeksi patogen biasanya terjadi dengan cara mengaktifkan sistem pertahanan tanaman untuk melawan infeksi patogen (Lamb
et al. 1989). Hal ini dicapai melalui aktivasi dan ekspresi sejumlah gen yang diyakini memiliki peran dalam sistem pertahanan (Collinge dan Slusarenki 1987; Dixon dan Harrison 1990). Secara umum diketahui bahwa tanaman menggunakan mekanisme konstitutif dan indusibel (aktif) untuk mencegah terjadinya kolonisasi patogen (Kombrink et al. 1993). Mekanisme konstitutif melibatkan pembatas struktural seperti pembentukan papila, deposisi kalose, atau melalui peningkatan kandungan lignin pada dinding sel. Mekanisme indusibel melibatkan respon hipersensitif, akumulasi fitoaleksin, sintesis dan deposisi senyawa fenolik dan protein pada dinding sel, sintesis protein PR (pathogenesis- related protein), serta sintesis enzim hidrolitik seperti 1,3-β-glucanase dan
kitinase. Di samping itu, respon pertahanan tanaman tidak hanya diaktifkan oleh infeksi patogen, tetapi juga dapat dipicu oleh stimulus eksternal seperti elisitor, bahan kimia, pelukaan atau sinar UV. Respon terhadap stimulus eksternal tersebut juga dikontrol melalui aktivasi sinyal internal.
Pada jaringan tanaman, perubahan ekspresi gen telah terjadi mulai dari saat invasi patogen. Ge n-gen tanaman yang secara spesifik terinduksi atau meningkat ekspresinya selama terjadi interaksi dengan patogen diduga merupakan gen yang diperlukan oleh tanaman untuk respon pertahanannya . Pada tahap ini analisis molekuler akan menghasilkan suatu informasi berharga tentang jenis gen serta proses metabolik yang diaktifkan pada level transkripsi gen selama terjadinya interaksi antara inang dan patogen.
Untuk mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam mekanisme pertahanan serta untuk mengetahui jalur yang terlibat dalam resistensi tanaman karet terhadap infeksi C. cassiicola, diperlukan ketersediaan pustaka cDNA sebagai sumber gen tanaman karet. Identifikasi transkrip/gen atau bagian gen target dilakukan melalui skrining terhadap pustaka cDNA dengan menggunakan pelacak (probe), baik yang bersifat homologus ataupun heterologus.
Penelitian ini bertujuan untuk me ngkonstruksi pustaka cDNA dari daun tanaman karet sebagai upaya penyediaan material genetik asal daun karet tersebut.
BAHAN DAN METODE
Bahan tanam dan isolat C. cassiicola
Klon karet resisten AVROS 2037 pada stadia dua unit daun yang ditanam dalam polibeg dan dipelihara di rumah kaca digunakan sebagai bahan tanam, dimana daunnya digunakan sebagai sumber RNA. Sedangkan sebagai cendawan patogen adalah isolat C. cassiicola cGT1 SS virulen yang diperoleh dari Balai Penelitian Karet (BPK) Sembawa. Konidia dari isolat tersebut diproduksi berdasarkan metode Situmorang (2002).
Perlakuan tanaman
Daun karet yang akan digunakan sebagai sumber RNA ditandai pada tanaman, pada saat daun mulai muncul. Inokulasi dilakukan pada daun umur sekitar 14 hari dengan menggunakan suspensi konidia yang disemprotkan secara merata ke permukaan bawah daun. Konsentrasi konidia di dalam suspensi adalah sekitar 4 x 104 konidia/ml. Perlakuan inokulasi diberikan pada ketiga daun dalam
satu tangkai daun, kemudian daun disungkup dengan kantong plastik. Tiga hari setelah perlakuan inokulasi, semua daun yang diberi perlakuan patogen diambil untuk digunakan sebagai sumber RNA.
Isolasi total RNA
RNA diisolasi dari jaringan daun berdasarkan metode Pawlowski et al.
(1994) yang dimodifikasi. Peralatan dan larutan yang akan digunakan untuk mengisolasi RNA direndam dalam larutan DEPC 0,1%. Ke da lam Erlenmeyer 100 ml dipipet 10 ml buffer ekstrak SDS (200 mM Tris-HCl pH 8,5, 300 mM LiCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 3% SDS) dan 100 mM β-merkaptoetanol, kemudian distirer dalam keadaan dingin.
Daun karet dicuci dengan air steril, kemudian tulang daunnya dibuang dan dikeringkan dengan kertas tisu. Antara 2 – 2,5 g daun ditimbang, dimasukkan ke dalam lumpang porselen yang telah didinginkan, kemudian ditambahkan 0,2 g PVP dan nitrogen cair, lalu digerus sampai terbentuk serbuk halus. Serbuk halus yang diperoleh dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan bufer ekstrak dan β-merkaptoetanol, distirer dalam keadaan dingan selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 8 ml ammonium asetat 3 M dan dihomogenkan. Larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 30 ml dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 25 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus lain dan ditambahkan 1/10 volume Na asetat 3 M (pH 5,2) dan 1 volume isopropanol dingin, campuran dihomogenkan perlahan-lahan dan kemudian diinkubasi pada suhu -20 0C selama 30 menit.
Selanjutnya campuran disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 25 menit. Cairan dibuang, endapan dilarutkan dengan 5 ml akuades steril (yang telah diberi perlakuan dengan DEPC 0,1%) dan ditambahkan 5 ml fenol:kloroform (1:1), divortex, kemudian disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas (supernatan) dipipet ke dalam tabung sentrifus lain dan dipurifikasi kembali dengan 5 ml fenol:kloroform (1:1). Untuk menghilangkan fenol, supernatan diekstrak dengan 5 ml kloroform, campuran dikocok kuat dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipipet ke dalam tabung sentrifus lain, ditambahkan ¼ volume LiCl 10 M, dihomogenkan
dan diinkubasi pada suhu 40 0C selama 3 jam. Campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit, cairan dibuang, endapan RNA dilarutkan dengan 500 µl akuades steril kemudian larutan dipipet ke dalam tabung 2 ml. Ke dalam tabung ditambahkan 1/10 volume natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 2,5 volume alkohol absolut, kemudian diinkubasi pada suhu –20 0C satu malam. Selanjutnya campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang, endapan dicuci dengan 500 µl alkohol 70% kemudian dikering- anginkan . Endapan dilarutkan dengan 500 µl akuades steril.
Hasil isolasi RNA diamati melalui elektroforesis pada gel agarose 1% yang ditambah dengan 0,5 mg/l etidium bromida, pada tegangan 50 Volt selama sekitar 1 jam. RNA diamati dengan menggunakan UV transiluminator. Penetapan konsentrasi RNA dilakukan dengan spektrofotometer UV melalui nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al.1989).
PemurnianmRNA dari RNA total
Untuk mengisolasi mRNA dari RNA digunakan Poly ATract mRNA
Isolation System III (Promega Cat. Z5300) sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan dalam petunjuk teknisnya. Pelaksanaan isolasi tersebut terdiri atas beberapa tahap sebagai berikut:
Penyiapan larutan 0,5 x SSC dan 0,1 x SSC (dari larutan 20 x SSC). Untuk pembuatan 0,5 x SSC, sebanyak 50 µl (20 x SSC) dipipet ke dalam tabung mikro 2 ml, kemudian ditambahkan 1950 µl Nuclease free water dan campuran dihomogenkan. Untuk pembuatan 0,1 x SSC, sebanyak 10 µl (20 x SSC) dipipet ke dalam tabung mikro 2 ml kemudian ditambahkan 1990 µl Nuclease free water
dan campuran dihomogenkan.
Pencucian Streptavidin-Paramagnetic Particle (SA-PMPs). Partikel SA-PMPs
disuspensikan dengan hati-hati sehingga endapan dan larutan tercampur rata, kemudian diletakan pada MagneSphere Magnetic Separation Stand (MSMSS), dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung. Supernatan dibuang dengan menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan. Ke dalam endapan ditambahkan sebanyak 300 µl (0,5 x SSC) kemudian disuspensikan.
Tabung diletakkan kembali pa da MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung dan supernatan dibuang dengan menggunakan pipet. Proses pencucian endapan diulang kembali sampai tiga kali dan pada tahap akhir ditambahkan sebanyak 100 µl (0,5 x SSC).
Penyiapan sampel RNA. Sebanyak 100-1000 µg RNA total, dipipet ke dalam tabung mikro 0,5 ml. Jika volume RNA total kurang dari 500 µl maka ditambahkan Nuclease free water hingga mencapai volume 500 µl, kemudian diinkubasi di alat PCR pada suhu 65 0C selama 10 menit. Dalam keadaan panas ditambahkan 3 µl Biotinylated Oligo (dT) Probe (50 pmol/µl) dan 13 µl (20 x SSC). Campuran dihomogenkan dengan hati-hati dan kemudian dibiarkan dingin sampai mencapai temperatur ruang.
Penangkapan dan pencucian hibrid oligo(dT)-mRNA. Sampel RNA yang telah disiapkan seperti di atas, dipipet ke dalam tabung yang berisi SA-PMPs yang telah dicuci sebelumnya. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, setiap 1-2 menit sekali dikocok perlahan. Untuk menangkap SA-PMPs, tabung diletakkan pada MSMSS dan dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung, kemudian supernatan dibuang dengan menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan. Ke dalam tabung ditambahkan 300 µl (0,1 x SSC) kemudian disuspensikan dan diletaka n kembali pada MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung dan supernatan dibuang dengan menggunakan pipet. Penambahan 300 µl (0,1 x SSC) diulang hingga 4 kali. Pada tahap akhir diusahakan membuang sebanyak mungkin cairan yang ada tanpa menyentuh partikel.
Elusi mRNA. Untuk meng-elusi mRNA, endapan SA-PMP diresuspensikan dengan 100 µl RNase- free water secara hati-hati. Campuran diletakkan pada
MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung. Supernatan dipipet ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru. Ke dalam tabung SA-PMP ditambahkan kembali 150 µl RNase- free water kemudian disuspensikan dengan hati-hati.
Campuran diletakkan kembali pada MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung. Supernatan dipipet dan digabungkan
dengan hasil sebelumnya ke dalam tabung mikro 1,5 ml sehingga diperoleh total volume 250 µl mRNA. Jika ada partikel yang terbawa, larutan disentrifugasi 10.000 g selama 5-10 menit pada suhu 4 0C. Supernatan yang merupakan stok mRNA dipindah ke dalam tabung lain dan disimpan pada –70 0C.
Penetapan kemurnian dan konsentrasi mRNA dan pengambilan kembali mRNA.
Ke dalam 250 µl mRNA ditambahkan 250 µl Nuclease free water, kemudian konsentrasi mRNA ditetapkan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan kemurniannya ditentukan melalui perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (Sambrook et al., 1989).
Untuk mengambil kembali mRNA, dilakukan pengendapkan dengan menambahkan 1/10 volume Na asetat 3M (pH 5,2) dan 2,5 volume alkohol absolut, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu –20 0C selama satu malam. Larutan disentrifus pada 14.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Cairan dibuang, endapan mRNA dicuci dengan 500 µl alkohol 70% , disentrifus kembali pada 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Cairan dibuang, endapan mRNA dikeringanginkan beberapa saat, kemudian dilarutkan dengan deionized
H2O steril hingga didapatkan konsentrasi mRNA 0,25µg– 0,5µg. Sintesis cDNA
Sintesis dan fraksinasi cDNA dilakukan dengan “SMART cDNA Library Construction Kit” dari Clontech (Cat. No. K1051-1), dengan tahapan sebagai berikut :
Sintesis cDNA utas pertama . Ke dalam tabung mikro 0,5 ml dicampurkan 1-3 µl
mRNA (0,25 µg-0,5 µg), 1 µl SMART IV oligonukleotida, 1 µl CDS III/3’ PCR primer, dan deionized H2O (milli Q filter) sampai volume 5 µl. Campuran dihomogenkan, diputar sesaat, dan diinkubasi pada suhu 72 0C selama 2 menit, kemudian didinginkan di dalam es selama 2 menit, dan dip utar sesaat. Selanjutnya ke dalam tabung ditambahkan 2 µl (5 X First-stand buffer), 1 µl DTT (20 mM), 1 µl DNTP mix (10 mM), dan 1 µl Power Script Reverse Transcriptase. Campuran dihomogenkan menggunakan pipet, diputar sesaat, ditambahkan 10 µl
minyak mineral dan diinkubasi pada suhu 42 0C selama 1 jam. Setelah selesai campuran diletakkan di es dan disimpan pada suhu – 20 0C.
Sintesis cDNA utas kedua melalui Amplifikasi dengan cara Long-Distance PCR (LD-PCR). Mesin PCR diprogram pada suhu 95 0C. Sementara itu ke dalam tabung mikro 0,5 ml yang telah didinginkan di es, dicampurkan 2 µl cDNA utas pertama, 80 µl deionized H2O (milli Q filter), 10 µl Advantage 2 PCR Buffer 10 X, 2 µl DNTP mix (50 X), 2 µl 5’ PCR primer, 2 µl DS III/3’ PCR primer, dan 2 µl 50 X Advantage 2 Polymerse mix.
Campuran dihomogenkan perlahan, diputar sesaat, dan ditambahkan 50 µl minyak mineral, kemudian diamplifikasi dengan program PCR, 95 0C 1 menit, serta 22 siklus yang terdiri atas (95 0C 15 detik dan 68 0C6 menit). Sebanyak 5 µl hasil PCR dicek di gel agaros 1,1 % dan sisanya disimpan pada suhu – 20 0C. Untuk marker DNA digunakan 1 Kb DNA Ladder.
Perlakuan Proteinase K
Untuk menghentikan aktivitas DNA polimerase yang terdapat dalam 50x
Advantage 2 Polymerase Mix digunakan Proteinase K dengan cara inkubasi pada 45 0C selama 20 menit. Ke dalam tabung mikro 0,5 ml dicampurkan 50 µl hasil PCR dan 2 µl proteinase K (20 µg/µl). Campuran dihomogenkan, diputar sesaat, dan diinkubasi pada suhu 45 0C selama 20 menit, kemudian diputar sesaat. Ke dalam campuran ditambahkan 50 µl deionized H2O (milli-Q filter), dan 100 µl phenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), tabung dibolak-balik selama 1-2 menit. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Bagian atas dipipet ke tabung lain, dan ditambahkan 100 µl kloroform : isoamilalkohol (24:1), tabung dibolak-balik kembali selama 1-2 menit dan disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Bagian atas dipipet ke tabung lain, dan ditambahkan 10 µl Sodium asetat 3 M, 1,3 µl Glikogen (20 µg/µl), dan 260 µl Etanol 95 % (RT).
Campuran dihomogenkan dengan membolak-balik tabung, disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 20 menit (RT). Cairan dibuang dengan menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan, kemudian endapan dicuci dengan
100 µl etanol 80%, dan disentrifus kembali pada 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang menggunakan pipet dan endapan dikering-anginkan (±10 menit), kemudian dilarutkan dengan 79 µl deionized H2O (milli-Q filter).
Digesti dengan enzim Sfi I
Ke dalam tabung mikro 0,5 ml dicampurkan 79 µl cDNA, 10 µl (10 X Sfi buffer), 10 µl enzim Sfi I, dan 1 µl BSA 100 X. Campuran dihomogenkan, kemudian diinkubasi pada suhu 50 0C selama 2 jam.
Fraksinasi cDNA dengan CHROMA SPIN-400
Sebanyak 16 tabung mikro dengan volume 1,5 ml dilabel dan disusun di rak. Kemudian Chroma Spin -400 Coloum dibiarkan pada suhu kamar selama 1 jam, dibolak-balik beberapa kali sampai matrik gel tersuspensi sempurna. Gelembung udara pada kolom dihilangkan menggunakan pipet 1.000 µl. Matrik diresuspensi perlahan untuk menghindari terbentuknya gelembung udara, kemudian tutup kolom bagian bawah dibuka dan cairan dibiarkan menetes. Selanjutnya kolom diletakkan pada ring stand, dan storage buffer dibiarkan mengalir sampai terlihat lapisan atas gel berada di dalam kolom.
Bagian atas matrik diupayakan berada di garis 1,0 ml dan apabila kurang ditambahkan matrik dari kolom ekstra yang disediakan. Laju pengaliran (flow rate) yang baik adalah kira-kira satu tetes/40-60 detik dan volume satu tetes kira- kira 40 µl. Apabila laju pengaliran terlalu lambat dan volume sat tetes terlalu sedikit, maka matrik harus diresuspensikan kembali dan prosedur diulang sampai didapat laju pengaliran dan volume satu tetes seperti yang direkomendasikan.
Pada saat storage buffer sudah berhenti menetes, perlahan ditambahkan 700 µl bufer kolom melewati dinding kolom dan dibiarkan mengalir keluar dari kolom. Apabila bufer sudah berhenti menetes (15-20 menit), dimasukkan 100 µl cDNA yang telah dipotong dengan enzim SfiI melewati dinding kolom dan sampel dibiarkan terserap seluruhnya ke lapisan atas matrik (sampai tidak ada cairan di lapisan atas). Tabung bekas sampel dicuci dengan 100 µl bufer kolom dan dimasukkan ke kolom (menggunakan pipet, melewati kolom). Bufer
dibiarkan mengalir ke dalam kolom sampai lapisan atas tidak terdapat cairan. Pada tahap ini pewarna telah masuk beberapa mm.
Rak yang telah berisi 16 tabung diletakkan di bawah kolom, tabung pertama tepat di bawah kolom. Kemudian ditambahkan 600 µl bufer kolom ke atas kolom dan pada saat itu tetesan fraksi (setiap tetes) ditampung ke dalam tabung ke -1 sampai tabung ke-16. Setelah selesai kolom ditutup kembali kemudian profil fraksinasi dicek pada agarosa 1,1 % melalui pewarnaan dengan etidium bromida 0,5 mg/l, dengan cara memipet 3 µl dari setiap tabung, ditambah loading bufer, kemudian dielektroforesis pada 150 V selama 10 menit. Fraksi dikumpulkan dalam tabung yang sama (maksimum berasal dari 3-4 tabung).
Ke dalam tabung yang mengandung fraksi cDNA ditambahkan 1/10 volume Sodium asetat 3 M (pH 4,8), 1,3 µl Glikogen (20 mg/ml), dan 2,5 volume Etanol 95 %. Campuran dihomogenkan perlahan dan diinkubasi pada suhu –20 0
C (semalam). Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14.000 rpm selama 20 menit pada suhu kamar, cairan dibuang menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan dan tabung disentrifus sesaat supaya semua cairan turun ke bawah. Cairan dibuang, endapan yang merupakan cDNA dikering-anginkan 10 menit dan dilarutkan dengan 7 µl deionized H2O dan dis impan pada suhu –20 0C.
Penyiapan vektor kloning, sel bakteri kompeten dan transformasi vektor modifikasi
Konstruksi pustaka cDNA meliputi kloning fragmen cDNA hasil
fraksinasi ke vektor kloning sehingga menghasilkan vektor rekombinan serta introduksi vektor rekombinan ke sel inang E. coli DH5α kompeten. Kloning fragmen cDNA menggunakan pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, Cat. No. A1360), dengan ukuran 3015 bp (Gambar 8). Karena vektor pGEM-T Easy tidak memiliki situs enzim restriksi Sfi I sedangka n sistem yang digunakan untuk menyiapkan cDNA melibatkan penggunaan enzim tersebut maka diperlu kan modifikasi terhadap vektor. Modifikasi vektor pGEM-T Easy dilakukan dengan menambahkan suatu oligo utas ganda ke vektor tersebut. Oligo Sfi 1 dan Sfi 2 masing-masing terdiri atas 38 nukleotida, dengan sekuen Sfi 1 dan Sfi 2 oligo adalah sebagai berikut :
5’ GGCCATTATGGCCTGCAGGATCCGGCCGCCTCGGCCGA 3’ dan 5’ CGGCCGAGGCGGCCGGATCCTGCAGGCCATAATGGCCA 3’.
Sekuen oligonukleotida tersebut disisipkan pada bagian overhang-T di daerah
Multiple Cloning Site (MCS) melalui proses ligasi.
Gambar 8. Peta vektor pGEM-T Easy (Promega Cat.A1360)
Oligo Sfi dipersiapkan dengan cara membuat konsentrasi kedua macam oligo menjadi 1 µg / µl dengan menambahkan akuades bebas ion. Proses
annealing kedua oligo dilakukan dengan mencampurkan secara homogen sebanyak 5 µl oligo Sfi 1, 5 µl oligo Sfi 2, 2 µl MgCl2 (25 mM), ditambah 36 µl minyak mineral, kemudian dipanaskan di alat PCR pada suhu 100 0C selama 5 menit. Setelah itu suhu mesin PCR dibiarkan turun dengan sendirinya sampai pada 40 0C.
Untuk meligasikan vektor dengan oligo Sfi, sebanyak 1 µl vektor pGEM- T Easy (50 ng/µl) dicampurkan secara homogen dengan 1 µl oligo Sfi (1 ng/µl), 5 µl 2x Rapid Ligation Buffer T4 DNA ligase, 1 µl T4 DNA ligase (3 u/µl) dan 2 µl H2O Milli-Q sehingga volume total adalah 10 µl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 4 0C selama satu malam, dan diintroduksikan ke sel inang bakteri E. coli DH5α.
Introduksi vektor pGEM-T Easy hasil modifikasi dilakukan untuk mendapatkan koloni bakteri yang teruji memiliki vektor modifikasi, yakni yang