cDNA ASAL DAUN KARET
PEMBAHASAN UMUM
Pemahaman tentang mekanisme molekuler yang mengontrol resistensi tanaman terhadap infeksi patogen merupakan salah satu syarat penting untuk menanggulangi serangan patogen secara efektif dan efisien. Pada tanaman karet, cendawan pa togen C. cassiicola penyebab penyakit gugur daun karet telah dikenal cukup lama dan diketahui dapat menimbulkan kerugian yang sangat nyata pada pertanaman karet komersil di berbagai negara produsen karet alam (Jayasinghe dan Silva 1996; Sinulingga et al. 1996; Shukor dan Hidir 1996). Pengamatan terhadap tanaman di lapang maupun di rumah kaca menunjukkan bahwa klon karet yang ada saat ini memiliki tingkat resistensi yang berbeda terhadap infeksi
C. cassiicola, mulai dari sangat resisten sampai sangat rentan. Perbedaan tingkat resistensi klon tersebut tidak dapat dijelaskan melalui mekanisme pertahanan struktural karena dalam hal ini tidak terdapat perbedaan nyata antara klon resisten dan klon rentan. Nampaknya interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola
terjadi melalui mekanisme yang lebih spesifik dan relatif komplek pada tahap molekul serta dikontrol secara genetik.
Ketersediaan klon karet resisten merupakan koleksi yang sangat berharga dan dapat digunakan sebagai material dasar untuk pengembangan bahan tanam secara luas guna mengatasi serangan patogen. Namun hal ini tetap mengkhawatirkan karena adanya kecenderungan kemampuan patogen untuk mematahkan resistensi tanaman. Fenomena tersebut ditemukan pada klon GT 1 dan RRIM 600 yang di masa lalu merupakan klon unggulan yang cukup populer sehingga ditanam di berbagai perkebunan karet di Indonesia. Namun survei yang dilakukan tahun 1999 – 2000 menunjukkan bahwa di sembilan sentra perkebunan karet yang tersebar di Sumatera, Jawa dan Kalimantan penampilan kedua klon tersebut akibat infeksi patogen mulai memburuk dan penurunan produksi dapat mencapai 40% (Situmorang 2002). Dengan demikian diperlukan pengetahuan tentang landasan mekanisme molekuler interaksi inang-patogen sehingga dapat digunakan dalam penyusunan strategi penanggulangan penyakit di masa depan.
Sampai sejauh ini disadari bahwa sangat sedikit informasi yang tersedia tentang mekanisme molekuler yang menyebabkan klon karet tertentu resisten terhadap infeksi C. cassiicola. Oleh karena itu pengungkapan kandidat gen yang berhubungan dengan sistem pertahanan tanaman karet terhadap patogen ter kait merupakan salah satu jalan yang dapat ditempuh untuk memahaminya. Dalam hal ini, pemilihan klon, teknik inokulasi dan periode waktu setelah inokulasi patogen untuk pengambilan sampel daun merupakan hal penting yang harus dipertimbangkan.
Klon karet AVROS 2037 memiliki resistensi tinggi terhadap berbagai isolat C. cassiicola sedangkan klon PPN 2444 sangat rentan, baik di lapang maupun pada pengujian di rumah kaca secara terkontrol (Bab 2; Hadi 2003; Situmorang 2002; Soepena et al. 1996). Sedangkan teknik inokulasi patogen melalui inokulasi konidia pada permukaan bawah daun merupakan teknik yang sesuai untuk me ngetahui tingkat resistensi klon karet karena sejalan dengan proses infeksi patogen secara alami di lapang (Situmorang 2002). Dalam hal ini dapat diketahui sekaligus lamanya waktu yang diperlukan sampai terlihat gejala awal pada daun karet. Penampakan gejala awal berupa bercak coklat yang tidak meluas pada klon resisten dan bercak yang meluas sehingga akhirnya daun mengalami nekrosis dan menggulung pada klon rentan, mulai terlihat secara visual sekitar 2 hari setelah proses inokulasi. Oleh karena itu pengambilan sampel sebagai sumber RNA dib atasi pada beberapa periode waktu, mulai dari 24 sampai 72 jam setalah inokulasi, dengan asumsi bahwa dalam rentang waktu tersebut telah terjadi respon pada tanaman.
Pengelompokan klon karet berdasarkan marka AFLP menunjukkan bahwa klon resisten memisah menjadi dua, yaitu empat klon dengan kemiripan genetik 88,0% (AVROS 2037, PR 255, BPM 1, IRR 100) dan satu klon (RRIC 100) dengan kemiripan genetik 85,5%. Ke-empat klon dengan kemiripan genetik sama diduga membawa marka AFLP yang sama sehingga berpeluang besar memiliki gen pengendali ketahanan yang juga sama terhadap C. cassiicola. Kekecualian ditemukan pada klon RRIC 100. Klon tersebut memiliki resistensi di lapang tetapi memperlihatkan kemiripan genetik yang lebih rendah dengan ke -empat klon resisten lainnya. Diduga klon RRIC 100 membawa marka atau gen pengendali
resistensi yang berbeda dengan ke -empat klon resisten yang lain. Secara umum terdapat konsistensi antara hasil pengujian menggunakan marka AFLP dengan hasil pengujian in vivo di rumah kaca.
Marka genetik berbeda untuk resistensi terhadap C. cassiicola yang dimiliki oleh klon RRIC 100 diduga berhubungan erat dengan lingkungan tumbuh tetuanya. Klon RRIC 100 merupakan hasil persilangan antara tetua jantan RRIC 52 yang dikembangkan di Sri Lanka dan tetua betina PB 86 yang dikembangkan di Malaysia . Sementara itu, ke -empat klon resisten lain merupakan hasil persilangan tetua jantan dan betina yang dikembangkan di Indonesia. Sebagai contoh klon AVROS 2037 dan BPM 1 berasal dari beberapa klon AVROS seri sebelumnya yang dikembangkan di wilayah Sumatera Utara dan klon PR 255 berasal dari persilangan Tjir 1 dan PR 107 yang dikembangkan di wilayah Jawa Barat. Perbedaan lingkungan tumbuh dari tetua dapat menimbulkan perbedaan adaptasi klon-klon yang diuji terhadap berbagai isolat C. cassiicola yang terdapat di lingkungan tersebut.
Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini kuat dugaan bahwa sifat resistensi terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh lebih dari satu gen. Hal ini sejalan dengan beberapa hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa sifat ketahanan tanaman karet terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh dua pasang gen utama (Hadi 2003) atau pendapat lain yang mengemukakan bahwa sifat ketahanan kemungkinan dikendalikan secara poligenik (Tan dan Tan 1996).
Untuk mengidentifikasi gen atau bagian gen yang secara langsung maupun tidak langsung terlibat di dalam mekanisme molekuler resistensi tanaman melawan patogen, diperlukan pembandingan pola ekspresi transkrip atau gen dalam kondisi tanaman diinfeksi patogen dan tanpa infeksi, baik pada klon resisten maupun klon rentan. Berbagai metode tersedia untuk tujuan tersebut, antara lain DDRT-PCR (Liang dan Pardee 1992), subtractive hybridization (Hara
et al. 1991), serial analysis of gene expression (SAGE) (Velculescu et al. 1995),
microarray (Schena et al. 1995), serta cDNA amplified length polymorphism
(cDNA-AFLP) (Bachem et al. 1996). Di antara teknik tersebut di atas, cDNA- AFLP merupakan teknik yang cukup efisien karena didasarkan pada amplifikasi menggunakan PCR serta dalam satu percobaan yang sama langsung dapat
dideteksi transkrip yang diindukasi atau ditekan ekspresinya sebagai respon terhadap kondisi tertentu. Oleh karena itu teknik cDNA-AFLP dipilih untuk digunakan dalam mengidentifikasi transkrip yang memiliki pola ekspresi berbeda pada suatu kinetik waktu setelah inokulasi patogen, baik pada klon resisten AVROS 2037 maupun klon rentan PPN 2444.
Aplikasi teknik cDNA-AFLP (Bachem et al. 1996) yang dikembangkan berdasarkan teknik AFLP genomik (Vos et al. 1995), pada cDNA asal daun karet ternyata mengalami banyak hambatan. Hal ini berbeda dengan aplikasinya pada DNA genomik asal daun karet yang digunakan dalam rangkaian penelitian ini untuk mengetahui kemiripan genetik antara klon karet yang diuji. Modifikasi dalam proses visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi dengan primer AFLP selektif melalui pewarnaan dengan perak nitrat serta reduksi ukuran gel telah memberikan hasil yang baik pada analisis AFLP yang berasal dari DNA daun karet. Fragmen-fragmen DNA dapat terpisah dengan baik pada gel poliakrilamid sehingga metode tersebut dapat diaplikasikan. Sedangkan optimasi analisis cDNA-AFLP melalui perbaikan pada prosedur penyiapan sampel cDNA serta penggunaan enzim restriksi dan primer selektif yang sesuai be lum memberikan hasil yang baik, terutama dalam visualisasi produk cDNA-AFLP.
Masalah utama dalam aplikasi teknik cDNA-AFLP adalah mendapatkan RNA dengan kualitas baik dan seragam. Hal ini penting karena pembandingan pola ekspresi dilakukan antar sampel. Sehubungan dengan hal tersebut maka beberapa metode isolasi RNA telah diuji untuk mendapatkan kondisi yang paling sesuai. Pada prinsipnya setiap metode isolasi RNA ditujukan untuk memecahkan dinding sel, menghambat degradasi RNA dengan cara menghambat aktivitas RNAase serta memisahkan RNA dari kontaminan seperti DNA, protein dan polisakarida (Strommer et al. 1993). Pemecahan dinding sel umumnya dilakukan dengan cara menghaluskan organ tanaman yang digunakan sebagai sumber RNA di dalam nitrogen cair. Bahan tanama n yang telah halus (menyerupai serbuk) kemudian dilarutkan dalam bufer ekstrak yang mengandung deterjen seperti SDS, CTAB atau sarkosil. Deterjen selain berfungsi untuk merusak membran sel juga berfungsi menghambat aktivitas ribonuklease. Beberapa metode menambahkan β-merkaptoetanol pada tahap ekstraksi tersebut, untuk membatasi pencoklatan
oleh senyawa fenolik dan juga untuk merusak ikatan disulfida yang terdapat pada molekul ribonuklease. Untuk memisahkan RNA dari komponen lain, umumnya dilakukan melalui ekstraksi phenol, sentrifugasi dan pengendapan, atau kombinasi dari ketiganya.
Isolasi RNA berdasarkan metode Pawlowski et al. (1994) pada prinsipnya menggunakan SDS sebagai deterjen dalam bufer ekstrak dan LiCl untuk memisahkan RNA dengan DNA. Aplikasi metode tersebut untuk mengisolasi RNA dari daun karet dilakukan dengan beberapa modifikasi, seperti penambahan β-merkaptoetanol serta penggunaan kondisi dingin dalam proses ekstraksi. Sedangkan metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993) yang diaplikasikan sedikit berbeda, yaitu menggunakan CTAB dalam bufer ekstrak sehingga proses ekstraksi dilakukan dalam kondisi suhu 650C. Hasil yang kurang stabil dengan penerapan kedua metode tersebut yang ditunjukkan oleh tingginya variasi dalam kualitas maupun kuantitas RNA antar sampel, diduga disebabkan oleh panjangnya proses isolasi sehingga memerlukan waktu yang cukup lama . Pada setiap tahapan terdapat resiko menurunnya kualitas dan kuantitas RNA.
Isolasi RNA dengan kit Plant RNA Reagent (Invitrogen) dapat mempersingkat waktu pelaksanaan, namun masih terdapat variasi RNA antar sampel. Variasi tersebut berdampak pada kualitas cDNA yang dapat diamati setelah proses preamplifikasi. Penggunaan mRNA Capture Kit (Roche) yang merupakan metode satu tabung (one tube method) memiliki kelebihan karena proses isolasi RNA tidak diperlukan. Dalam hal ini mRNA dipisahkan dengan cara yang lebih efisien. Pada tahap awal poli(A) mRNA yang terdapat dalam campuran larutan yang masih mengandung RNA lain seperti ribosomal RNA dan transfer RNA serta DNA, dihibridisasikan dengan oligo(dT)20 yang dilabel biotin kemudian ditrasfer ke tabung mikro yang dindingnya dilapisi dengan streptavidin (streptavidin-coated PCR tube). Karena mRNA memiliki molekul biotin yang diperoleh dari oligo(dT) maka hanya mRNA yang akan terikat ke dinding tabung sedangkan RNA lain dan DNA tetap terdapat dalam larutan sehingga dengan mudah dapat dipisahkan dari mRNA.
Metode satu ta bung pada awalnya didisain untuk pelaksanaan RT-PCR dimana proses sintesis cDNA utas pertama dan transkripsi balik dilakukan pada
tabung yang sama (Instruction manual mRNA Capture Kit). Metode tersebut oleh Feron et al. (2004) dikembangkan untuk digunakan dalam proses cDNA-AFLP. Pemisahan mRNA, sintesis cDNA utas pertama dan kedua, restriksi cDNA dengan enzim restriksi pertama dan kedua dilakukan dalam tabung yang sama. Dengan menggunakan berbagai sampel dengan perlakuan dan tahap perkembangan berbeda dibuktikan bahwa cDNA setelah proses preampilfikasi memiliki kuantitas dan kualitas yang seragam. Produk preamplifikasi tersebut memberikan pola ekspresi berbagai transkrip yang dapat dibedakan secara diskrit pada gel poliakrilmid dan bersifat reproducible. Hasil yang sebanding dalam penelitian ini diperoleh pada proses preamplifikasi dengan mengaplikasikan
mRNA Capture Kit pada cDNA asal daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444. Dengan menggunakan produk preamplifikasi tersebut, pola ekspresi berbagai transkrip asal cDNA daun karet yang diperoleh melalui amplifikasi selektif dengan dua basa tambahan pada primer Vsp dan primer Taq memberikan hasil yang memuaskan. Perubahan pola transkrip selama beberapa waktu setelah terjadi interaksi antara tanaman kare t dengan patogen C. cassiicola dapat dideteksi. Perubahan pola tersebut bisa berupa peningkatan atau penurunan ekspresi sepanjang waktu pengamatan pada masing-masing klon resisten AVROS 2037 atau klon rentan PPN 2444, bisa juga berupa perbedaan pola ekspresi pada kedua klon tersebut. Meskipun pengamatan lebih difokuskan pada transkrip yang terinduksi pada klon resisten, namun perubahan ekspresi pada klon rentan tetap menarik perhatian karena diduga dapat memberikan informasi tentang aspek molekuler respon penyakit pada tanaman karet.
Sekitar 1450 fragmen (TDF) diperoleh dari amplifikasi selektif menggunakan 29 kombinasi pasangan primer Vsp dan Taq, 35 di antaranya menunjukkan pola ekspresi yang menarik. Hasil isolasi fragmen tersebut dan kloningnya pada vektor kloning menunjukkan bahwa dalam satu pita bisa terdapat beberapa fragmen yang berbeda. Oleh karena itu untuk masing-masing fragmen diambil 5 klon sehingga jumlah total fragmen yang disekuen adalah 175 fragmen. Namun setelah dilakukan pengelompokan sekuen berdasarkan homologinya, keseluruhan sekuen tersebut mengelompok dalam 19 contigs dan 9 sekuen yang tidak dapat dikelompokkan dalam contig yang sama. Dari jumlah tersebut, 10
contigs dan 5 sekuen setelah dibandingkan dengan sekuen yang ada di database (BLAST-X, Altschul et al. 1997), memiliki sekuen homologi dengan berbagai produk gen yang telah dikenal. Berdasarkan fungsinya, paling tidak terdapat transkrip yang termasuk dalam kategori transduksi sinyal seperti Ran binding protein dan putative auxin efflux carrier, GTP binding protein, protein transport, regulator transkripsi dan protein yang berhubungan dengan cekaman pada tanaman, seperti arginase, heat shock protein (HSP) dan aconitase. Beberapa transkrip seperti Ran binding protein, protein transpor, GTP binding protein merupakan protein membran.
Protein yang terdapat pada membran diketahui banyak berperan dalam persepsi sinyal sehingga perubahan yang terjadi di lingkungan sel segera dapat dideteksi. Dalam interaksi inang-patogen, kema mpuan sel untuk mendeteksi secara cepat adanya kondisi yang tidak menguntungkan di lingkungannya merupakan salah satu hal yang membedakan respon antara tanaman resisten dan tanaman rentan.
Pemahaman tentang regulasi enzim arginase jauh lebih berkembang pada sel mamalia dibandingkan dengan sel tanaman (Chen et al. 2004). Induksi ekspresi arginase pada sel mamalia yang merupakan respon terhadap trauma pelukaan serta infeksi patogen berperan penting dalam mengatur metabolisme L- arginin. Paling tidak terdapat dua jalur utama metabolisme arginin, yaitu dikatalis oleh enzim arginase dan lainnya oleh nitric-oxide synthase (NOS). Aktivitas arginase akan mengubah arginin menjadi urea dan ornithin, dimana ornithin merupakan prekursor dalam biosintesis poliamine. Sedangkan aktivitas NOS akan mengubah arginin menjadi nitric -oxide (NO). NO berperan dalam pembentukan cGMP (cyclic guanylate cyclase) yang diperlukan dalam sinyal transduksi dan pengaturan ion channel (Durner et al. 1998). Jalur mana yang akan ditempuh sangat tergantung pada ekspresi arginase dan ketersediaan arginin di dalam sel.
Adanya dua jalur pembentukan arginin dapat menimbulkan kompetisi dalam penggunaan arginin. Apabila ekspresi arginase meningkat di dalam sel, maka arginin akan lebih banyak digunakan untuk menghasilkan urea dan ornitin sehingga produksi NO berkurang. Pada berbagai mekanisme pertahanan hewan
dan tanaman telah banyak dilaporkan bahwa NO merupakan sinyal molekul untuk mengaktifkan mekanisme pertahanan. Dengan demikia n penurunan level NO dapat mengakibatkan penurunan resistensi inang yang diperantarai NO.
Dari penelitian yang dilakukan oleh Chen et al. (2004) dilaporkan bahwa pada daun tomat ekspresi gen LeARG2 penyandi arginase meningkat tajam oleh adanya pengaruh pelukaan dan toksin coronatine yang disekresikan oleh bakteri patogen Pseudomonas syringae sewaktu menginfeksi tanaman tomat. Pelukaan maupun toksin tersebut mengaktifkan sinyal stres pada tanaman inang berupa akumulasi asam jasmonat (jasmonic acid = JA). Telah lama diketahui bahwa akumulasi JA sebagai respon terhadap pelukaan pada tanaman akan segera mengaktifkan ekspresi sejumlah gen yang responsif terhadap pelukaan tersebut (Creelman dan Mullet 1997). Bahkan dilaporkan bahwa JA seperti halnya asam salisilat (salicylic acid = SA) dan etilen merupakan regulator utama di dalam respon pertahanan tanaman (Dong 1998).
Di samping arginase, TDF lain yang diperoleh juga memiliki homologi tinggi dengan enzim aconitase. Aconitase diketahui merupakan salah satu enzim yang ekspresinya diregulasi oleh NO, dimana aktivitasnya menyebabkan peningkatan level ion bebas di dalam sel. Pada tanaman tembakau, peningkatan iron bebas berhubungan dengan fungsi pertahanan setelah terjadi serangan patogen (Klessig et al. 2000). Di samping itu juga dilaporkan bahwa peningkatan level iron bebas melalui pengrusakan kluster iron-sulfur aconitase oleh NO, berimplifikasi terhadap kerusakan DNA (Keyer dan Imley 1996). Kuat dugaan bahwa NO berkontribusi dalam respon hipersensitif (HR) melalui peningkatan iron bebas dan melalui destabilisasi kluster iron-sulfur (Navarre et al. 2000). Dalam penelitian ini dengan teridentifikasinya beberapa enzim yang berhubungan secara langsung ataupun tidak langsung dengan ketersediaan NO di dalam sel, menimbulkan dugaan bahwa kemungkinan mekanisme resistensi pada tanaman karet diperantarai oleh NO. Sejauh ini telah diketahui bahwa NO merupakan molekul sinyal pada respon pertahanan, dimana NO diperlukan untuk mengaktivasi sepenuhnya resistensi tanaman terhadap penyakit serta program kematian sel pada tanaman kedelai, Arabidopsis dan tembakau (Delledonne et al. 1998; Durner et al. 1998). Program kematian sel melalui respon hipersensitif
diaktivasi setelah terjadi interaksi antara NO dengan H2O2, dimana H2O2 dihasilkan dari O2 - oleh aktivitas enzim superoxide dismutase (Delledonne et al. 2001).
Di samping homolog dengan beberapa enzim seperti tersebut di atas, beberapa TDF juga memiliki homologi tinggi dengan HSP. Meskipun HSP merupakan kelompok protein yang terakumulasi dalam jumla h tinggi apabila sel terpapar suhu tinggi, namun ekspresi HSP juga dapat dipicu oleh berbagai macam stres lingkungan, seperti adanya infeksi ataupun toksin. HSP adalah molekul chaperones bagi protein, umumnya merupakan protein sitoplasma dan memainkan peran penting dalam interaksi protein-protein seperti dalam pelipatan untuk menjaga konformasi serta mencegah agregasi dengan protein yang tidak diinginkan. Bahwa HSP termasuk dalam kategori protein yang berperan dalam mekanisme pertahanan, telah dibuktikan melalui identifikasi keberadaannya dalam interaksi antara tanaman dengan patogennya, seperti antara cassava dengan
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Santaella et al. 2004) dan Arabidopsis thaliana dengan Peronospora parasitica (Van der Biezen et al. 2000).
Meskipun keterlibatan berbagai TDF tersebut dalam mekanisme resistensi tanaman karet masih memerlukan pembuktian lebih lanjut melalui serangkaian penelitian untuk mengamati pola ekspresinya pa da berbagai klon karet resisten dan rentan yang ada, namun paling tidak informasi di atas diharapkan dapat mengawali penelitian molekuler berikutnya untuk membantu mengungkap transkrip atau bagian gen yang berperan dalam mekanisme resistensi tersebut.