Abstrak
Penggunaan tanaman transgenik dalam sistem produksi pertanian memberikan beberapa keuntungan. Namun demikian tanaman transgenik ini masih diperdebatkan terutama mengenai potensi pengaruhnya terhadap lingkungan, diantaranya terhadap musuh alami. Untuk mempelajari perkembangan pradewasa dan kemampuan hidup predator V. lineata pada padi Rojolele transgenik, penelitian tahap laboratorium dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong-Bogor pada bulan Januari-Oktober 2009. Penelitian dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 8 perlakuan dan 30 ulangan. Perlakuan meliputi galur padi Rojolele transgenik, yaitu galur 4.2.3-28-15-2-7 dan 4.2.4-21- 8-16-4 yang mengandung fusi dua gen cry (cryIB-cryIAa), galur 3R9-8-28-26-2 dan 3R7-8-15-2-7 yang mengandung gen mpi::cryIB, galur T9-6.11-420 yang mengandung gen cryIAb melalui teknik penembakan, galur DTcry (Azygous) yaitu segregan yang mengalami proses kultur jaringan dan tidak mengandung gen cry (null), dan galur DTcry-13 yang mengandung gen cryIAb melalui Agrobacterium, serta tanaman padi bukan transgenik yaitu varietas Rojolele. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada perbedaan perkembangan pradewasa dan kemampuan hidup predator V. lineata antar galur padi Rojolele transgenik yang diuji. Pada padi Rojolele transgenik galur T9-6.11-420 (cryIAb melalui teknik penembakan) dan galur DTcry-13 (cryIAb melalui Agrobacterium), lama perkembangan, keberhasilan dalam mencapai setiap stadium perkembangan, kemunculan imago betina, berat imago, dan kemampuan hidup pradewasa dan dewasa predator V. lineata konsisten rendah. Pada padi Rojolele transgenik galur 4.2.3-28-15-2-7 (fusi), 3R9-8-28-26-2 (mpi), dan 3R7-8-15-2-7 (mpi), perkembangan pradewasa dan kemampuan hidup predator V. lineata tidak konsisten. Pada galur DTcry (Azygous), perkembangan pradewasa dan kemampuan hidup predator V. lineata konsisten tidak berbeda dibandingkan dengan padi bukan transgenik varietas Rojolele. Padi Rojolele transgenik galur 4.2.4-21-8-16-4 (fusi) hanya berpengaruh dalam pengurangan berat imago predator V. lineata.
Abstract
The use of transgenic crops in agricultural production system can provide several benefits. However, uses of transgenic crops has raised debate about their potential impact on the environment, such as on natural enemies. To study the impact of transgenic to natural enemies, we conducted a study on larvae development and survival of insect predator V. lineata in transgenic Rojolele rice. Laboratory test was conducted at laboratory of Molecular Biology, Research Centre for Biotechnology-Indonesian Institute of Science, Cibinong-Bogor from January-October 2009. Completely randomize design with 8 treatments and 30 replications were used. The treatments were transgenic Rojolele rice: 4.2.3-28- 15-2-7 and 4.2.4-21-8-16-4 lines containing fusion two cry genes (cryIB-cryIAa), 3R9-8-28-26-2 and 3R7-8-15-2-7 lines containing mpi::cryIB gene, T9-6.11-420 line containing cryIAb gene by particle bombardment, DTcry (Azygous) is a segregate and does not contain cry gene (null), DTcry-13 line containing cryIAb gene by Agrobacterium, and non transgenic rice (Rojolele variety). The result showed that there were differences of larvae development and survival of insect predator V. lineata among transgenic Rojolele rice lines. In transgenic Rojolele rice T9-6.11-420 line (cryIAb gene by particle bombardment) and DTcry-13 line (cryIAb gene by Agrobacterium), life time, developmental stage, the number eclosion of adult female, adult weight, and survival of preimaginal and adult of insect predator V. lineata were consistantly low. In transgenic Rojolele rice 4.2.3-28-15-2-7 line, 3R9-8-28-26-2 line, and 3R7-8-15-2-7 line had no consistant effect on larvae development and survival of insect predator V. lineata. DTcry (Azygous) line had no effect on larvae development and survival of insect predator V. lineata. Whereas transgenic Rojolele rice 4.2.4-21-8-16-4 line had one effect in decreasing of adult weight of insect predator V. lineata.
Key words: transgenic rice, predator V. lineata Pendahuluan
Penggunaan tanaman transgenik dalam sistem produksi pertanian memberikan beberapa keuntungan, seperti mengurangi penggunaan insektisida konvensional yang berspektrum luas, menekan hama target, meningkatkan hasil, mengurangi biaya produksi untuk meningkatkan keuntungan, dan meningkatkan kesempatan untuk pengendalian biologi (Naranjo et al. 2005). Namun demikian, tanaman transgenik ini masih diperdebatkan terutama mengenai potensi pengaruhnya terhadap lingkungan. Isu yang sering menjadi bahan perdebatan adalah mengenai potensi pengaruhnya terhadap biodiversitas, terutama pengaruhnya terhadap organisma bukan sasaran termasuk serangga herbivor bukan sasaran, musuh alami, dan mikrobiota tanah. Isu lainnya adalah serangga yang berkembang menjadi tahan dan perpindahan gen yang diinsersikan dari tanaman ke tanaman liar atau gulma (Fontes et al. 2002; Naranjo et al. 2005).
Agroekosistem terdiri dari interaksi tropik yang kompleks, dengan tanaman sebagai basis jaring-jaring makanan ini. Banyak aspek fisiologi, ekologi dan perilaku organisma di dalam ekosistem ditentukan oleh interaksi dengan organisma yang sama atau tingkat tropik yang lain (Ferry et al. 2007).
Musuh alami seperti predator dan parasitoid adalah regulator populasi hama. Kemampuan hidup musuh alami tergantung pada suplai serangga inang (hama), artinya berkurangnya jumlah inang (hama) yang makan pada tanaman transgenik akan mempengaruhi kerapatan populasi musuh alami (O’Callaghan 2005). Tanaman transgenik dapat mempengaruhi musuh alami melalui tiga cara yaitu: (1) langsung makan pada jaringan tanaman transgenik seperti pollen, akar; (2) makan pada inang yang makan pada tanaman transgenik; dan (3) melalui pengurangan populasi inang (Losey et al. 2004; O’Callaghan 2005). Menurut Dutton et al. (2003) dan Fontes et al. (2002), pengaruh tanaman transgenik terhadap musuh alami dapat terjadi baik secara langsung maupun tidak langsung. Pengaruh langsung disebabkan oleh pengaruh toxin secara langsung terhadap musuh alami. Pengaruh tidak langsung terjadi karena reduksi dari jumlah dan kualitas inang atau mangsa dan secara tidak sengaja introgresi gen menyebabkan perubahan sifat fisik dan kimia tanaman, sehingga tanaman tidak menarik untuk dikunjungi musuh alami.
Coleoptera penting dalam penelitian agro-ekologi karena jumlah spesiesnya yang besar, distribusinya yang kosmopolitan, dan berperan sebagai agen pengendali hayati. Coleoptera seperti kumbang coccinellid selain sebagai predator juga makan pollen tanaman dan nektar dari bunga. Kegunaannya sebagai makanan alternatif yang penting untuk potensi reproduksi coccinellid dan untuk bertahan hidup ketika makanan utamanya jarang. Di dalam pertanian, kumbang coleoptera ini penting karena sebagai spesies indikator kunci yang digunakan untuk memonitor perubahan ekologi atau lingkungan, termasuk biodiversitas (Ferry et al. 2007).
Banyak studi agro-ekologi yang telah mencoba untuk menentukan pengaruh tanaman transgenik terhadap predator dari ordo coleoptera maupun predator dari ordo lainnya. Namun hasilnya berbeda-beda dan tidak konsisten, bergantung pada jenis predatornya. Pilcher et al. (1997) melaporkan tidak ada
pengaruh negatif dari pollen tanaman transgenik (protein cryIAb) terhadap perkembangan pradewasa dan kemampuan hidup predator Coleomegilla maculata DeGeer (Coleoptera: Coccinellidae), Orius insidiosus Say (Heteroptera: Anthocoridae), dan Chrysoperla carnea Stephens (Neuroptera: Chrysopidae). Demikian juga Ferry et al. (2007) melaporkan Bt cry3A tidak mempunyai pengaruh negatif terhadap reproduksi dan aktivitas kumbang Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) dan kumbang Nebria brevicollis (Coleoptera: Carabidae). Hilbeck et al. (1998) mengamati mortalitas larva C. carnea yang memangsa Ostrinia nubilalis dan Spodoptera littoralis yang dipelihara pada tanaman jagung Bt dan non-Bt. Mereka menemukan persentase mortalitas larva C. carnea yang memangsa O. nubilalis yang diperbanyak pada tanaman jagung Bt lebih tinggi (62%) daripada mortalitas larva predator pada jagung non-Bt (37%). Hal serupa tidak terjadi pada C. carnea yang memangsa S. littoralis, baik pada tanaman jagung Bt maupun jagung non-Bt. Dutton et al. (2002) melaporkan C. carnea yang makan Tetranychus urticae yang mengandung toxin cryIAb atau yang makan Rhopalosiphum padi yang tidak mencerna toxin, tidak mempengaruhi kemampuan hidup, perkembangan, atau berat C. carnea. Sebaliknya secara nyata meningkatkan mortalitas dan memperlambat perkembangan predator C. carnea ketika makan S. littoralis.
Studi untuk mempelajari pengaruh tanaman transgenik khususnya tanaman padi transgenik terhadap predator V. lineata belum pernah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari perkembangan pradewasa dan kemampuan hidup predator V. lineata pada padi Rojolele transgenik.
Bahan dan Metode Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong-Bogor pada bulan Januari - Oktober 2009.
Bahan dan Alat
Serangga uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah predator V. lineata dan wereng coklat. Imago predator V. lineata diambil dari pertanaman
padi yang sedang berbunga di Kecamatan Ciasem, Kabupaten Subang-Jawa Barat. Selanjutnya imago predator V. lineata dipelihara pada tanaman padi varietas Ciherang di rumah kaca Balai Besar Penelitian Tanaman Padi Sukamandi-Subang sampai bertelur dan kembali menghasilkan keturunan baru (generasi ke-2). Telur yang dihasilkan dari imago predator V. lineata generasi ke-2 ini selanjutnya dibagi dua, sebagian digunakan untuk perbanyakan dan sebagian lagi digunakan untuk pengujian.
Imago wereng coklat diambil dari pertanaman padi di Cibinong-Bogor. Selanjutnya imago wereng coklat dipelihara pada tanaman padi varietas Rojolele di rumah kaca Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong-Bogor sampai bertelur dan kembali menghasilkan keturunan baru (generasi ke-2). Nimfa instar- 2 dari wereng coklat generasi ke-2 ini digunakan untuk pakan predator V. lineata dalam pengujian.
Materi penelitian yang digunakan terdiri atas 6 galur padi Rojolele transgenik, yaitu galur 4.2.3-28-15-2-7 dan 4.2.4-21-8-16-4 yang mengandung fusi dua gen cry (cryIB-cryIAa), galur 3R9-8-28-26-2 dan 3R7-8-15-2-7 yang mengandung gen mpi::cryIB, galur T9-6.11-420 yang mengandung gen cryIAb melalui teknik penembakan, galur DTcry (Azygous) yaitu segregan yang mengalami proses kultur jaringan dan tidak mengandung gen cry (null), dan galur DTcry-13 yang mengandung gen cryIAb melalui Agrobacterium, serta tanaman padi bukan transgenik yaitu varietas Rojolele.
Untuk mendeteksi keberadaan gen pada tanaman padi Rojolele transgenik yang diuji, dilakukan uji PCR. Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang dikemukakan oleh Van Heusden et al. (2000). Total DNA diekstraksi dari daun tanaman kontrol (tidak ditransformasi) [varietas Rojolele], daun tanaman padi Rojolele transgenik generasi ke-5 [galur 4.2.3-28-15-2-7 (fusi), galur 4.2.4-21-8-16-4 (fusi), galur 3R9-8-28-26-2 (mpi), dan galur 3R7-8- 15-2-7 (mpi)], daun tanaman padi Rojolele transgenik generasi ke-9 [galur T9- 6.11-420 (cryIAb melalui teknik penembakan)], serta daun tanaman padi Rojolele transgenik generasi ke-2 [galur DTcry-13 (cryIAb melalui Agrobacterium)]. Sekitar 10 cm daun muda dimasukkan ke dalam tube 1.5 ml dibekukan dengan nitrogen cair, digerus hingga menjadi halus, dan ditambah dengan 750 µl buffer
isolasi yang mengandung buffer lisis [0.2 M Tris-HCl pH 7.5, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl, 2% (b/v) CTAB], buffer ekstraksi [0.35 M sorbitol, 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA], dan 5% (b/v) sarkosil dengan perbandingan 2.5 : 2.5 : 1. Kemudian diinkubasi 1 jam pada suhu 65 oC sambil dikocok perlahan. Selanjutnya ditambah 750 µl kloroform : isoamil alkohol (24:1) dan dikocok. Kemudian sampel disentrifus (12 000 rpm, selama 5 menit pada suhu ruang). Lapisan atas diambil dan dipindah ke tube 1.5 ml yang baru dan ditambah 500 µl isopropanol dan dikocok. Sampel disentrifus (12 000 rpm, selama 6 menit pada suhu ruang). Supernatan dibuang, pellet dicuci dengan 500 µl 70% etanol dan disentrifus (12 000 rpm selama 3 menit). Supernatan dibuang dan pellet dikering anginkan. DNA dilarutkan dalam 50 µl TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, dan 1 mM EDTA). Sampel DNA disimpan di -20 oC.
Amplifikasi PCR dilakukan dengan total reaksi 20 µl [1x buffer PCR: 2.5 mM MgCl2, 0.05 mM dNTPs, masing-masing 2.5 ng/µl primer, 0.05 µ/µl taq polymerase, 1 µl sampel DNA, dan H2O]. Primer yang didesain untuk memperbanyak fragmen DNA (785 bp) dari fusi dua gen cryIB-cryIAa mempunyai urutan sebagai berikut: forward 5’ gcc caa gaa gct gtc aac gc 3’ dan reverse 5’ cga tgt cga gaa ctg tga gg 3’. Primer yang didesain untuk memperbanyak bagian (1.9 kb) dari gen cryIB mempunyai urutan sebagai berikut: forward 5’ gct gtg tcc aac cac tcc gc 3’ dan reverse 5’ gta ccg aat tgg gct gca gg 3’. Kondisi PCR untuk amplifikasi gen cryIB-cryIAa adalah 95 oC (3 menit); 95 o
C (1 menit), 60 oC (1 menit), 72 oC (1 menit) 35 siklus; 72 oC (10 menit). Kondisi PCR untuk gen cryIB adalah 95 oC (3 menit), 95 oC (1 menit), 62 oC (1 menit), 72 oC (1 menit) 40 siklus; 72 oC (10 menit). DNA hasil amplifikasi dengan PCR dianalisis melalui elektroforesis pada gel agarosa 0.8% dan diwarnai dengan ethidium bromida. Elektroforesis dilakukan selama 1 jam dengan tekanan 100 volt dalam buffer 0.5x Tris Boric Acid EDTA (TBE). Larutan buffer berasal dari stok 5xTBE dengan susunan bahan: 54 g Tris base, 27.5 g Boric acid dan 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 untuk setiap satu liter. Hasil elektroforesis diamati dan difoto dengan menggunakan Bio Rad Gel Doc UV 1000.
Amplifikasi PCR untuk gen cryIAb dilakukan dengan total reaksi 20 µl [1x buffer PCR: 2.5 mM MgCl2, 0.05 mM dNTPs, 0.05 µ/µl taq polymerase, 2.5
ng/µl primer forward cry, 2.5 ng/µl primer reverse cry, 2.5 ng/µl primer goss forward, 2.5 ng/µl primer goss reverse, 1 µl sample DNA, dan H2O]. Primer untuk mendeteksi gen cryIAb mempunyai urutan basa sebagai berikut: forward 5’ cat tgt gtc tct ctt ccc 3’ dan reverse 5’ ccg tta gag aag ttg aaa gg 3’. Kondisi PCR untuk amplifikasi gen cryIAb adalah 95 oC (3 menit) 1 siklus, 95 oC (1 menit), 55 o
C (1 menit), 72 oC (1 menit) 40 siklus; 72 oC (10 menit) 1 siklus. DNA hasil amplifikasi dengan PCR dianalisis melalui elektroforesis pada gel agarosa 0.8% dan diwarnai dengan ethidium bromida. Elektroforesis dilakukan selama 1 jam dengan tekanan 100 volt dalam buffer 0.5x Tris Boric Acid EDTA (TBE). Larutan buffer berasal dari stok 5xTBE dengan susunan bahan: 54 g Tris base, 27.5 g Boric acid dan 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 untuk setiap satu liter. Hasil elektroforesis diamati dan difoto dengan menggunakan Bio Rad Gel Doc UV 1000.
Tanaman-tanaman yang berdasarkan uji PCR memberikan hasil positif selanjutnya digunakan untuk pengujian, sementara tanaman-tanaman yang berdasarkan uji PCR hasilnya negatif dibuang.
Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 8 perlakuan dan 30 ulangan. Perlakuan meliputi: A = Rjl trans galur 4.2.3-28-15-2-7 (fusi), B = Rjl trans galur 4.2.4-21-8-16-4 (fusi), C = Rjl trans galur 3R9-8-28-26-2 (mpi), D = Rjl trans galur 3R7-8-15-2-7 (mpi), E = Rjl trans galur T9-6.11-420 (cryIAb melalui teknik penembakan), F = galur DTcry (Azygous), G = Rjl trans galur DTcry-13 (cryIAb melalui Agrobacterium), H = varietas Rojolele.
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang dikemukakan oleh Pilcher et al. (1997). Tahap-tahap pengujian adalah sebagai berikut: larva instar-1 predator V. lineata ditempatkan pada tabung gelas berukuran 3 cm x 20 cm. Ke dalam tabung gelas tersebut dimasukkan bunga padi (pollen dan anther) sesuai perlakuan, wereng coklat instar-2, madu, dan air sebagai pakan predator. Banyaknya bunga padi (pollen dan anther) yang diberikan sebagai pakan disesuaikan dengan perkembangan predator. Untuk instar-1 dan 2
banyaknya bunga padi (pollen dan anther) yang diberikan sebanyak 0.01 gram. Untuk instar-3, 4, dan imago banyaknya bunga padi (pollen dan anther) yang diberikan masing-masing adalah: 0.02 gram, 0.03 gram, dan 0.04 gram. Banyaknya wereng coklat yang diberikan adalah 5 ekor untuk setiap perlakuan. Madu diberikan dalam bentuk kapas basah yang dicelupkan pada larutan madu 10%, dan air diberikan dalam bentuk kapas basah yang dicelupkan dalam air. Pergantian pakan dilakukan setiap 2 hari sekali.
Pengamatan perkembangan predator V. lineata dilakukan setiap hari dari mulai instar-1 sampai imago mati. Variabel yang diamati meliputi: lama perkembangan pada setiap stadia perkembangan, persentase individu yang gagal mencapai perkembangan, persentase individu yang berhasil mencapai perkembangan, persentase imago jantan yang muncul, persentase imago betina yang muncul, berat imago total, berat imago jantan, berat imago betina, kemampuan hidup pradewasa, dan kemampuan hidupdewasa.
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam (ANOVA) dan perbedaan antar perlakuan dievaluasi dengan uji wilayah berganda Duncan pada taraf nyata 5 % dengan menggunakan program SAS (1990).
Hasil Lama perkembangan predator V. lineata
Berdasarkan hasil analisis terlihat bahwa terdapat perbedaan lama perkembangan predator V. lineata pada setiap stadium perkembangan antar galur padi Rojolele transgenik yang diuji. Perbedaan ini mulai terlihat pada stadium perkembangan instar-2 sampai imago (Tabel 6.1).
Lama perkembangan predator V. lineata dari mulai instar-3 sampai imago pada padi Rojolele transgenik galur T9-6.11-420 (cryIAb melalui teknik penembakan) dan DTcry-13 (cryIAb melalui Agrobacterium) terlihat konsisten nyata lebih rendah dibandingkan dengan padi bukan transgenik varietas Rojolele (P=0.0001). Pada padi Rojolele transgenik galur 4.2.3-28-15-2-7 (fusi), 3R9-8- 28-26-2 (mpi), dan 3R7-8-15-2-7 (mpi) lama perkembangan predator V. lineata pada setiap stadium perkembangan terlihat tidak konsisten. Sebaliknya lama perkembangan predator V. lineata dari mulai instar-1 sampai imago (kecuali pada
stadia pupa) pada padi Rojolele transgenik galur 4.2.4-21-8-16-4 (fusi) dan DTcry (Azygous) terlihat konsisten tidak berbeda dibandingkan dengan padi bukan transgenik varietas Rojolele (Tabel 6.1).