Abstrak
Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman asli Asia Tenggara yang toleran terhadap cekaman aluminium (Al) pada tanah asam. Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Gen superokside dismutase (SOD) merupakan salah satu gen yang ekspresinya diinduksi Al. SOD diduga memiliki peran dalam ketahanan M. malabathricum. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengkarakterisasi dan menguji ekspresi cDNA MmCuZn-SOD yang menyandi copper/zinc superokside dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum. RNA total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang menyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi. Gen utuh MmCuZn-SOD yang berhasil diisolasi dengan metode RACE berukuran 824 pb, terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino dengan prediksi nilai pI 5.77. Analisis filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol tanaman tingkat tinggi. Berdasarkan analisis semi- kuantitatif RT-PCR menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, batang dan akar. Perlakuan Al menginduksi ekspresi MmCuZn- SOD baik dalam jaringan daun maupun akar.
Abstract
Melastoma malabathricum L. is an indigenous plant in tropical Southeast Asia with exceeding tolerance to aluminum (Al) stress in acid soils. Although increasing evidence suggests that Al-stress is accompanied by oxidative damages in plants, little has been described on the antioxidative components in this tolerant plant. In this study, the cDNA structure and expression profile of MmCuZn-SOD, encoding copper/zinc SOD (CuZn-SOD), are characterized in this plant. MmCuZn-SOD encoded a 152-amino acid polypeptide with a predicted pI value of 5.77, and showed high homology to other cytosolic CuZn-SODs from higher plants. Semi-quantitative RT-PCR showed that MmCuZn-SOD mRNA was highly expressed in the leaf tissues than stem and root. The Al treatment strongly induced the expression of MmCuZn-SOD both in the leaf and root tissues. These results suggested the fortification of the anti-oxidative defense system under Al stress in this acid soil-tolerant wild plant.
Keywords: aluminum stress, Melastoma malabathricum L., superoxide dismutase
Pendahuluan
Lahan asam merupakan salah satu lingkungan yang membatasi pertumbuhan tanaman khususnya tanaman pertanian. Sekitar 50% lebih dari lahan pertanian di dunia adalah lahan asam (Bot et al. 2000). Sementara
Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha tanah Podsolik Merah Kuning (CSAR 1997) yang bersifat asam dengan kelarutan aluminium (Al) yang tinggi. Aluminium pada lahan asam dapat bersifat toksik bagi tumbuhan (Delhaize & Ryan 1995), namun ada juga tumbuhan yang mampu hidup pada kondisi ekstrim ini (Watanabe et al. 2005).
Melastoma malabathricum L. adalah tumbuhan yang banyak ditemukan di daerah tropis Asia Tenggara terutama di lahan asam dengan konsentrasi Al yang tinggi. Tumbuhan ini mampu mengakumulasi Al di daun lebih dari 10.000 mg Al kg-1 berat daun kering, dan tidak meyebabkan gejala keracunan dan bahkan Al memacu pertumbuhannya (Watanabe et al. 1998). Tumbuhan ini diduga mempunyai sistem pertahanan terhadap cekaman asam dan Al, sehingga sangat penting sebagai sumber gen toleransi Al untuk merakit tanaman yang toleran terhadap asam dan kadar Al tinggi.
Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya diinduksi Al yang telah dilaporkan (Darko et al. 2004). Beberapa diantaranya adalah gen-gen yang mengkode enzim antioksidan, seperti glutathione-S-transferase (GST), ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide dismutase (SOD) (Ezaki et al. 2000). Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Ada tiga tipe enzim SOD sesuai dengan kofaktornya, yaitu copper/zinc (CuZn-SOD), besi (Fe- SOD), dan manganese (Mn-SOD). CuZn-SOD pada umumnya ditemukan di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di mitokondria dan Fe-SOD di kloroplas (Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992; Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al. 1998).
Basu et al. (2001) melaporkan ekspresi berlebih gen SOD pada Brassica napus yang tahan Al. Aktivitas enzim SOD juga meningkat dengan cekaman Al pada kedelai (Cakmak & Horst 1991) dan gandum (Darko et al. 2004). Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat (Perl- Treves et al. 1988), Brassica (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia (Alscher et al. 2002). Tiga gen CuZnSOD telah diisolasi dari tanaman Arabidopsis thaliana, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3. CSD1 dan CSD2 terekspresi pada akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan kloroplast. Sementara CSD3 di peroksisom karena ujung
karboksilnya mengandung tripeptida Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pada M. malabathricum L., telah diisolasi gen yang diduga terlibat dalam cekaman asam dan Al, yaitu multidrug resistance associated protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010), dan sitrat sintase (Mushofa 2011). Namun sampai saat ini belum ada informasi tentang gen CuZn-SOD pada Melastoma yang diduga juga terlibat dalam toleransi terhadap cekaman asam dan Al. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menganalisis ekspresi gen CuZn-SOD pada M. malabathricum L.
Bahan dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan tanaman untuk mengisolasi gen CuZn-SOD adalah M. malabathricum L. yang berasal dari habitat asli tanah asam Jasinga, Bogor, Indonesia. Analisis ekspresi gen MmCuZn-SOD menggunakan benih M. malabathricum L. yang diambil dari Jasinga-Bogor dan ditumbuhkan dalam chamber (16 jam terang dan 8 jam gelap, suhu sekitar 25°C - 35°C, dan kelembaban 50%-60%) di NAIST (Nara Institute of Science and Technology) Jepang. Setelah berumur 4 bulan, tanaman diperlakukan dengan cekaman Al. Cekaman dilakukan dengan menyiramkan larutan AlCl3 pH 4 pada media (tanah) tanaman dengan konsentrasi 0.4, 0.8, 1.6, dan 3.2 mM selama 7 hari.
Metode Penelitian
Isolasi RNA. Isolasi RNA mengikuti metode CTAB (Suharsono et al. 2008) yang dimodifikasi seperti pada BAB III.
Sintesis cDNA Total. cDNA total disintesis menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Komposisi sintesis cDNA total adalah 1µg RNA total, 1x RT Buffer, 20 pmol oligodT, 4 mM dNTP, 10mM DTT, 40 U enzim SuperScript TMIII RTase dan air DEPC dengan volume reaksi 20 µl. Sintesis cDNA dilakukan pada suhu 42 oC selama 50 menit.
Isolasi gen CuZn-SOD. Fragmen cDNA CuZn-SOD telah diisolasi dengan PCR menggunakan sepasang primer degenerate (primer forward SODF3; 5’-ATG GTG AAG GCT GTG GCW GTT YTK A- 3’, dan primer reverse
SODR4; 5’-ADG GCT GCA RRC CAA TRA TAC CAC A-3’) yang didesain berdasarkan cDNA copper/zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari beberapa tumbuhan dikotiledon. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% (w/v) dengan larutan penyangga 1x TAE (0,9 mM Tris-HCl dan 2 mM EDTA pH 7.6). Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan di atas transluminator UV (Hoever) dan difoto menggunakan kamera digital yang dihubungkan ke komputer dengan menggunakan program Digidoc. Selanjutnya fragmen cDNA disisipkan ke dalam vektor pGEM®-T-Easy (Promega, Madison, WI, USA) mengikuti prosedur Promega. Klon putih diverifikasi dengan PCR, kemudian diisolasi plasmidnya. Plasmid diverifikasi lagi menggunakan enzim EcoR1. Plasmid diurutkan menggunakan DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, Massachusetts, USA). ABI Prism Model 3100 Versi 3.7
Ujung 5’- dan 3’- dari cDNA CuZn-SOD diisolasi dengan metode 5’- RACE dan 3’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) System ( Invitrogen, California, USA) mengikuti prosedur Invitrogen. Primer-primer yang digunakan telah didesain dari urutan cDNA fragmen MmCuZn-SOD. Fragmen cDNA hasil amplifikasi dengan 3’- dan 5’- RACE disisipkan ke pGEM-T Easy vektor (Promega, Madison, WI, USA) dan ditransformasi ke E. coli strain DH5α. Klon target diurutkan dengan DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, Massachusetts, USA).
Analisis urutan cDNA CuZn-SOD. Urutan basa nukleotida dan deduksi asam amino CuZn-SOD dianalisis homologinya dengan database gen di GenBank menggunakan program NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Analisis kesamaan deduksi asam aminonya dengan CuZn-SOD lain menggunakan program Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html), filogenetik menggunakan program MEGA4, dan analisis hidrofobisitas dengan program FASTA (http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1).
Analisis ekspresi gen CuZn-SOD . Analisis ekspresi gen CuZn-SOD pada M.malabathricum dengan metode semi-quantitative reverse transcriptase- polymerase chain reaction (RT-PCR). RNA diisolasi dari daun dan akar M.malabathricum yang telah diperlakukan dengan cekaman aluminium. cDNA total disintesis menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Ekspresi gen CuZn-SOD diuji dengan sepasang primer spesifik MmCuZn-SOD dengan target berukuran 200 pb (MmCuZn-SOD-F2: 5’-CCG TTG GAG ATG
ACG GTA CT; MmCuZn-SOD-R1 : 5’-TTA ACC CTG GAG ACC AAT GAT- 3’). Untuk standar ekspresi menggunakan primer spesifik aktin (forward, 5’-ATG GTN GGN ATG GGN CAR AA-3’; reverse, 5’-ATR TCN ACR TCR CAW TCA TDA T- 3’).
Hasil dan Pembahasan
Isolasi RNA Total
RNA total dari M. malabathricum telah berhasil diisolasi dari daun, batang, pucuk dan akar (Gambar 10). Pengujian kemurnian RNA total dari kontaminan protein menunjukkan bahwa RNA total daun, batang, pucuk, dan akar yang diperoleh mempunyai rasio OD260/OD280 1.85, 1.82, 1.91 dan 1.87 berturut-turut. Analisis keutuhan RNA total yang dilakukan dgn elektroforesis menunjukkan bahwa RNA yang telah diisolasi dalam keadaan utuh karena terdapat 2 pita rRNA (28S dan 18S).
Gambar 10. RNA total dari daun (1), batang (2), pucuk (3) dan akar (4).
Isolasi Fragmen cDNA CuZn-SOD dengan PCR
RNA total yang telah diisolasi digunakan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA melalui proses transkripsi balik. Reverse transcription (RT) PCR dengan primer oligo(dT)n, hanya mRNA yang dapat disintesis menjadi cDNA melalui transkripsi balik, karena mRNA mempunyai poli(A) pada ujung 3’ sedangkan rRNA dan tRNA tidak mempunyai poli(A). PCR cDNA total pucuk Melastoma menggunakan spesifik SODF3 dan SODR4 menghasilkan fragmen cDNA berukuran sekitar 450 pb. Fragmen ini disebut sebagai fragmen MmCuZn-SOD yang merupakan fragmen kandidat gen penyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum L.
Fragmen MmCuZn-SOD telah diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy di tengah gen lacZ dan hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α, yang kemudian diseleksi di media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG. E. coli yang dapat bertahan hidup di media seleksi
mengandung plasmid, dan koloni E. coli yang berwarna putih di media seleksi adalah E. coli yang mengandung plasmid rekombinan, dan yang berwarna biru adalah E. coli yang mengandung plasmid non-rekombinan. Gen lacZ menyandi
β-galactosidase (β-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Bila fragmen MmCuZn-SOD menyisip di dalam gen lacZ, maka gen lacZ tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E.coli berwarna putih. Bila tidak ada penyisipan pada lacZ, maka koloni yang terbentuk berwarna biru.
Adanya fragmen MmCuZn-SOD di dalam koloni E. coli putih dikonfirmasi dengan PCR-koloni. PCR-koloni terhadap koloni putih menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 450 pb yang menunjukkan bahwa koloni putih mengandung fragmen MmCuZn-SOD. Untuk memastikan fragmen MmCuZn- SOD adalah kandidat gen CuZn-SOD, DNA plasmid rekombinan telah diisolasi dari koloni putih, kemudian dilakukan pengurutan DNA.
Pengurutan DNA terhadap fragmen MmCuZn-SOD menghasilkan 457 pb (Gambar 11). Analisis kesejajaran berdasarkan urutan nukleotida dengan bank data di GenBank dengan program BLASTn menunjukkan bahwa fragmen MmCuZn-SOD mempunyai kesamaan 83% dengan CuZn-superoksida dismutase Codonopsis lenceolata , 82% dengan CuZn-SOD Populus trichocarpa dan cytosolic CuZn-SOD Mesembryanthemum crystallinum, dan 81% dengan cytoplasmic CuZn-SOD P. suaveolens dan CuZn-SOD Arachis hypogaea (Tabel 2).
1 TTGGTGAAGG CTGTGGCTGT TCTTGGCAAC AGCGAGGGTG TGAGCGGCAC TGTCTACTTC 61 ACTCAAGAAG GAGATGGACC CACTACTGTG ACTGGGAGTC TTTCAGGCTT GAAGCCTGGA 121 CTCCACGGTT TCCATGTCCA TGCTCTTGGG GACACTACCA ACGGCTGCAT GTCTACTGGA 181 CCTCACTTCA ATCCTGCCGG AAAGGAGCAT GGTGCCCCTG AAGATGAGAA CCGGCATGCA 241 GGTGACTTGG GCAATGTCAC CGTTGGAGAT GACGGTACTG CTACATTCAC CATCACAGAC 301 AAGCAGATTC CTCTCTTTGG ACCTAACTCT ATTATTGGAA GGGCTGTTGT TGTCCATGCT 361 GATCCTGATG ATCTCGGAAA GGGTGGCCAT GAACTCAGCA AGTCGACTGG CAATGCTGGT 421 GGAAGGATTG CTTGTGGTAT CATTGGTCTG CAGCCTT
Gambar 11. Urutan basa fragmen MmCuZn-SOD .
Adanya kesamaan yang tinggi (81%-83%) fragmen MmCuZn-SOD dengan urutan gen CuZn-SOD tumbuhan lain yang telah lebih dahulu diisolasi (Genbank) menunjukkan bahwa fragmen MmCuZn-SOD yang telah diisolasi dari M.malabathricum adalah kandidat gen CuZn-SOD.
Tabel 2. Analisis kesejajaran fragmen nukleotida MmCuZn-SOD dengan program BLASTn.
No Aksesi Deskripsi Score Query
coverage E- value
Max Ident 1 AY833718.1 Codonopsis lanceolata CuZn
superoxide dismutase (SODCc) mRNA, complete cds
327 98% 2e-86 83%
2 EF405967.1 Populus trichocarpa Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) mRNA, complete cds
313 98% 4e-82 82%
3 U80069.1 Mesembryanthemum crystallinum
cytosolic CuZn-superoxide dismutase (SODcyt1) mRNA, complete cds
309 98% 4e-81 82%
4 DQ481231.1 Populus suaveolens cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase mRNA, complete cds
304 98% 2e-79 81%
5 DQ097721.1 Arachis hypogaea Cu-Zn superoxide dismutase mRNA, complete cds
304 98% 2e-79 81%
Isolasi gen utuh MmCuZn-SOD
Berdasarkan fragmen MmCuZn-SOD yang telah diperoleh (Gambar 11), dirancang primer untuk mengisolasi ujung 5’ dan 3’ gen MmCuZn-SOD, yaitu primer SOD-3race (ACT TCA CTA CAA GAA GGA GAT GGA C) dari basa ke 56 sampai dengan 79, SOD-3race-nested (ATG TCT ACT GGA CCT CAC TTC AAT C) dari basa ke 169 sampai dengan 193, SOD-5race1 (AGT CGA CTT GCT GAG TTC AT) reverse komplemen dari basa ke 389 sampai dengan 408 , dan SOD-5race2 (GTC TGT GAT GGT GAA TGT AGC AGT A ) dari basa ke 276 sampai dengan 300. Gen utuh MmCuZn-SOD dari M.malabathricum telah berhasil diisolasi dengan ukuran sebesar 824 pb dengan metode 5’ RACE dan 3’RACE (Gambar 12) dan telah disisipkan di plasmid pGEMT-Easy yang dinamakan pGEM-MmCuZn-SOD (Gambar 13).
Urutan nukleotida MmCuZn-SOD telah didaftarkan ke bank data GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500685. cDNA utuh MmCuZn- SOD terdiri dari 459 pb open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino, mulai dari kodon awal ATG (nukleotida ke-115) dan berakhir pada kodon akhir TAA (nukleotida ke-571). MmCuZn-SOD memiliki sinyal poliadenilasi putatif AATAAT, 67 pb setelah kodon akhir. Poliadenilasi dikenal sebagai mekanisme regulasi yang utama pasca transkripsi pada eukariot.
cDNA ujung 5’ dari MmCuZn-SOD mempunyai urutan kodon akhir TAA (posisi nukleotida 94-96) di depan kodon awal metionin yang ada pada posisi 115-117, yang merupakan indikasi bahwa MmCuZn-SOD tidak memiliki peptida transit untuk target kloroplas. Hal ini menunjukkan bahwa lokasi protein yang
ditranslasi dari gen MmCuZn-SOD yang telah diisolasi adalah di sitosol bukan di kloroplas. Deduksi asam amino MmCuZn-SOD memiliki berat molekul sekitar 15.3 kDa dengan perkiraan titik isoelektrik adalah 5.77.
ttgaacgaacgacacaacaacgacacaacagtcctcatcgtactgctcggcgtcgtcttc ccattttctcttcgaactcgataaggggtgctctgagatcacaggattaagaggatggtg M V aaggctgtggttgttcttggcaacagcgagggtgtgagcggcactgtctacttcactcaa K A V V V L G N S E G V S G T V Y F T Q gaaggagatggacccactactgtgactgggagtctttcaggcttgaagcctggactccac E G D G P T T V T G S L S G L K P G L H ggtttccatgtccatgctcttggggacactaccaacggctgcatgtctactggacctcac G F H V H A L G D T T N G C M S T G P H ttcaatcctgccggaaaggagcatggtgcccctgaagatgagaaccggcatgcaggtgac F N P A G K E H G A P E D E N R H A G D ttgggcaatgtcaccgttggagatgacggtactgctacattcaccatcacagacaagcag L G N V T V G D D G T A T F T I T D K Q attcctctctttggacctaactctattattggaagggctgttgttgtccatgctgatcct I P L F G P N S I I G R A V V V H A D P gatgatctcggaaagggtggccatgaactcagcaagtcgactggcaatgctggtggaagg D D L G K G G H E L S K S T G N A G G R attgcttgtgggatcattggtctccagggttaagctacctctgctacgcttccgccatgt I A C G I I G L Q G - ctcctagaggtgctatgttggactgtttaccttgtctcgaataattgtggcaccctgtct cccttatgcttagaactttctgctcttgcgattgtacaaaatggtgcaaatgtgctgagt ataatttcagtgtaaaaccaaaccgggtgttactgatcttgggtttagacaagtggttgt tgttgggttggatctactttgcttagcttaacagtggatcatgcaaaaaaaaaaaaaaaa
Gambar 12. Urutan nukleotida gen utuh MmCuZn-SOD dan deduksi asam aminonya, dengan ORF (open reading frame) dari nukleotida ke-115 sampai dengan 573. Huruf tertulis miring adalah kodon akhir pada 5’UTR MmCuZn-SOD. Huruf dalam kotak menunjukkan kodon awal dan kodon akhir. Nukleotida yang digaris bawahi adalah sinyal poliadenilasi putatif.
Gambar 13. Peta plasmid pGEM-MmCuZn-SOD (3839 pb) yang terdiri dari vektor pGEM-T Easy (3015 pb) dan cDNA MmCuZn-SOD (824pb).
Analisis Kemiripan
Deduksi asam amino MmCuZn-SOD telah dibandingkan dengan protein CuZn-SOD baik yang sitosol maupun kloroplas dari tanaman Gossypium hirsutum dan Arabidopsis thaliana (Gambar 14). Urutan asam amino MmCuZn- SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan protein CuZn-SOD sitosol dari Gossypium hirsutum (ABA00453; kemiripan 92%) dan Arabidopsis thaliana (NP172360; kemiripan 85%). Sebaliknya, MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang lebih rendah dengan CuZn-SOD kloroplas Gossypium hirsutum (ACC93637; kemiripan 68%) maupun Arabidopsis thaliana (AAD10208; kemiripan 66%).
Urutan deduksi asam amino MmCuZn-SOD juga memiliki residu-residu yang dibutuhkan untuk koordinat copper (His-42, -45, -62, dan -119) dan zinc (His-62, -70, -79, dan Asp-82), demikian juga dengan dua residu sistein (C-56 dan C-145) yang merupakan bentuk ikatan disulfida tunggal. Residu-residu tersebut merupakan urutan yang konservatif yang telah dilaporkan ada pada gen CuZn-SOD (Shin et al. 2005). Residu konservatif sistein berperan penting untuk fungsi enzim dan proses signaling, khususnya respon terhadap lingkungan.
Gambar 14. Kesejajaran urutan asam amino MmCuZn-SOD dengan asam amino CuZn-SOD sitosol dan kloroplast dari Gossypium hirsutum dan Arabidopsis thaliana. Residu asam amino yang terkonservasi berada dalam kotak. Residu domain Cu ditandai dengan segitiga tertutup, residu domain Zn ditandai dengan segitiga terbuka, dan residu sistein dengan lingkaran tertutup.
Berdasarkan analisis hirofobisitas, MmCuZn-SOD menunjukkan profil yang sama dengan CuZn-SOD sitosol Gossypium hirsutum (Gambar 15). Kurva
yang berada di atas 0 menunjukkan fragmen yang bersifat hidrofobik dan dibawah 0 bersifat hidrofilik. Hasil analisis ini menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD bersifat hidrofilik, karena sebagian besar dari kurva profil hidrofobisitas Kyte & Doolittle berada pada daerah di bawah 0.
Gambar 15. Profil hidrofobisitas MmCuZn-SOD dan CuZn-SOD sitosol Gossypium hirsutum menggunakan skala Kyte & Doolittle.
Analisis filogenetik menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD mengelompok menjadi satu group dengan CuZn-SOD sitosol dan terpisah dengan group CuZn- SOD kloroplas (Gambar 16). Hasil analisis ini semakin menguatkan bahwa MmCuZn-SOD adalah CuZn-SOD sitosol.
Gambar 16. Hubungan filogenetik MmCuZn-SOD dengan CuZn-SOD sitosol dan kloroplas dari R. communis (EEF49740), M. xiaojinensis (AT66935), G.hirsutum (ABA00453), P. trichocarpa (ABK93317), M. truncatula (ACJ83988), A. thaliana (NP172360), A.thaliana-chl (AAD10208), G. hirsutum-chl (ACC93637), S. lycopersicum-chl (P14831), dan B. gymnorhiza-chl (CAM98444).
Analisis Ekspresi Semi-kuantitatif MmCuZn-SOD berdasarkan RT-PCR
Pola ekspresi MmCuZn-SOD pada berbagai jaringan tanaman M. malabthricum telah diuji menggunakan analisis reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) dengan primer forward (MmCuZn-SOD-F1: 5’-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT) dan reverse (MmCuZn-SOD-R1 : 5’-TTA ACC CTG GAG ACC AAT GAT- 3’) yang telah didesain dari ORF MmCuZn-SOD . Gen MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, akar dan batang ( Gambar 17). Ekspresi pada daun lebih tinggi dibanding jaringan lainnya. Untuk membuktikan bahwa pita yang terdeteksi adalah mRNA bukan DNA genom, maka cDNA tanpa enzim RT (reverse transcriptase) digunakan sebagai kontrol. Jika ada pita terdeteksi pada kontrol menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi terkontaminasi DNA. Tidak adanya pita yang terdeteksi pada kontrol menunjukkan bahwa tidak ada kontaminasi DNA genom pada ekspresi tersebut. Kleibenstein et al. (1998) telah melaporkan bahwa gen AtSOD2 yang merupakan gen SOD yang diisolasi dari Arabidopsis, terekspresi pada daun, batang dan akar tanaman Arabidopsis.
Gambar 17. Pola ekspresi MmCuZn-SOD pada daun (L), akar (R), dan batang (S). (+ =cDNA dengan RT, - = cDNA tanpa RT sebagai kontrol).
Ekspresi gen MmCuZn-SOD pada Melastoma yang mendapat perlakuan cekaman aluminium telah diamati pada jaringan daun (Gambar 18A) dan akar (Gambar 18B). Analisis RT-PCR menunjukkan bahwa tingkat ekspresi MmCuZn- SOD meningkat dengan perlakuan cekaman Al baik pada daun maupun akar. Pada kedua jaringan tersebut ekspresi MmCuZn-SOD berangsur meningkat sejalan dengan peningkatan konsentrasi AlCl3 yang diberikan, dan ekspresi tertinggi telah nampak pada perlakuan 0.8 sampai 3.2 mM AlCl3. Hasil ini menunjukkan bahwa Al menginduksi ekspresi gen CuZn-SOD sitosol pada M. malabathricum.
Gambar 18. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD dengan cekaman aluminium pada M. malabathricum. A. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD pada daun, B. Pola ekspresi gen MmCuZn-SOD pada akar. Gen aktin M. malabathricum digunakan sebagai kontrol internal untuk menstandarkan jumlah RNA yang digunakan.
Boscolo et al. (2003) telah melaporkan bahwa aktivitas SOD pada akar tanaman yang sensitif Al meningkat hampir sejalan dengan peningkatan perlakuan konsentrasi Al3+. Peningkatan aktivitas SOD ini menunjukkan bahwa Al3+ menginduksi pembentukan radikal superoksida. Hal ini mengindikasikan bahwa Al3+ menginduksi sel untuk inisiasi sintesis SOD. Hasil yang sama telah dilaporkan pada tanaman kedelai (Cakmak & Horst 1991; Du et al. 2010 ). Menurut Du et al. (2010) peningkatan aktivitas enzim antioksidan SOD merupakan salah satu mekanisme toleransi Al.
Simpulan
Gen CuZn-SOD dari M. malabathricum (MmCuZn-SOD) telah berhasil diisolasi dan berukuran 840 pb. Gen MmCuZn-SOD terdiri dari 459 pb ORF yang menyandi 152 deduksi asam amino berdasarkan analisis blastp. Berat massa proteinnya sekitar 15.3 kDa dengan perkiraan titik isoelektrik adalah 5.77.
MmCuZn-SOD adalah CuZn-SOD sitosol. MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, akar dan batang. Perlakuan cekaman Al meningkatkan ekspresi MmCuZn-SOD pada daun dan akar M.malabathricum. Cekaman Al menginduksi ekspresi gen CuZn-SOD sitosol pada M.malabathricum.