Aidawati N. 2006. Keanekaragaman Begomovirus pada Tomat dan Serangga Vektornya, Bemicia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae), serta Pengujian Ketahanan Genotipe Tomat Terhadap Strain Begomovirus [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Aidawati N, Hidayat P, Hidayat SH, Suseno R, Sujiprihati S. 2007. Response of various tomato genotypes to Begomovirus infection and its improved diagnostic. Hayati J Biosci14:93-97.
Agrios GN. 2005.Plant Pathology.Elsevier Academic Press.723-756 p.
Ala-Poikela M, Svenson E, Rojas A, Horko T, Paulin L, Valkonen JPT, Kvarnheden A. 2005. Genetic diversity and mixed infections of begomoviruses infecting tomato, pepper and cucurbit crops in Nicaragua.
Plant Pathol54:448-4459.
Ambrozevicius LP, Calegario RF, Fontes EPB, Carvalho MG, Zerbini FM. 2002. Genetic diversity of begomovirus infecting tomato and associated weeds in Southeastern Brazil.Fitopatol Brasil27:372-377.
Astier S, Albouy J, Maury Y, Robaglia C, Lecoq H. 2001. Principles of Plant Virology, Genom, Pathogenicity,Virus Ecology. Science Publishers. 390- 395.
Bos L. 1990. Pengantar Virologi Tumbuhan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. hlm 20-28.
Briddon RW, Robertson I, Markham PG, Stanley J. 2004. Occurrence of Sout African cassava mosaic virus (SACMV) in Zimbabwe. Plant Pathol
53(2):233-234.
Clavarie JM, Notradame J. 2003.Bioinformatics for Dummies. Wiley Publishing Inc.
Czosnek H, Ber R, Navot N, Zamir D, Antignus Y, Cohen S. 1988. Detection of tomato yellow leaf curl virus in lysates of plants and insects by hybridization with a viral DNA probe.Plant Dis72:949-951.
Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue. Focus
12:13-15.
Fauziah R. 2010. Karakterisasi Beberapa Genotipe Cabai (Capsicum spp.) dan Mekanisme Ketahanannya Terhadap Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Keriting Kuning [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. 2005. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Viruses. Virology Division International Union of Microbiological Societies. London and USA: Elsevier Inc. 309-325 p.
Fermentas. 2006. QuickProtocol™GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit. Amersham Pharmacia Biotech.
Glick BR, Pasternak JJ. 1998. Molecular biotechnology: principle and applications of recombinant DNA. 2nd edition.United States of America: American Society for Microbiology.
Gilbertson RL, Faria JC, Ahlquist P, Maxwel DP. 1993. Genetic diversity in geminivirus causing bean mosaic disease.Phytophatology83:709-715. Gilbertson RL, Hidayat SH, Martinez RT, Leong SA, Faria JC, Morales F,
Maxwell DP. 1991. Differentiation of Bean Infecting Geminiviruses by Nucleic Acid Hybridization Probes and Aspects ofBean Golden Mosaicin Brazil.Plant Dis75:336-342.
Ganefianti ED. 2010. Genetik Ketahanan Cabai terhadap Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Keriting Kuning dan Arah Pemuliaannya [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Hidayat SH, Chatchawankanpanich O, Rusli E, Aidawati N. 2006. Begomovirus
associated with pepper yellow leaf curl virus in West Java, Indonesia.
Indon Microbiol11(2):87-89.
Hull R. 2002.Matthews’ Plant Virology. 4thEdition. San Diego: Academic Press. ICTVdB Management. 2006. Begomovirus. In: ICTVdB - The Universal Virus
Database, version 4. Büchen-Osmond, C. (Ed), New York, USA. ColumbiaUniversity.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/00.02 9.0.03.htm. [28 April 2008].
Kalshoven LGS. 1981. Pests of Crops in Indonesia. Jakarta: PT. Ikhtiar baru Van Hoeve.
Keller GH, Mark MM. 1992. DNA Probes. United States and Canada: Stockon Press. 1-20 p .
Kitamura K, Murayama A, Ikegami M. 2004. Evidence for recombination among isolates of tobacco eaf curl japan virus and honeysuckle yellow vein mosaic virus. Arch Virol149:1221-1229.
Yan L, Bo S, Xifeng W, Chuanlin Z, Guanghe Z. 2007. Three digoxigenin-labeled cDNA probes for specific detection of natural population of Barley yellow
dwarf viruses in China by dot-blot hybridization. Virol Methods 145:22- 29.
Mehta P, Wyman JA, Nakhla MK, Maxwel DP. 1994. Transmission of tomato yellow leaf curl by Bemicia tabaci (Homoptera; Aleyrodidae). Econ Entomol87:1291-1297.
Meliansyah R. 2010. Peranan Gulma Sebagai Inang Alternatif Geminivirus di Pertanaman Cabai di Jawa [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Monci F, Sánchez-Campos S, Navas-Castillo J, Moriones E. 2002. A Natural Recombinant between the Geminiviruses Tomato yellow leaf curl Sardinia virus and Tomato yellow leaf curl virus Exhibits a Novel Pathogenic Phenotype and Is Becoming Prevalent in Spanish Populations. Virology
303(2):317-326
Morin S, Ghanim M, Sobol L, Czosnek H. 2000. The GroEL protein of the whiteflyBemisia tabaciinteracts with the coat protein of transmissible begomovirus in the yeast two-hybrid system.Virology276:404-416.
Prasanna HC, Rai M. 2007. Detection and frequency of recombination in tomato- infecting begomoviruses of South and Southeast Asia.Virology4:111 Pico B. 1999. Improved diagnostic technique for tomato yellow leaf curl virus in
tomato breeding programs.Plant Dis74:248-250.
Polston JE, Anderson PK. 1997. The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in Western Hemisphere.Plant Dis81:1358-1369. Potter JL, Nakhla MK, Mejia L, Maxwell DP. 2003. PCR and DNA hybridization
methods for specific detection of bean-infecting begomoviruses in the America and Caribbean.Plant Dis87:1205-1212.
Promega. 2007. Technical Manual pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems. Instruction for Use of Products A1360, A1380, A3600 and A3610. USA: Promega Coorporation.
Qiagen. 2002. QIAquick ® Spin Handbook For QiAquick PCR Purification Kit QIAquick Nucleotide Removal Kit QIAquick Gel Extraction Kit..
QIAGEN. GmbH, Germany.
Roberts IM, Robinson DJ, Harrison BD. 1984. Serological relationship and genome homologies among geminiviruses.Ann App Biol105:483-493. Rohde, C. 1994. Plasmid isolation from bacteria: some fast procedures. Technical
Rojas MR, Gilbertson RL, Russel DR, Maxwell DP. 1993. Use of Degenerate Primers in the Polymerase Chain Reaction to Detect Whitefly-Transmitted Geminiviruses.Plant Dis77:340-347.
Rom M, Antignus Y, Gidoni D, Pilowsky M, Cohen. 1993. Accumulation of tomato yellow leaf curl virus DNA in tolerant and susceptible tomato lines.Plant Dis77:253-257.
Rubio L, Herrero JR, Sarrio J, Guerri J. 2003. A new approach to evaluate relative resistance and tolerance tomato cultivars to geminiviruses causing the tomato yellow leaf curl virus disease in Spain.Plant Pathol52:763-769. Santoso TJ. 2008. Identifikasi Begomovirus Indonesia pada Tomat dan Analisis
Deiverssitas Genetik GenAV1serta Pemanfaatannya untuk Pengembangan Tanaman Tahan Virus [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Springer Harbor Laboratory Press. Saunders GC, Parkes HC. 1999. Analytical Molecular Biology: Quality and
Validation.The Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK.
Sudiono. 2001. Deteksi dan identifikasi virus gemini pada tanaman tomat [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Sudiono, Hidayat SH, Suseno R, Sosromarsono S. 2004. Penggunaan teknik PCR dan RFLP untuk deteksi dan analisis virus gemini pada tanaman tomat yang berasal dari berbagai daerah di Jawa Barat dan Lampung. HPT- Tropika4:89-93.
Suharsono, Widyastuti U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Dasar Pengklonan Gen. Bogor: Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor.
Sulandari S, Suseno R, Hidayat SH, Harjosudarmo J, Sosromarsono S. 2006. Deteksi dan kajian kisaran inang penyebab penyakit daun keriting kuning cabai.Hayati13(1):1-6.
Trisno J. 2010. Keanekaragaman Virus dan Peranan Rhizobakteria Indigenus dari Geografis Berbeda dalam Mempengaruhi Perkembangan Penyakit Daun Kuning Keriting Cabai (Capsicum annuum L.) [disertasi]. Padang: Program Pascasarjana, Universitas Andalas.
Van Regenmortel MHV, Faquet CM, Bishop DHL, Carstens E, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Priangle CR, Wickner RB. 2000. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Viruses.
Seventh Report of The International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press.
Voyles BA. 2002.The Biology of Viruses. 2ndedition. Boston: McGraw Hill. Zhou YC, Noussourou M, Kon T, Rojas MR, Jiang H, Chen LF, Gamby K, Foster
R, Gilbertson RL. 2008. Evidence of local evolution of tomato-infecting begomovirus species in West Africa: characterization of tomato leaf curl Mali virus and tomato yellow leaf crumple virus from Mali. Arch Virol
Lampiran 1 Hasil pengurutan nukleotida gen protein selubungBegomovirushasil amplifikasi PCR
1 ATATTTTATA AGACGAAGCG ACCCGCCGAT TTGGTCATTT CCACTCCCGC CTCGAAGGTA CGTCGCCGTC TGAACTTCGA CACCCCCGCG ATGAGCCGTG
101 CTGCTGCCCC CACTGTCCTC GTCACCAACA GAAGAAGGTC ATGGACCAAC AGGCCCATGT ACCGCAAGCC CAGACTATAC AGAATGTACA GAACCCCTGA
201 TGTACCCAAA GGTTGTGAAG GCCCATGTAA AGTCCAATCG TATGAACAGA GGCACGACAT ATCCCATGTA GGTAAAGTAT TATGTGTTAG TGATGTCACC
301 CGTGGTAATG GGCTTACCCA TCGTGTTGGT AAGAGATTCT GTGTGAAGTC CGTTTATGTA TTGGGTAAAA TATGGATGGA TGAAAATATT AAAACCAAGA
401 ACCATACAAA CACTGTGATG TTTTATCTTG TTCGTGACAG AAGGCCCTTT GGTAGTGCTA TGGATTTTGG ACAGGTGTTT AACATGTATG ATAATGAGCC
501 CAGTACTGCT ACTATCAAGA ACGATCTTCG AGAATCGTTA TCAAGTTTTA AGAAAATTCA CTTCAACAGT CCACAGGTGG TCAATATGCT TCCAAAGGAA
601 CAGTCGTTGG GTCAGGAAAA TTTATGAAGA TTAATAATTA TGTAGTTTAT AATCATCAAG AAGCTGCTAA GTATTGACAA TCATACTGAG AATGCCTTGT
701 TATTGTATAT TGGCTTGTAC TCATGCCAGT AATCCAGTGT ATGCTAACCT TTGAAGATCA GAATCTATTT CTATGATTCT GTCCAAAATA GAAAAATACG
Lampiran 2 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar A
1 TAATTCTAGA TGTCGAAGCG ACCCGCCGAT ATAGTCATTT CCACTCCCGC CTCGAAGGTA CGTCGCCGTC TGAACTTCGA CACCCCCGCG ATGAGCCGTG
101 CTGCTGCCCC CACTGTCCTC GTCACCAACA GAAGAAGGTC ATGGACCAAC AGGCCCATGT ACCGCAAGCC CAGACTATAC AGAATGTACA GAACCCCTGA
201 TGTACCCAAA GGTTGTGAAG GCCCATGTAA AGTCCAATCG TATGAACAGA GGCACGACAT ATCCCATGTA GGTAAAGTAT TATGTGTTAG TGATGTCACC
301 CGTGGTAATG GGCTTACCCA TCGTGTTGGT AAGAGATTCT GTGTGAAGTC CGTTTATGTA TTGGGTAAAA TATGGATGGA TGAAAATATT AAAACCAAGA
401 ACCATACAAA CACTGTGATG TTTTATCTTG TTCGTGACAG AAGGCCCTTT GGTAGTGCTA TGGATTTTGG ACAGGTGTTT AACATGTATG ATAATGAGCC
501 CAGTACTGCT ACTATCAAGA ACGATCTTCG AGAATCGTTA TCAAGTTTTA AGAAAATTCA CTTCAACAGT CCACAGGTGG TCAATATGCT TCCAAAGGAA
601 CAGTCGTTGG GTCAGGAAAA TTTATGAAGA TTAATAATTA TGTAGTTTAT AATCATCAAG AAGCTGCTAA GTATTGACAA TCATACTGAA AATGCCTTGT
701 TATTGTATAT TGGGTTGTAC TCATGCCAGT AATCCCGTGT ATGCTTACTT TTGAAGATCA GAATCTATTT CTATGATTCT GTTCAAAATT AAGAATTCGG
Lampiran 3 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar B
1 TAATTCTAGA TGTCGAAGCG ACCCGCCGAT ATAGTCATTT CCACTCCCGC CTCGAAGGTA CGTCGCCGTC TGAACTTCGA CACCCCCGCG ATGAGCCGTG
101 CTGCTGCCCC CACTGTCCTC GTCACCAACA GAAGAAGGTC ATGGACCAAC AGGCCCATGT ACCGCAAGCC CAGACTATAC AGAATGTACA GAACCCCTGA
201 TGTACCCAAA GGTTGTGAAG GCCCATGTAA AGTCCAATCG TATGAACAGA GGCACGACAT ATCCCATGTA GGTAAAGTAT TATGTGTTAG TGATGTCACC
301 CGTGGTAATG GGCTTACCCA TCGTGTTGGT AAGAGATTCT GTGTGAAGTC CGTTTATGTA TTGGGTAAAA TATGGATGGA TGAAAATATT AAAACCAAGA
401 ACCATACAAA CACTGTGATG TTTTATCTTG TTCGTGACAG AAGGCCCTTT GGTAGTGCTA TGGATTTTGG ACAGGTGTTT AACATGTATG ATAATGAGCC
501 CAGTACTGCT ACTATCAAGA ACGATCTTCG AGAATCGTTA TCAAGTTTTA AGAAAATTCA CTTCAACAGT CCACAGGTGG TCAATATGCT TCCAAAGGAA
601 CAGTCGTTGG GTCAGGAAAA TTTATGAAGA TTAATAATTA TGTAGTTTAT AATCATCAAG AAGCTGCTAA GTATTGACAA TCATACTGAA AATGCCTTGT
701 TATTGTATAT TGGGTTGTAC TCATGCCAGT AATCCCGTGT ATGCTTACTT TTGAAGATCA GAATCTATTT CTATGATTCT GTTCAAAATT AAGAATTCGG
Lampiran 4 Hasil penyejajaran dan kladogram terhadap ketiga sekuen gen protein selubungBegomovirus: rekombinan isolat Ngluwar A (A) dan
rekombinan isolat Ngluwar B (B) dan hasil amplifikasi PCR (C)
A TAATTCTAGATGTCGAAGCGACCCGCCGATATAGTCATTTCCACTCCCGCCTCGAAGGTA 60 B TAATTCTAGATGTCGAAGCGACCCGCCGATATAGTCATTTCCACTCCCGCCTCGAAGGTA 60 C ATATTTTATAAGACGAAGCGACCCGCCGATTTGGTCATTTCCACTCCCGCCTCGAAGGTA 60 *** ** * * ***************** * *************************** A CGTCGCCGTCTGAACTTCGACACCCCCGCGATGAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTC 120 B CGTCGCCGTCTGAACTTCGACACCCCCGCGATGAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTC 120 C CGTCGCCGTCTGAACTTCGACACCCCCGCGATGAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTC 120 ************************************************************ A GTCACCAACAGAAGAAGGTCATGGACCAACAGGCCCATGTACCGCAAGCCCAGACTATAC 180 B GTCACCAACAGAAGAAGGTCATGGACCAACAGGCCCATGTACCGCAAGCCCAGACTATAC 180 C GTCACCAACAGAAGAAGGTCATGGACCAACAGGCCCATGTACCGCAAGCCCAGACTATAC 180 ************************************************************ A AGAATGTACAGAACCCCTGATGTACCCAAAGGTTGTGAAGGCCCATGTAAAGTCCAATCG 240 B AGAATGTACAGAACCCCTGATGTACCCAAAGGTTGTGAAGGCCCATGTAAAGTCCAATCG 240 C AGAATGTACAGAACCCCTGATGTACCCAAAGGTTGTGAAGGCCCATGTAAAGTCCAATCG 240 ************************************************************ A TATGAACAGAGGCACGACATATCCCATGTAGGTAAAGTATTATGTGTTAGTGATGTCACC 300 B TATGAACAGAGGCACGACATATCCCATGTAGGTAAAGTATTATGTGTTAGTGATGTCACC 300 C TATGAACAGAGGCACGACATATCCCATGTAGGTAAAGTATTATGTGTTAGTGATGTCACC 300 ************************************************************ A CGTGGTAATGGGCTTACCCATCGTGTTGGTAAGAGATTCTGTGTGAAGTCCGTTTATGTA 360 B CGTGGTAATGGGCTTACCCATCGTGTTGGTAAGAGATTCTGTGTGAAGTCCGTTTATGTA 360 C CGTGGTAATGGGCTTACCCATCGTGTTGGTAAGAGATTCTGTGTGAAGTCCGTTTATGTA 360 ************************************************************ A TTGGGTAAAATATGGATGGATGAAAATATTAAAACCAAGAACCATACAAACACTGTGATG 420 B TTGGGTAAAATATGGATGGATGAAAATATTAAAACCAAGAACCATACAAACACTGTGATG 420 C TTGGGTAAAATATGGATGGATGAAAATATTAAAACCAAGAACCATACAAACACTGTGATG 420 ************************************************************
A TTTTATCTTGTTCGTGACAGAAGGCCCTTTGGTAGTGCTATGGATTTTGGACAGGTGTTT 480 B TTTTATCTTGTTCGTGACAGAAGGCCCTTTGGTAGTGCTATGGATTTTGGACAGGTGTTT 480 C TTTTATCTTGTTCGTGACAGAAGGCCCTTTGGTAGTGCTATGGATTTTGGACAGGTGTTT 480 ************************************************************ A AACATGTATGATAATGAGCCCAGTACTGCTACTATCAAGAACGATCTTCGAGAATCGTTA 540 B AACATGTATGATAATGAGCCCAGTACTGCTACTATCAAGAACGATCTTCGAGAATCGTTA 540 C AACATGTATGATAATGAGCCCAGTACTGCTACTATCAAGAACGATCTTCGAGAATCGTTA 540 ************************************************************ A TCAAGTTTTAAGAAAATTCACTTCAACAGTCCACAGGTGGTCAATATGCTTCCAAAGGAA 600 B TCAAGTTTTAAGAAAATTCACTTCAACAGTCCACAGGTGGTCAATATGCTTCCAAAGGAA 600 C TCAAGTTTTAAGAAAATTCACTTCAACAGTCCACAGGTGGTCAATATGCTTCCAAAGGAA 600 ************************************************************ A CAGTCGTTGGGTCAGGAAAATTTATGAAGATTAATAATTATGTAGTTTATAATCATCAAG 660 B CAGTCGTTGGGTCAGGAAAATTTATGAAGATTAATAATTATGTAGTTTATAATCATCAAG 660 C CAGTCGTTGGGTCAGGAAAATTTATGAAGATTAATAATTATGTAGTTTATAATCATCAAG 660 ************************************************************ A AAGCTGCTAAGTATTGACAATCATACTGAAAATGCCTTGTTATTGTATATTGGGTTGTAC 720 B AAGCTGCTAAGTATTGACAATCATACTGAAAATGCCTTGTTATTGTATATTGGGTTGTAC 720 C AAGCTGCTAAGTATTGACAATCATACTGAGAATGCCTTGTTATTGTATATTGGCTTGTAC 720 ***************************** *********************** ****** A TCATGCCAGTAATCCCGTGTATGCTTACTTTTGAAGATCAGAATCTATTTCTATGATTCT 780 B TCATGCCAGTAATCCCGTGTATGCTTACTTTTGAAGATCAGAATCTATTTCTATGATTCT 780 C TCATGCCAGTAATCCAGTGTATGCTAACCTTTGAAGATCAGAATCTATTTCTATGATTCT 780 *************** ********* ** ******************************* A GTTCAAAATTAAGAATTCGGCC---- 802 B GTTCAAAATTAAGAATTCGGCC---- 802 C GTCCAAAATAGAAAAATACGCGGGCA 806 ** ****** * ** * **
ABSTRACT
DEVI AGUSTINA. Isolation, Characterization, Cloning Coat protein Gene of Begomovirus As DNA Probe. Supervised By UTUT WIDYASTUTI and SRI HENDRASTUTI HIDYAT.
Begomoviruses has been reported to cause serious diseases in a number of economically crops in the world. Infection of Begomovirus in Indonesia was reported since 1999 and caused significant yield losses especially in chillipepper. The objectives of this research were to isolate, characterize and clone coat protein gene from Begomovirus infecting chillipepper into pGEM-T Easy vector and to use the clone as DNA Probe in dot blot hybridization. Coat protein gene of Begomovirus isolate originated from Ngluwar-Magelang was successfully isolated, characterized and cloned to pGEM-T Easy. Based on multiple alignment analysis using clustal W it is evidenced that recombinant DNA of Begomovirus isolate Ngluwar has high homology (> 90%, e value 0,0) with other Begomoviruses published earlier in GenBank. Dot blot hybridization method using recombinant DNA clone of Begomovirus isolate Ngluwar as DNA probe was able to detect Begomovirus from various sources (infected plants, PCR products from total DNA, cloned DNA) with sensitivity up to 0,0001 µg/µl. The use of DNA probe should be further evaluated for its use as detection tool for Begomovirus.
RINGKASAN
DEVI AGUSTINA. Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe). Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan SRI HENDRASTUTI HIDYAT.
Infeksi Begomovirus (Famili Geminiviridae) dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada beberapa jenis tanaman. Di Indonesia serangan Begomovirus pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan bahwa kejadian penyakit yang tinggi pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000, telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat, dengan kehilangan hasil pada cabai besar mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat iniBegomovirus masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus
penyebab penyakit pada tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV). KarakteristikBegomovirus yang tinggi turut menentukan sulitnya mengendalikan serangan penyakit pada berbagai tanaman inangnya yaitu keragaman genetiknya yang tinggi. Implikasi dari keragaman tersebut bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan cepat mendeteksi keberadaan
Begomovirus.
Pengendalian penyakit yang disebabkan oleh Begomovirusmemerlukan alat deteksi yang tepat untuk menentukan infeksi dini. Seiring dengan kemajuan di bidang bioteknologi telah membuka peluang besar bagi terealisasinya ketersediaan teknik deteksi yang efektif dan efisien. Salah satunya yaitu dengan mengkonstruksi suatu pelacak DNA (DNA probe ) sebagai alat deteksi penyakit dengan prinsip hibridisasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi penyakit tanaman yang disebabkan olehBegomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus isolat Ngluwar yang berukuran 780 bp berhasil diisolasi melalui amplifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1. Melalui teknik rekayasa genetik gen protein selubung tersebut berhasil diklon dalam plasmid pGEM-TEasy.
Karakterisasi terhadap gen protein selubung rekombinan Begomovirus
melalui analisis kesejajaran dan sesifisitas menunjukkan bahwa klon rekombinan tersebut memiliki kesamaan dan spesifisitas yang tinggi terhadap isolat
Begomovirus lain yang terdapat di GenBank sehingga dapat digunakan sebagai pelacak DNA (DNA probe) melalui pelabelan menggunakan digoksigenin. Hubungan kekerabatan tertinggi dengan kelompok Ageratum yellow vein virus.
Pelacak DNA Begomovirus memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap
Begomovirus karena tidak mendeteksi virus yang lain, dengan sensitifitas untuk mendeteksiBegomoviruspada kisaran konsentrasi 1-0,0001 µg/µl.
Metode penyiapan sampel tanaman uji dengan kemampuan untuk mengekstrak titer virus yang tinggi menjadi kunci utama untuk menjawab permasalahan sensitifitas dalam pengembangan teknik deteksi pelacak DNA yang diperoleh dalam penelitian ini sebagai alat deteksi Begomovirus, Geminiviridae yang efektif dan efisien.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Begomovirus dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi dengan luas serangan yang tinggi pula. SeranganBegomovirus di Indonesia yaitu pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan bahwa kejadian penyakit pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh
Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000 dan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Kehilangan hasil pada cabai besar saat itu mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat ini Begomovirus
masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus penyebab penyakit pada tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut
Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus(PYLCIV).
Begomovirus merupakan anggota Famili Geminiviridae yaitu pada Subkelompok III (ICTVdB 2006). Begomovirus merupakan anggota geminivirus dengan jumlah spesies yang paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies dengan tanaman dikotil sebagai inangnya dan ditularkan oleh vektor kutu kebul
Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Secara morfologi, Begomovirus
memiliki partikel yang tidak beramplop, berbentuk ikosahedral simetri dan ditemukan selalu berpasangan atau geminate (kembar), dengan ukuran partikel masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005). Asam nukleat Begomovirus
berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom berbentuk sirkuler dan ditemukan dalam bentuk monopartit (terdiri dari satu genom) atau bipartit (terdiri dari dua genom) (ICVdB 2006; Van Regenmortelet al. 2000; Voyles 2002).
Diketahui bahwa Begomovirus memiliki keragaman genetik yang tinggi. Santoso (2008) melaporkan adanya keragaman genetik di antara isolat-isolat
Begomovirus yang berasal dari daerah-daerah di Jawa dan Sumatera melalui analisis teknik PCR-RFLP. Selanjutnya berdasarkan analisis filogenetik diketahui bahwa isolat-isolat Begomovirus terbagi menjadi tiga kelompok berbeda. Isolat Brastagi, Bogor, Sragen, Ketep dan Boyolali berkerabat dekat dengan ToLCV-
Java (Tobacco Leaf Curl Virus-Java), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat dengan AYVV-China (Ageratum Yellow Vein Virus-China) sedangkan isolat Kaliurang berkerabat dengan TYLCV-China (Tomatto Yellow Leaf Curl Virus-
China) atau ToLCV-Laos (Tobacco Leaf Curl Virus-Laos). Trisno (2010) juga melaporkan mengenai keragaman genetik 11 isolat Begomovirus pada tanaman cabai di Sumatera Barat yang terbagi menjadi tiga kelompok. Keragaman genetik yang tinggi ini di duga karena adanya kejadian rekombinasi genetik di antara isolat-isolat Begomovirus. Sifat penularan Begomovirus melalui vektor dengan penularan secara tunggal atau bersamaan dengan strain yang berbeda maupun geminivirus lainnya pada tanaman inang yang sama maupun berkerabat dekat turut menentukan peluang terjadinya rekombinasi genetik yang tinggi antar isolat- isolat Begomovirus. Implikasi dari keragaman genetik yang tinggi ini menjadi bahan pertimbangan bagi para pemulia tanaman untuk merakit tanaman yang tahan terhadap Begomovirus, yaitu untuk merakit varietas yang tahan terhadap beberapa isolat Begomovirus atau merakit beberapa varietas tahan untuk isolat
Begomovirus tertentu. Selain itu informasi mengenai keragaman genetik ini bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan cepat.
Beberapa metode deteksi geminivirus yang telah dikembangkan antara lain: teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dan RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR), uji serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dan teknik hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak DNA (DNA probe). Teknik PCR merupakan metode yang umum digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus (Yuwono 2006; Aidawati et al. 2005; Palmer et al. 1998). Amplifikasi geminivirus, umumnya menggunakan primer universal yaitu PAL1v 1978 dan PAR1c 715 dengan ukuran fragmen DNA yang diharapkan sebesar 1,6 kb (Rojas et al. 1993; Rusli 2000; Sudiono 2001). Selain itu dapat juga digunakan primer spesifik yaitu AV1 yang akan mengamplifikasi daerah penyandi gen protein selubung (coat protein) dengan ukuran fragmen 780 bp (Santoso 2008; Meliyansah 2010; Fauziah 2010). Metode deteksi dengan teknik RFLP-PCR, dengan prinsip dasar PCR dan enzim restriksi, selain mampu mendeteksi keberadaan geminivirus juga mampu menunjukkan
perbedaan strain antar virus sehingga dapat digunakan untuk menelusuri hubungan genetik dan keragaman virus (Gilbertson et al. 1993), seperti yang dilakukan oleh Sudiono et al. (2004) yang menemukan adanya 2 strain
Begomovirus yang berbeda yang menyerang cabai di Jawa Barat. Teknik ELISA merupakan teknik deteksi virus berdasarkan pada pengujian serologi. Beberapa keunggulan teknik ELISA yaitu memberikan hasil pengujian yang sensitif, mampu menyajikan data kuantitatif dan prosedur ELISA dapat dibuat otomatisasi (Agrios 2005). Akan tetapi teknik ini memiliki kelemahan yaitu penyediaan antigen yang spesifik membutuhkan alokasi waktu yang lama dengan biaya yang tidak murah. Khususnya untuk geminivirus, sampai saat ini ketersediaan antiserum dan stabilitasnya masih menjadi faktor penghambat utama untuk memanfaatkan teknik ini sebagai alat deteksi yang efektif dan efisien. Hal tersebut disebabkan oleh sifat fisik dan kimia partikel virus yang membuatnya sulit untuk dimurnikan dalam bentuk yang stabil, sifat imunogenik dari virion yang lemah, homologi protein selubung terutama bagi virus-virus yang ditularkan oleh B. tabaci (Roberts et al. 1984). Teknik deteksi geminivirus berbasis asam nukleat dengan prinsip hibridisasi menggunakan pelacak DNA telah banyak digunakan untuk menjawab kelemahan dari teknik deteksi PCR maupun ELISA. Prinsip teknik deteksi ini yaitu terjadinya komplementasi asam nukleat antara asam nukleat pelacak dengan genom virus. Beberapa kelebihan teknik deteksi ini dibandingkan dengan teknik deteksi geminivirus lainnya yaitu tingkat spesifisitas yang tinggi, relatif mudah dan pelaksanaannya cepat dengan jumlah sampel yang banyak (Aidawati 2006; Rubioet al.2003). Selain spesifisitas yang tinggi, teknik ini mampu menunjukkan korelasi positif antara akumulasi DNA virus yang dideteksi dengan intensitas gejala (Romet al.1993; Rubioet al.2003).
Pelacak DNA yang digunakan dalam teknik deteksi hibridisasi dapat bersifat universal maupun spesifik terhadap Geminivirus. Spesifisitas pelacak DNA memegang peranan sangat penting dalam pengembangannya sebagai alat deteksi yang efektif dan efisien. Semakin spesifik pelacak DNA yang digunakan akan menambah keakuratan hasil deteksi (Keller & Manak 1992). Aidawati (2006) telah menggunakan teknik deteksi hibridisasi dot-blot menggunakan pelacak DNA yaitu klon partialDNA Tobacco Leaf Curl Virus (TobLCV), yang
mencakup sebagian daerah ORF V1 yang menyandikan protein selubung dan ORF C1 yang menyandikan gen replikasi, yang dilabel dengan digoxigenin, yang bersifat universal terhadap geminivirus dan mampu mendeteksi keberadaan geminivirus pada sap tanaman hingga faktor pengenceran 10-2. Untuk menjawab kebutuhan akan teknik deteksi berbasis pada uji asam nukleat dengan teknik hibridisasi Dot-Blot yang efektif dan efisien, maka dalam penelitian ini telah dikonstruksi suatu pelacak DNA yang bersifat spesifik terhadap Begomovirus
dengan memanfaatkan gen protein selubungBegomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus yang disandikan oleh ORF AV1 pada DNA A Begomovirus merupakan daerah genom yang berfungsi sebagai pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan virus. Selain itu gen protein selubung memiliki daerah genom yang mempunyai runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA geminivirus dalam pengembangan teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus
(Morinet al. 2000; Astieret al.2001; Fraquetet al.2005; Santoso 2008). Teknik deteksi yang dikembangkan dalam penelitian ini diharapkan kelak bermanfaat sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh geminivirus khususnya
Begomovirus sekaligus juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman yang