Isolasi dan Amplifikasi DNA TotalBegomovirus Isolasi DNA Total Begomovirus
Isolasi genom DNA memegang peranan yang sangat penting di dalam tahapan analisis gen secara molekuler seperti amplifikasi DNA dengan teknik
Polymerase Chain Reaction(PCR) dan teknik pengklonan gen. Jika kualitas DNA hasil isolasi tidak baik, tahap analisis selanjutnya mungkin tidak dapat dilakukan (Saunders & Parkers 1999). Kontaminasi DNA oleh polisakarida, protein, fenol, dan berbagai komponen lainnya akan mengganggu kerja dari beberapa enzim, seperti enzim restriksi danTaq DNA Polymerase(Ausubelet al. 1994citAngeles
et al. 2005). Selain itu dalam teknik isolasi DNA yang berasal dari tumbuhan seringkali mengalami masalah karena kandungan polisakarida dan polifenol serta metabolit lain yang mempengaruhi hasil dan kualitas DNA (Sharma et al. 2002; Puchooa & Venkatasamy 2005). Oleh karena itu teknik isolasi yang dapat menghasilkan DNA dengan kualitas yang baik mutlak dilakukan.
DNABegomovirus dari keempat isolatBegomovirus yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu: Segunung-Jawa Barat, Seyegan-Sleman, Ngluwar-Magelang dan Sedan-Rembang diisolasi dengan menggunakan metode isolasi DNA total yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle (1990) yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan 2% polyvinil pyrolidone (PVP) ke dalam bufer ekstraksi. Metode yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle (1990) untuk mengisolasi DNA total
Begomovirus telah banyak dilakukan oleh para peneliti sebelumnya (Aidawati 2006; Santoso 2008; Faizah 2010; Ganefianti 2010) dan menunjukkan hasil yang baik. Prinsip dasar dari teknik isolasi DNA adalah penghancuran jaringan untuk memisahkan sel dan dilanjutkan dengan melisis sel untuk mendapatkan DNA. Penghancuran jaringan dilakukan secara fisik yaitu dengan penggerusan jaringan, karena DNA terletak di dalam sel maka untuk dapat mengekstraknya harus dilakukan pelisisan sel dengan menggunakan bufer ekstraksi CTAB yang mengandung NaCl (Natrium Chloride) dan penambahan β-Mercaptoetanol dan PVP. Penggunaan CTAB bersama-sama dengan NaCl lebih dari 0,5 M dapat memisahkan polisakarida (Peterson et al. 1993) dan penggunaan antioksidan β-
1997). Pada tahap ini, selain dilakukan lisis sel juga dilakukan pemeliharaan DNA akibat terbukanya sel. Tahapan berikutnya yaitu mengekstrak DNA yang telah dibebaskan dari sel yang dilakukan melalui penambahan Chloroform:Iso-amyl alcohol(24:1) untuk memisahkan DNA tersebut dari protein. Pada tahap ini DNA akan berada pada fase cair sedangkan protein dan komponen lain akan berada pada fase padat (Saunders & Parkers 1999). Tahap penambahan Chloroform:Iso- amyl alcohol sangat diperlukan untuk mengeliminasi senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu kemurnian hasil isolasi DNA. Pengulangan tahap ini tergantung jenis sel, jika di dalam sel banyak mengandung kontaminan sebaiknya tahap ini perlu diulangi sedangkan jika tidak mengandung banyak kontaminan tidak perlu diulangi. Selanjutnya DNA yang berhasil di ekstrak dipresipitasi dengan penambahan etanol absolut atau isopropanol. Waktu presipitasi dapat disesuaikan dengan kandungan DNA dalam sel. Waktu presipitasi yang panjang diperlukan bila kandungan DNA dalam sel rendah, sedangkan bila kandungan DNA dalam sel tinggi mungkin cukup dengan waktu presipitasi yang pendek. Tahap akhir dari isolasi DNA adalah pencucian dan rehidrasi DNA. Pencucian DNA dengan etanol 70% dapat membersihkan sisa-sisa garam maupun kontaminan lainnya yang mengendap. Rehidrasi DNA dengan larutan penyangga TE diperlukan untuk melarutkan DNA yang akan digunakan lebih lanjut. Metode Doyle & Doyle (1990) yang dimodifikasi berhasil digunakan untuk mengisolasi keempat isolat Begomovirus dari tanaman tomat (Data tidak ditampilkan). DNA total Begomovirus tersebut selanjutnya dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif sebelum digunakan untuk tahapan penelitian selanjutnya.
Kualifikasi dan kuantifikasi DNA dilakukan untuk mengetahui baik tidaknya DNA hasil isolasi. Saunders & Parkers (1999) mengemukakan bahwa ada tiga kriteria yang penting untuk menentukan baik tidaknya DNA hasil isolasi, yaitu konsentrasi, kemurnian dan integritas. Konsentrasi DNA yang baik menunjukkan kecukupan jumlah DNA untuk digunakan dalam analisis lanjutan. Kemurnian DNA mengindikasikan bahwa DNA bebas dari segala macam kontaminan baik endogenus maupun eksogenus; sedangkan integritas DNA yang tinggi ditunjukkan oleh hasil isolasi yang utuh atau mempunyai berat molekul yang tinggi. Kualitas DNA dapat diamati melalui pembacaan pita DNA di dalam
gel elektroforesis. Hasil yang baik diindikasikan dengan pita DNA yang tebal dan tegas serta bersih. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurniannya terhadap kontaminan protein dapat diamati melalui pengukuran nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. DNA diklasifikasikan murni jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm terhadap 280 nm berada pada kisaran 1,8- 2,0 (Suharsono 2006). Hasil kuantifikasi dan kualifikasi terhadap DNA total ke empat isolat Begomovirus menunjukkan hasil yang baik dengan kisaran tingkat kemurnian 1,78-1,89 dan digunakan pada tahapan selanjutnya yaitu pengamplifikasian gen protein selubung (coat protein) Begomovirus dengan teknik PCR (Tabel 1).
Tabel 1 Kualifikasi DNA totalBegomovirusberdasarkan nilai adsorbansi
Nomor Nama Isolat A260/280 nm
1 Segunung - Jawa Barat 1,83
2 Seyegan – Sleman 1,80
3 Ngluwar – Magelang 1,89
4 Sedan – Rembang 1,78
Amplifikasi Gen Protein Selubung Begomovirus
Gen protein selubung (coat protein) Begomovirus diamplifikasi dengan teknik PCR mengikuti prosedur Rojas et al. (1993) dengan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus (AVRDC, Taiwan) yaitu: CPPROTEIN-V1 (5’TAATTCTAGATG TCGAAGCGACCCGCCGA-3’) dan CPPROTEIN-C1 (5’-GGCCGAATTCTTAATTTTGAACAGAATCA-3’) yang secara spesifik mengamplifikasi bagian gen protein selubungBegomovirus.
Telah dilaporkan sebelumnya oleh Santoso (2008) bahwa teknik PCR metode Rojas et al. (1993) dengan pasangan primer AV1 berhasil mengamplifikasi gen protein selubung Begomovirus dari tanaman tomat yang terinfeksi olehBegomovirus.Hasil penelitian ini juga membuktikan bahwa primer AV1 dapat mengamplifikasi gen protein selubung Begomovirus dari keempat isolat Begomovirus yang diindikasikan dengan terbentuknya amplikon berukuran 780 bp (Gambar 4). Pita DNA dengan ukuran yang sama teramplifikasi dari
780 bp
sampel kontrol positif (Gambar 4 kolom 3), tetapi pita DNA tidak tampak pada gel agarosa untuk sampel kontrol negatif (Gambar 4 kolom 1 dan 2).
Gambar 4 Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer AV1 terhadap 4 isolat
Begomovirus. M=Marker 100 bp, 1=Kontrol negatif PCR yaitu reaksi tanpa DNA template, 2= DNA total tanaman cabai sehat, 3=Kontrol positif PCR (DNA Begomovirus isolat Kaliurang-Sleman), 4=
Begomovirus isolat Sedan-Rembang, 5= Begomovirus isolat Segunung-Cianjur, 6= Begomovirus isolat Ngluwar-Magelang, 7=
Begomovirusisolat Seyegan-Sleman
Fragmen gen protein selubung hasil amplifikasi tersebut akan digunakan pada tahapan berikutnya yaitu pengklonan gen protein selubung Begomovirus.
Sebelumnya dilakukan pengisolasian fragmen gen protein selubung dari gel agarosa dengan teknik elusi, sehingga dari tahapan ini akan diperoleh fragmen tunggal gen protein selubung. Dalam tahapan ini gen protein selubung
Begomovirus isolat Ngluwar-Magelang terpilih sebagai DNA target dalam pengklonan gen protein selubung Begomovirus karena memiliki tingkat kemurnian DNA yang tertinggi (Tabel 1).
Pengklonan Gen Protein SelubungBegomovirus
Gen protein selubung memiliki peranan yang sangat penting tidak hanya sebagai pelindung genom virus juga berperan dalam penularan, pergerakan virus pada vektor dan inti sel inang serta perkembangan gejala pada tanaman inang (Briddon et al. 1989). Berdasarkan hal tersebut pengklonan gen protein selubung virus banyak dikembangkan dalam berbagai tujuan penelitian. Santoso (2008) melaporkan keberhasilannya menggunakan klon rekombinan gen protein selubung
Begomovirus dari ORF AV1 dalam pengembangan kultivar tahan Begomovirus
dengan strategi pendekatanpathogen derived resistance(PDR).
Pada penelitian ini, gen protein selubung Begomovirus isolat Ngluwar- Magelang disisipkan pada plasmid pGEM-T Easy. Pemilihan vektor pGEM-T Easy didasarkan pada beberapa sifat-sifat nya antara lain: 1) dapat digunakan untuk mengkloning fragmen hasil PCR yang menggunakan DNA polymerase
tertentu yang akan menghasilkan fragmen dengan ujungnya mempunyai ekor basa A dimana vektor pGEM-T memiliki ujung basa T, 2) vektor ini memiliki
polycloning sites yang akan mempermudah pemilihan enzim restriksi untuk kloning, 3) vektor ini juga merupakan plasmid yang memiliki kemampuan propagasi yang tinggi sehingga sangat membantu di dalam perbanyakannya pada sel kompetenE. coli(Santoso 2008).
Tahapan utama dalam pengklonan gen yaitu proses ligasi dan transformasi. Proses ligasi yaitu menggabungkan DNA sisipan (fragmen tunggal gen protein selubung) ke dalam vektor. Hasil ligasi antara plasmid sebagai vektor dengan suatu fragmen DNA diintroduksi ke dalam E. coli sebagai inangnya yang kemudian ditumbuhkan dalam media yang telah diberi ampisilin, IPTG dan X-gal sebagai agen seleksi (proses transformasi). Bakteri yang digunakan dalam proses transformasi adalah bakteri E. coli yang telah kompeten. Pada kondisi normal, bakteri ini mempunyai keterbatasan dalam mengambil DNA, sehingga harus diberi perlakuan fisik dan kimia tertentu agar menjadi kompeten dalam mengambil DNA. Keberhasilan proses ligasi hanya dapat diketahui dari keberhasilan proses transformasi melalui metode seleksi biru-putih
Konfirmasi Klon Rekombinan
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif
Keberhasilan proses transformasi dapat dilihat dari kemampuan tumbuh E. coli pada media ampisilin karena plasmid yang digunakan mengandung gen resisten terhadap ampisilin. Keberhasilan proses ligasi dapat diketahui dari adanya koloni yang berwarna putih. Sel yang mengandung plasmid yang membawa sisipan DNA akan berwarna putih pada media LB yang mengandung antibiotik ampisilin dan IPTG serta X-gal; sedangkan sel yang mengandung plasmid yang tidak membawa sisipan DNA akan berwarna biru. Hal ini disebabkan adanya situs
penyisipan terletak pada gen lacZ yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah molekul X-gal dari tidak berwarna menjadi berwarna biru, sehingga pada media yang sudah ditambah X-gal dan IPTG sebagai inducer gen lacZ akan terbentuk koloni putih, sebagai hasil dari ketidakmampuan gen lacZ mengekspresikan β- galaktosidase karena tersisipi oleh fragmen DNA. Berdasarkan seleksi rekombinan tersebut dalam tahapan penelitian ini berhasil diperoleh 14 koloni yang berwarna putih yang di duga merupakan rekombinanBegomovirus Ngluwar (Gambar 5).
Gambar 5 Klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar hasil seleksi biru-putih (A) dan replika klon rekombinan (B)
Isolasi Plasmid Rekombinan
Isolasi plasmid bertujuan untuk memperoleh DNA plasmid rekombinan dari bakteri kompeten sebagai inang. Melalui tahapan ini akan diperoleh plasmid rekombinan yang akan digunakan pada tahapan berikutnya. Hasil isolasi plasmid yang belum murni atau masih terkontaminasi oleh protein ataupun senyawa lainnya akan mengganggu atau bahkan menyebabkan kegagalan tahap reaksi selanjutnya.
Prinsip isolasi plasmid yaitu melisis membran sel, memisahkan DNA dari protein dan RNA dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom. Tahap awal dari isolasi plasmid yaitu melakukan suspensi biakan bakteri dengan penambahan bufer resuspensi yang terdiri dari Tris HCl dan EDTA. Tris HCl berfungsi mempertahankan lingkungan alkali dimana DNA sangat baik disimpan pada pH 7.5-8.2 dan EDTA berfungsi untuk menon-aktifkan nuklease dan mengkelat Mg2+ yang berasosiasi dengan membran luar sehingga terjadi destabilisasi membran (Rohde 1994). Tahapan berikutnya yaitu melisis sel dengan
M K+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 penambahan bufer lisis yaitu NaOH dan SDS, yang mampu merusak membran sel dan menyebabkan DNA terdenaturasi. Selanjutnya terjadi penurunan pH, kemudian SDS akan mempresipitasi komponen membran, DNA kromosom dan komponen sel lainnya. Dalam tahap ini DNA plasmid tidak terdenaturasi dan masih ada dalam suspensi karena ukurannya yang kecil dan berbentuk sirkuler. Tahapan berikutnya yaitu melakukan purifikasi terhadap DNA plasmid yang telah dinetralisasi sebelumnya dengan bufer pencuci yang bertujuan untuk membebaskan DNA plasmid dari protein-protein kecil dan senyawa lainnya yang masih tersisa. Setelah itu DNA plasmid diperoleh melalui sentrifugasi dengan bufer elusi. DNA plasmid yang diperoleh kemudian diendapkan dengan penambahan etanol yang akan mengikat air sehingga DNA plasmid akan berada pada fase padat.
Sebanyak 14 klon rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar yang diperoleh dalam penelitian ini telah berhasil diisolasi plasmidnya, dengan plasmid AV1 asal Tomat yang mengandung gen selubung protein AV1, TYLCV (TJ Santoso, BB- Biogen) sebagai pembanding (Gambar 6).
Gambar 6 Hasil isolasi plasmid terhadap 14 klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar. Keterangan: M=Marker 1 Kb, K+=Plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen), 1-14= klon DNA rekombinan
Begomovirusisolat Ngluwar A tanpa pemotongan enzim restriksi EcoR1.
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi
Enzim restriksi endonuklease atau yang biasa disingkat enzim restriksi memiliki kemampuan untuk memotong DNA secara spesifik, terbatas pada daerah atau situs yang dikenalinya (Glick & Paternak 1998). Penggunaan enzim restriksi dilakukan dengan berbagai tujuan, diantaranya untuk mengetahui ukuran molekul 1000 bp
DNA terutama DNA dengan ukuran besar atau linier, mengisolasi fragmen tertentu dan membuat celah sisipan (Suharsono & Widyastuti 2006). Enzim restriksi bekerja dengan dua tahap, yaitu pengenalan terhadap sekuen DNA dan selanjutnya pemotongan DNA. Beberapa faktor yang menentukan keberhasilan proses pemotongan DNA dengan enzim restriksi antara lain: kondisi enzim, bufer, suhu inkubasi serta kemurnian DNA.
Pada penelitian ini tujuan digunakan enzim restriksi yaitu untuk membuat celah sisipan pada plasmid pGEMT-Easy sebagai langkah konfirmasi untuk menjawab pertanyaan apakah klon rekombinan yang diperoleh berhasil disisipi oleh fragmen gen protein selubung Beegomovirusatau tidak. Enzim restriksi yang digunakan yaitu EcoR1 yang mempunyai situs pengenalan enam nukleotida.
EcoRI akan mengenali situs GAATTC dan akan memotong antara basa G dan A dan menghasilkan ujung tidak rata 5’ overhang. Pemilihan EcoR1 didasarkan pada situs pemotongan yang terdapat pada plasmidpGEMT-Easy,dimana terdapat situs pemotonganEcoR1 yang mengapit celah MCS (multicloning sites) sehingga memungkinkan untuk membebaskan DNA sisipan hanya menggunakan satu enzim saja, yaituEcoR1 (Gambar 3).
Pemotongan klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar-Magelang A dan B dengan enzim restriksi EcoR1 menghasilkan 2 pita DNA masing-masing berukuran 780 bp dan 3015 bp (Gambar 7), yang merupakan fragmen DNA
Begomovirussebagai sisipan (780 bp) dan plasmid vektor (3015 bp).
Klon DNA rekombinan yang sudah dikonfirmasi mengandung sisipan DNA yang diharapkan selanjutnya digunakan untuk analisis dengan perunutan nukleotida (sequencing) yang dilakukan oleh PT. Macrogen, Korea Selatan.
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Gambar 7 Pemotongan klon rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoR1. M=Marker 1 kb, 1=Vektor pGEMT-Easy tanpa pemotongan enzim restriksi EcoR1, 2=Vektor pGEMT-Easy dengan pemotongan enzim restriksi EcoR1, 3=Plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen) tanpa pemotongan enzim restriksi EcoR1, 4= Plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen) dengan pemotongan enzim restriksi EcoR1, 5=klon DNA rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar A tanpa pemotongan enzim restriksi
EcoR1, 6=klon DNA rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar A dengan pemotongan enzim restriksi EcoR1, 7=klon DNA rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar B tanpa pemotongan enzim restriksi
EcoR1, 8=klon DNA rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar B dengan pemotongan enzim restriksiEcoR1
Perunutan DNA
Hasil perunutan nukleotida fragmen gen protein selubungBegomovirushasil amplifikasi PCR (Lampiran 1), rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar A (Lampiran 2) dan rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar B (Lampiran 3) digunakan untuk analisis kesejajaran dengan program BLAST (Basic Local Aligment Search Tools)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) untuk mengetahui identitas Begomovirus. Alignment antar ketiga sekuen Begomovirus tersebut dilakukan sebagai konfirmasi sekuen antara sekuen protein selubung
Begomovirus sebelum dikloning dengan rekombinannya yaitu gen protein selubung rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar A maupun Ngluwar B. Hasil
alignment menunjukkan bahwa antar sekuen gen protein selubung Begomovirus
rekombinan terhadap sekuen gen protein selubung Begomovirus non rekombinan yaitu hasil amplifikasi PCR memiliki kesamaan yang tinggi, diindikasikan dengan kolom-kolom nukleotida yang terkonservasi dengan baik (Lampiran 4).
3015 bp
780 bp 3000 bp
Karakterisasi Gen Protein SelubungBegomovirus
Karakterisasi gen protein selubungBegomovirusmelalui analisis kesejajaran dan analisis spesifisitas perlu dilakukan sebagai acuan dalam pengembangan pelacak DNABegomovirus sebagai metode deteksi.
Analisis Kesejajaran
Identitas gen protein selubung Begomovirus diperoleh setelah melakukan analisis homologi antara nukleotida target dengan nukleotida gen protein selubung
Begomovirusyang telah terdaftar di GenBank (Tabel 2).
Hasil analisis nukleotida menunjukkan bahwa sekuen gen protein selubung
Begomovirus rekombinan isolat Ngluwar mempunyai kemiripan yang tinggi (lebih dari 90%, e-value 0,0) dengan: Ageratum yellow vein virus-Ishigaki
(AB306314), Ageratum yellow vein virus-[G129](AM940137), Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189854) dan Soybean crinkle leaf virus-[Japan]
(AB050781). Tingkat kemiripan yang lebih rendah (< 90%) terjadi antara rekombinan isolat Ngluwar denganTomato leaf curl Malaysia virus (AF327436),
Tomato leaf curl Java virus (AB100304), Papaya leaf curl China virus
(AY650283), Tomatoyellow leaf curl Guandong (AY602166) dan Malvastrum leaf curl virus (FJ712169) (Tabel 2). Clavarie & Notredame (2003) menyatakan bahwa dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% urutan nukleotidanya atau 25% urutan asam aminonya identik, dengan panjang urutan minimal 100. Menurut pedoman dari ICTV, apabila persamaan sekuen dari gen protein selubung antara satu virus dengan virus lain lebih dari 90%, dikatakan bahwa virus tersebut merupakan spesies virus yang sama.
Berdasarkan hasil analisis kesejajaran dengan program BLAST tersebut maka dapat dipastikan bahwa gen protein selubung yang diperoleh dalam penelitian ini, baik pada gen protein selubung hasil amplifikasi PCR (produk PCR) maupun rekombinan, adalah gen protein selubung yang berasal dari
Tabel 2 Hasil analisis kesejajaran gen protein selubungBegomovirus
Analisis Spesifisitas
Spesifisitas gen protein selubungBegomovirus isolat Ngluwar terhadap gen protein selubung isolat lainnya baik yang berasal dari Indonesia maupun negara lain merupakan informasi yang sangat penting terkait dengan tujuan penelitian yaitu mengembangkan pelacak DNA sebagai metode deteksi Begomovirus. Gen protein selubung isolat Ngluwar yang diperoleh akan dilabel menjadi DNAProbe
(pelacak DNA) sebagai alat deteksi Begomovirus. Spesifisitas gen protein selubung sangat menentukan ketepatan (akurasi) serta sensitifitas alat deteksi tersebut. Analisis spesifisitas gen protein selubung Begomovirus rekombinan isolat Ngluwar terhadap ke-12 isolat Begomovirus yang telah didaftarkan di GenBank, dipilih berdasarkan tanaman inang dan lokasi asal isolat, dilakukan dengan programmultiple alignmentClustal W (http://www.ebi.ac.uk/Clustal W).
Hasil analisis spesifisitas gen selubung rekombinan Ngluwar A dan B menunjukkan bahwa kedua gen selubung rekombinan tersebut memiliki konservasi yang tinggi terhadap ke-12 isolat Begomovirus tersebut, diketahui berdasarkan nilai penyejajaran (alignment score) yang mengindikasikan kesamaan urutan nukleotida antar sekuen (Tabel 3).
No. Aksesi Isolat Virus
% Identitas Produk PCR Rekombinan A Rekombinan B AB306314 Ageratum yellow vein virus-
Ishigaki
95 95 95
AM940137 Ageratum yellow vein virus- [G129]
95 95 95
AB189854 Ageratum yellow vein virus- [Indonesia]
95 96 96
AB050781 Soybean crinkle leaf virus- [Japan]
91 91 91
AF327436 Tomato leaf curl Malaysia virus 84 84 84
AB100304 Tomato leaf curl Java virus 82 81 81
AY650283 Papaya leaf curl China virus 81 81 81
AY602166 Tomatoyellow leaf curl Guandong 80 80 80
Tabel 3 Nilai penyejajaran (alignment score) gen protein selubung rekombinan terhadap ke-12 isolatBegomovirus
No No.Aksesi Isolat Virus Tanaman Inang &
Asal Geografis Alignment score(%) Rekombinan A Rekombinan B 1 AB100304 Tomato leaf curl Java
virus
Tomat-Indonesia 80 80
2 AB162141 Tomato leaf curl Java virus-[Ageratum]
Tomat,Gulma- Indonesia
82 82
3 AB189845 Pepper yellow leaf curl Indonesia virus [Tomato2]
Cabai Rawit- Indonesia
63 63
4 AB189848 Tomato leaf curl Java virus-[Magelang]
Tomat-
Magelang,Indonesia
83 83
5 AB189913 Ageratum yellow vein virus-[Indonesia]
Gulma-Indonesia 92 92
6 AB246170 Pepper yellow leaf curl Indonesia virus
Cabai Rawit- Indonesia
66 66
7 AF314531 Pepper leaf curl
Bangladesh
Cabai Rawit- Banglades
76 76
8 AF336806 Chilli leaf curl virus- [Multan]
Cabai-Pakistan 76 76
9 AF327436 Tomato leaf curl
Malaysia virus
Tomat-Malaysia 83 83
10 X74516 Ageratum yellow vein virus
Gulma-Singapura 52 52
11 AF136222 Tomato leaf curl
Philippines virus
Tomat-Filipina 72 72
12 AB020977 Soybean crinkle leaf virus
Kedelai-Jepang 59 59
Gen selubung rekombinan Ngluwar A dan B memiliki kesamaan sekuen tertinggi terhadap isolat Begomovirus tanaman gulma asal Indonesia yaitu
Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] yang ditunjukkan oleh nilai alignment score sebesar 92% dan kesamaan sekuen terendah yaitu terhadap isolat
Begomovirus dengan tanaman gulma sebagai inangnya yang berasal dari Singapura yaitu Ageratum yellow vein virus dengan nilai alignment score sebesar 52%. Nilai penyejajaran yang diperoleh dalam analisis ini mengindikasikan kesamaan antar sekuen tetapi belum tentu menunjukkan hubungan kekerabatan antar sekuen tersebut. Oleh karenanya diperlukan analisis kladogram untuk melihat hubungan kekerabatannya (Gambar 8).
Gambar 8 Kladogram sekuen klon rekombinan Begomovirus, Ngluwar A dan B dibandingkan dengan ke-12 isolat Begomovirus. Klon rekombinan Ngluwar A (A), klon rekombinan Ngluwar B (B), Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189913), Soybean crinkle leaf virus
(AB020977), Ageratum yellow vein virus (X74516), Tomato leaf curl Java virus (AB100304), Tomato leaf curl Java virus-[Ageratum]
(AB162141), Tomato leaf curl Java virus-[Magelang] (AB189848),
Pepper yellow leaf curl Indonesia virus [Tomato2] (AB189845),
Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (AB246170),Tomato leaf curl Philippines virus (AF136222), Pepper leaf curl Bangladesh virus
(AF314531), Chilli leaf curl virus-[Multan] (AF336806),Tomato leaf curl Malaysia virus(AF327436).
Kladogram menunjukkan hubungan kekerabatan gen protein selubung rekombinan Ngluwar A dan B terhadap ke-12 isolatBegomovirus tersebut terbagi menjadi tiga kelompok utama. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen protein selubung Ngluwar A berada dalam kelompok pertama, bersama 6 isolat
Begomovirus lainnya yaitu Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189913),
Soybean crinkle leaf virus (AB020977), Ageratum yellow vein virus (X74516),
Tomato leaf curl Java virus(AB100304),Tomato leaf curl Java virus-[Ageratum]
(AB162141) dan Tomato leaf curl Java virus-[Magelang] (AB189848). Pada kelompok dua terdiri dari Pepper yellow leaf curl Indonesia virus [Tomato2]
(AB189845), Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (AB246170), Tomato leaf curl Philippines virus (AF136222), Pepper leaf curl Bangladesh virus
I
II
(AF314531), Chilli leaf curl virus-[Multan] (AF336806) dan Tomato leaf curl Malaysia virus (AF327436) pada kelompok tiga. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwaAgeratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189913) merupakan isolat Begomovirus yang memiliki hubungan terdekat dengan gen protein selubung rekombinan Ngluwar A dan B, hasil ini selaras dengan nilai kesamaan yang diperoleh melalui analisis kesejajaran, dimana Ageratum yellow vein virus- [Indonesia] memiliki nilai kesamaan tertinggi terhadap gen protein selubung rekombinan A dan B (Gambar 8).
Hal yang menarik dari hasil kladogram ini yaitu gen protein selubung rekombinan Ngluwar A dan B berada dalam satu kelompok dengan isolat
Begomovirus yang bukan berasal dari Indonesia, yaitu:Soybean crinkle leaf virus
(AB020977) yang berasal dari Jepang dan Ageratum yellow vein virus (X74516) yang berasal dari Singapura. Hal tersebut di duga bahwa kemungkinan sesungguhnya mereka berasal dari nenek moyang dengan sekuen yang sama yang kemudian terpisah karena mengalami mutasi sehingga menyebabkan keragaman antar Begomovirus (Santoso 2008). Penjelasan senada juga dilaporkan oleh Ambrozevicius et al. (2005) yaitu adanya transfer genetik Begomovirus dari tanaman inang aslinya yang liar ke tanaman budidaya yang menyebabkan rekombinasi genetik Begomovirus. Rekombinasi genetik pada Begomovirus
adalah kunci utama yang berperan dalam keragaman diversifikasi dan evolusi