ISOLASI, KARAKTERISASI, KLONING GEN PROTEIN
SELUBUNG (
COAT PROTEIN
)
BEGOMOVIRUS
SEBAGAI
PELACAK DNA (
DNA PROBE
)
DEVI AGUSTINA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2010
Devi Agustina
ABSTRACT
DEVI AGUSTINA. Isolation, Characterization, Cloning Coat protein Gene of Begomovirus As DNA Probe. Supervised By UTUT WIDYASTUTI and SRI HENDRASTUTI HIDYAT.
Begomoviruses has been reported to cause serious diseases in a number of economically crops in the world. Infection of Begomovirus in Indonesia was reported since 1999 and caused significant yield losses especially in chillipepper. The objectives of this research were to isolate, characterize and clone coat protein gene from Begomovirus infecting chillipepper into pGEM-T Easy vector and to use the clone as DNA Probe in dot blot hybridization. Coat protein gene of Begomovirus isolate originated from Ngluwar-Magelang was successfully isolated, characterized and cloned to pGEM-T Easy. Based on multiple alignment analysis using clustal W it is evidenced that recombinant DNA of Begomovirus isolate Ngluwar has high homology (> 90%, e value 0,0) with other Begomoviruses published earlier in GenBank. Dot blot hybridization method using recombinant DNA clone of Begomovirus isolate Ngluwar as DNA probe was able to detect Begomovirus from various sources (infected plants, PCR products from total DNA, cloned DNA) with sensitivity up to 0,0001 µg/µl. The use of DNA probe should be further evaluated for its use as detection tool for Begomovirus.
RINGKASAN
DEVI AGUSTINA. Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe). Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan SRI HENDRASTUTI HIDYAT.
Infeksi Begomovirus (Famili Geminiviridae) dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada beberapa jenis tanaman. Di Indonesia serangan Begomovirus pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan bahwa kejadian penyakit yang tinggi pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000, telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat, dengan kehilangan hasil pada cabai besar mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat ini Begomovirus masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus
penyebab penyakit pada tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV). Karakteristik Begomovirus yang tinggi turut menentukan sulitnya mengendalikan serangan penyakit pada berbagai tanaman inangnya yaitu keragaman genetiknya yang tinggi. Implikasi dari keragaman tersebut bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan cepat mendeteksi keberadaan
Begomovirus.
Pengendalian penyakit yang disebabkan olehBegomovirus memerlukan alat deteksi yang tepat untuk menentukan infeksi dini. Seiring dengan kemajuan di bidang bioteknologi telah membuka peluang besar bagi terealisasinya ketersediaan teknik deteksi yang efektif dan efisien. Salah satunya yaitu dengan mengkonstruksi suatu pelacak DNA (DNA probe ) sebagai alat deteksi penyakit dengan prinsip hibridisasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi penyakit tanaman yang disebabkan olehBegomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus isolat Ngluwar yang berukuran 780 bp berhasil diisolasi melalui amplifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1. Melalui teknik rekayasa genetik gen protein selubung tersebut berhasil diklon dalam plasmid pGEM-TEasy.
Karakterisasi terhadap gen protein selubung rekombinan Begomovirus
melalui analisis kesejajaran dan sesifisitas menunjukkan bahwa klon rekombinan tersebut memiliki kesamaan dan spesifisitas yang tinggi terhadap isolat
Begomovirus lain yang terdapat di GenBank sehingga dapat digunakan sebagai pelacak DNA (DNA probe) melalui pelabelan menggunakan digoksigenin. Hubungan kekerabatan tertinggi dengan kelompok Ageratum yellow vein virus.
Pelacak DNA Begomovirus memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap
Metode penyiapan sampel tanaman uji dengan kemampuan untuk mengekstrak titer virus yang tinggi menjadi kunci utama untuk menjawab permasalahan sensitifitas dalam pengembangan teknik deteksi pelacak DNA yang diperoleh dalam penelitian ini sebagai alat deteksi Begomovirus, Geminiviridae yang efektif dan efisien.
© Hak cipta milik IPB, tahun 2010 Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
ISOLASI, KARAKTERISASI, KLONING GEN PROTEIN
SELUBUNG (
COAT PROTEIN
)
BEGOMOVIRUS
SEBAGAI
PELACAK DNA (
DNA PROBE
)
DEVI AGUSTINA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul : Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein)
BegomovirusSebagai Pelacak DNA (DNA Probe). Nama : Devi Agustina
NIM : P052060041
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si Ketua
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Bioteknologi
Dr. Ir. Suharsono, DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Lampung Utara, 24 Agustus 1984. Penulis merupakan anak sulung dari dua bersaudara pasangan Suhardi (Alm) dan Rohimah, S.Pd.
PRAKATA
Alhamdulillahhirrabil’alamin. Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena hanya atas ridho dan karuniaNya tesis dengan judul Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus
Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe) ini dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis mempersembahkan rasa terimakasih dan penghargaan yang tak terhingga kepada Dr. Utut Widyastuti dan Dr. Sri Hendrastuti Hidayat atas kesempatan dan kepercayaan yang diberikan kepada penulis serta segala bimbingan yang diberikan dengan setulus hati kepada penulis demi lahirnya sebuah karya tesis ini. Penelitian tugas akhir (tesis) ini dapat terlaksana dengan adanya bantuan dana dari Hibah Kompetisi Direktorat Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan Nasional, RI Tahun Anggaran 2008 atas nama Dr. Sri Hendrastuti Hidayat.
Terimakasih penulis sampaikan kepada: Dr. Trijoko Santoso yang telah memberi kesempatan dan kesediaan waktu bagi penulis selama bekerja di Lab. Biologi Molekuler, BB-BIOGEN (Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian) Cimanggu-Bogor, Saudari Tuti S. Legiastuti yang telah memberikan pengarahan kepada penulis selama bekerja di Laboratorium Virologi-Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, IPB serta Bapak Saefudin (Mput) atas bantuannya di rumah kaca Cikabayan, Darmaga.
Terimakasih penulis ucapkan untuk semua anggota Laboratorium Virologi dan teman-teman Bioteknologi khususnya angkatan 2006 dan 2007, Ilmu Pangan 2006, Ilmu Pengetahuan Kehutanan 2006 serta semua keluarga di Felix House, Pondokan Sunda Karya dan Wisma Radar 36 untuk semua kebersamaan kita yang sarat akan arti perjuangan dan pelajaran untuk menjadi manusia yang dewasa dan bertanggungjawab. Semoga Allah senantiasa melimpahi kesuksesan dan kebahagiaan bagi kita semua. Amin.
Rasa terimakasih yang tiada henti berikut penghargaan yang tak terhingga penulis persembahkan kepada ayahanda Suhardi (Alm), ibunda Rohimah, S.Pd, adinda Suhendra dan sahabat Georgius Andhan K atas limpahan cinta dan kasih sayang serta doa panjang sepenuh hati demi terselesaikan tesis ini.
Terimakasih pula penulis persembahkan untuk keluarga besar Muhammad Jusuf (Alm) dan Sultan Permata Alam (Alm) atas dukungan moral dan material yang telah diberikan kepada penulis. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan ridhoNya bagi kita semua di dunia dan akhirat dengan memeluk hati dan mimpi kita dalam ikatan kekeluargaan yang indah, selamanya. Amin.
Pada akhirnya penulis berharap semoga karya ini mampu berkontribusi bagi kemajuan dan kearifan ilmu pengetahuan di masa yang akan datang. Amin
Bogor, Februari 2010
DAFTAR ISI
Penyakit Tanaman yang DisebabkanBegomovirus... 6
Keragaman GenetikBegomovirus ... 7
DeteksiBegomovirus... 8
BAHAN DAN METODE ... 10
Waktu dan Tempat Penelitian ... 10
Metode Penelitian ... 10
Isolasi DNA TotalBegomovirus... 10
Amplifikasi DNABegomovirus... 11
Pengklonan DNABegomovirusHasil Amplifikasi ... 12
Ligasi ... 12
Transformasi... 12
Penyiapan Bakteri Kompeten ... 12
Introduksi DNA Rekombinan ... 13
Konfirmasi Klon Rekombinan ... 13
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif ... 13
Isolasi Plasmid Rekombinan ... 13
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi . 14 Perunutan DNA ... 15
Karakterisasi Gen Protein SelubungBegomovirus... 15
Hibridisasi DNA ... 15
Isolasi dan Amplifikasi DNA TotalBegomovirus... 19
Isolasi DNA TotalBegomovirus... 19
Amplifikasi Gen Protein SelubungBegomovirus... 21
Konfirmasi Klon Rekombinan ... 23
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif ... 23
Isolasi Plasmid Rekombinan ... 24
Isolasi DNA Sisipan melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi ... 25
Perunutan DNA ... 27
Karakterisasi Gen Protein SelubungBegomovirus... 28
Analisis Kesejajaran ... 28
Analisis Spesifisitas... 29
Hibridisasi DNA ... 35
SIMPULAN DAN SARAN... 40
Simpulan ... 40
Saran ... 40
DAFTAR PUSTAKA ... 41
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kualifikasi DNA totalBegomovirusberdasarkan nilai adsorbansi ... 21 2 Hasil analisis kesejajaran gen protein selubungBegomovirus... 29 3 Nilai penyejajaran (alignment score) gen protein selubung rekombinan
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur genomBegomovirusBipartit dan Monopartit ... 6 2 Gejala infeksiBegomoviruspada tanaman Tomat (A) dan
Tembakau (B)... 7 3 Situs pemotonganEcoR1 pada plasmidpGEMT-Easy... 14 4 Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer AV1 terhadap 4 isolat
Begomovirus... 22 5 Klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar hasil seleksi biru-putih (A)
dan replika klon rekombinan (B)... 24 6 Hasil isolasi plasmid terhadap 14 klon rekombinan Ngluwar
Begomovirus... 25 7 Pemotongan klon rekombinan menggunakan enzim restriksiEcoR1 ... 27 8 Kladogram sekuen klon rekombinanBegomovirus,Ngluwar A dan B
dibandingkan dengan ke-12 isolatBegomovirus... 31 9 Hubungan kekerabatan gen protein selubung rekombinanBegomovirus
isolat Ngluwar A dengan beberapaBegomovirusyang terdapat di
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubungBegomovirus hasil
amplifikasi PCR ... 47 2 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirusisolat Ngluwar A... 48 3 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirusisolat Ngluwar B ... 49 4 Hasil penyejajaran dan kaldogram terhadap ketiga gen protein selubung
Begomovirus: rekombinan isolat Ngluwar A (A), rekombinan isolat
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Begomovirus dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi dengan luas serangan yang tinggi pula. Serangan Begomovirusdi Indonesia yaitu pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan bahwa kejadian penyakit pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh
Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000 dan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Kehilangan hasil pada cabai besar saat itu mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat ini Begomovirus
masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus penyebab penyakit pada tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut
Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus(PYLCIV).
Begomovirus merupakan anggota Famili Geminiviridae yaitu pada Subkelompok III (ICTVdB 2006). Begomovirus merupakan anggota geminivirus dengan jumlah spesies yang paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies dengan tanaman dikotil sebagai inangnya dan ditularkan oleh vektor kutu kebul
Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Secara morfologi, Begomovirus
memiliki partikel yang tidak beramplop, berbentuk ikosahedral simetri dan ditemukan selalu berpasangan atau geminate (kembar), dengan ukuran partikel masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005). Asam nukleat Begomovirus
berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom berbentuk sirkuler dan ditemukan dalam bentuk monopartit (terdiri dari satu genom) atau bipartit (terdiri dari dua genom) (ICVdB 2006; Van Regenmortelet al. 2000; Voyles 2002).
Diketahui bahwa Begomovirus memiliki keragaman genetik yang tinggi. Santoso (2008) melaporkan adanya keragaman genetik di antara isolat-isolat
ToLCV-Java (Tobacco Leaf Curl Virus-Java), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat dengan AYVV-China (Ageratum Yellow Vein Virus-China) sedangkan isolat Kaliurang berkerabat dengan TYLCV-China (Tomatto Yellow Leaf Curl
Virus-China) atau ToLCV-Laos (Tobacco Leaf Curl Virus-Laos). Trisno (2010) juga melaporkan mengenai keragaman genetik 11 isolat Begomovirus pada tanaman cabai di Sumatera Barat yang terbagi menjadi tiga kelompok. Keragaman genetik yang tinggi ini di duga karena adanya kejadian rekombinasi genetik di antara isolat-isolat Begomovirus. Sifat penularan Begomovirus melalui vektor dengan penularan secara tunggal atau bersamaan dengan strain yang berbeda maupun geminivirus lainnya pada tanaman inang yang sama maupun berkerabat dekat turut menentukan peluang terjadinya rekombinasi genetik yang tinggi antar isolat-isolat Begomovirus. Implikasi dari keragaman genetik yang tinggi ini menjadi bahan pertimbangan bagi para pemulia tanaman untuk merakit tanaman yang tahan terhadap Begomovirus, yaitu untuk merakit varietas yang tahan terhadap beberapa isolat Begomovirus atau merakit beberapa varietas tahan untuk isolat
Begomovirus tertentu. Selain itu informasi mengenai keragaman genetik ini bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan cepat.
perbedaan strain antar virus sehingga dapat digunakan untuk menelusuri hubungan genetik dan keragaman virus (Gilbertson et al. 1993), seperti yang dilakukan oleh Sudiono et al. (2004) yang menemukan adanya 2 strain
Begomovirus yang berbeda yang menyerang cabai di Jawa Barat. Teknik ELISA merupakan teknik deteksi virus berdasarkan pada pengujian serologi. Beberapa keunggulan teknik ELISA yaitu memberikan hasil pengujian yang sensitif, mampu menyajikan data kuantitatif dan prosedur ELISA dapat dibuat otomatisasi (Agrios 2005). Akan tetapi teknik ini memiliki kelemahan yaitu penyediaan antigen yang spesifik membutuhkan alokasi waktu yang lama dengan biaya yang tidak murah. Khususnya untuk geminivirus, sampai saat ini ketersediaan antiserum dan stabilitasnya masih menjadi faktor penghambat utama untuk memanfaatkan teknik ini sebagai alat deteksi yang efektif dan efisien. Hal tersebut disebabkan oleh sifat fisik dan kimia partikel virus yang membuatnya sulit untuk dimurnikan dalam bentuk yang stabil, sifat imunogenik dari virion yang lemah, homologi protein selubung terutama bagi virus-virus yang ditularkan oleh B. tabaci (Roberts et al. 1984). Teknik deteksi geminivirus berbasis asam nukleat dengan prinsip hibridisasi menggunakan pelacak DNA telah banyak digunakan untuk menjawab kelemahan dari teknik deteksi PCR maupun ELISA. Prinsip teknik deteksi ini yaitu terjadinya komplementasi asam nukleat antara asam nukleat pelacak dengan genom virus. Beberapa kelebihan teknik deteksi ini dibandingkan dengan teknik deteksi geminivirus lainnya yaitu tingkat spesifisitas yang tinggi, relatif mudah dan pelaksanaannya cepat dengan jumlah sampel yang banyak (Aidawati 2006; Rubioet al.2003). Selain spesifisitas yang tinggi, teknik ini mampu menunjukkan korelasi positif antara akumulasi DNA virus yang dideteksi dengan intensitas gejala (Romet al.1993; Rubioet al.2003).
mencakup sebagian daerah ORF V1 yang menyandikan protein selubung dan ORF C1 yang menyandikan gen replikasi, yang dilabel dengan digoxigenin, yang bersifat universal terhadap geminivirus dan mampu mendeteksi keberadaan geminivirus pada sap tanaman hingga faktor pengenceran 10-2. Untuk menjawab kebutuhan akan teknik deteksi berbasis pada uji asam nukleat dengan teknik hibridisasi Dot-Blot yang efektif dan efisien, maka dalam penelitian ini telah dikonstruksi suatu pelacak DNA yang bersifat spesifik terhadap Begomovirus
dengan memanfaatkan gen protein selubungBegomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus yang disandikan oleh ORF AV1 pada DNA A Begomovirus merupakan daerah genom yang berfungsi sebagai pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan virus. Selain itu gen protein selubung memiliki daerah genom yang mempunyai runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA geminivirus dalam pengembangan teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus
(Morinet al.2000; Astieret al.2001; Fraquetet al. 2005; Santoso 2008). Teknik deteksi yang dikembangkan dalam penelitian ini diharapkan kelak bermanfaat sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh geminivirus khususnya
Begomovirus sekaligus juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman yang rentan, resisten maupun toleran terhadapBegomovirus.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
TINJAUAN PUSTAKA
Karakter MolekulerBegomovirus
Begomovirus merupakan anggota geminivirus dengan jumlah spesies yang paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies dengan tanaman dikotil sebagai inangnya. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) mengklasifikasikan Begomovirus ke dalam Famili Geminiviridae yaitu pada Subkelompok III (ICTVdB 2006). Secara morfologi, Begomovirus memiliki partikel yang tidak beramplop dengan bentuk partikel yang memanjang dan ikosahedral simetris. Partikel virus ditemukan selalu berpasangan atau geminate
(kembar) sebagai ciri khas famili geminiviridae sehingga disebut geminivirus, dengan ukuran partikel masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005).
Asam nukleat Begomovirus berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom
Begomovirusberbentuk sirkuler. Ditemukan dalam bentuk monopartit (terdiri dari satu genom) maupun bipartit (terdiri dari dua genom). Umumnya Begomovirus
ditemukan dalam bentuk bipartit, dengan ukuran masing-masing genom yang disebut DNA-A dan DNA-B sekitar 2,5-3,0 kb, sehingga total ukuran genom mencapai 5,5 kb (ICVdB 2006; Van Regenmortelet al. 2000; Voyles 2002).
Gambar 1 Struktur genomBegomovirusBipartit dan Monopartit
Genom bipartit Begomovirus terdiri dari DNA A dan DNA B. Keduanya memiliki daerah intergenik (IR = Intergenic Region) yang mencakup daerah
common region (CR) dengan fungsi pengaturan (regulatory function) yang terdiri dari beberapa ORF (Open Reading Frame). Pada IR/CR terdapat promotor dan urutan basanya sebagai awal terjadi transkripsi.
Pada DNA A, terdapat protein selubung yang disandikan olehCoat Protein gene (ORF AV1) berfungsi sebagai pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan virus. Gen penyandi selubung protein merupakan daerah genom yang mempunyai runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA geminivirus. Komponen AV1 juga berperan dalam melindungi ssDNA virus dan penularan oleh vektor ketika virus masuk ke dalam sistem pencernaan serangga vektor dengan melindungi partikel virus dari degradasi (Morin et al. 2000; Astier et al. 2001; Fauquet et al. 2005). CP dan Pre CP (BV1) berperan untuk pergerakan keluar masuk genom virus dari inti sel inang (Briddon et al. 1989). ReplikasiBegomovirus diatur olehRep gene
pada ORF AC1. Adapun transkripsi Begomovirusdiaktivasi olehTrAP gene pada ORF AC2 yang merupakan protein aktivator transkripsi. Pada ORF AC3 terdapat
Ren gene yang berfungsi sebagai pembentukan protein untuk penginduksi replikasi (replication enhancer). Ekspresi gejala penyakit diatur regulasinya oleh C4 pada DNA A. Pada DNA B dapat ditemukan adanya Nuclear Shuttle Protein (NSP) gene pada ORF BV1 yang berfungsi sebagai penyandi virion DNA B dan membentuk nuclear shuttle protein. Selain itu pada DNA B, terdapat Movement Protein (MP) gene (ORF BC1) yang berfungsi sebagai protein yang bertanggungjawab untuk perpindahan dari satu sel ke sel lain dalam plasmodesmata inang (Fauquet et al. 2005; Hull 2002; Van Regenmortel et al. 2000). Genom monopartit merupakan kombinasi antara DNA A dan DNA B pada genom bipartit yang dikemas dalam satu partikel dengan fungsi yang sama (Fauquetet al. 2005; Hull 2002).
Penyakit Tanaman yang DisebabkanBegomovirus
dwarf mosaic virus, Bean golden mosaic virus, Bean golden yellow mosaic virus, Tomato golden mosaic virus, Watermelon chlorotic stunt virus, Watermelon curly mottle virus (Fauquet et al. 2005). Sebagian besar dari tanaman inang tersebut merupakan tanaman dengan nilai ekonomi tinggi.
Infeksi Begomovirus pada tanaman menunjukkan gejala yang bervariasi. Namun secara umum gejala berupa perubahan warna dan bentuk daun yaitu: daun mengeriting dan berwarna kuning, diikuti dengan ukuran daun yang mengecil, tanaman menjadi kerdil (Gambar 2), ukuran buah yang menjadi kecil sehingga pada akhirnya menyebabkan penurunan hasil mencapai 100%. Keberagaman gejala tersebut disebabkan oleh beberapa faktor antara lain: strain virus, kultivar dan umur tanaman pada waktu terinfeksi serta kondisi lingkungan (Polston & Anderson 1997).
Gambar 2 Gejala infeksiBegomoviruspada tanaman tomat (A) dan tembakau (B)
Begomovirus hanya dapat ditularkan melalui serangga vektor. Vektor
Begomovirus adalah serangga ordo Hemiptera, family Aleyrodidae, yaitu: kutu kebul (Bemisia tabaciGennadius). VektorB. tabacimemiliki sifat penularan yang persisten, dengan periode akuisisi yaitu fase pengambilan virus melalui proses makan (sekitar 10 menit), periode laten yaitu fase virus tertahan pada vektor sebelum periode inokulasi (sekitar 4-21 jam) dan periode inokulasi yaitu fase makan inokulasi (12-24 jam) (Fauquetet al. 2005).
Keragaman GenetikBegomovirus
Keragaman genetikBegomovirus yang tinggi merupakan salah satu kendala dalam pengendalian penyakit dan kerusakan yang ditimbulkan. Rekombinasi genetik pada Begomovirus adalah kunci utama yang berperan dalam keragaman diversifikasi dan evolusi Begomovirus, dengan frekuensi rekombinasi tertinggi
pada N-terminal dari ORF C1/AC1 yang menyandikan genReplication-associated proteinyang berperan dalam proses replikasi virus (Prasana & Rai 2007).
Keragaman genetik Begomovirus yang tinggi berasosiasi dengan tanaman inangnya dimana terjadi transfer genetikBegomovirus dari tanaman inang aslinya yang liar ke tanaman budidaya yang menyebabkan rekombinasi genetik
Begomovirus (Ambrozevicius et al. 2005). Selain itu, Ala-Poikela et al. (2005) menyatakan bahwa infeksi ganda Begomovirus pada suatu tanaman inang menyebabkan terjadinya rekombinasi genetik dan memberi peluang bagi munculnya strain baru Begomovirus. Rekombinasi antara geminivirus dapat berimplikasi pada lahirnya strain baru yang sangat patogenik yang mampu mematahkan ketahanan tanaman inangnya seperti yang dilaporkan oleh Monci et al.(2002) yang menemukan adanya rekombinasi alami antaraTomato yellow leaf curl Sardinia virus dan Tomato yellow leaf curl virus yang menghasilkan suatu fenotip baru yang bersifat patogenik dan menyebabkan epidemi penyakit di Spanyol. Keragaman genetikBegomovirusturut dipengaruhi oleh vektornya yaitu
B. tabaci sebagai satu-satunya agen penularan Begomovirus yang juga memiliki keragaman genetik yang tinggi seperti yang telah dilaporkan oleh Aidawati (2006).
Keragaman genetikBegomovirus memiliki berbagai implikasi. Diantaranya bagi para pemulia tanaman informasi keragaman genetik dapat digunakan sebagai acuan dalam pendekatan perakitan varietas tahan, untuk merakit varietas yang tahan, untuk isolat-isolat Begomovirustertentu saja. Informasi keragaman genetik bermanfaat dalam perakitan suatu teknik deteksi, dengan melihat suatu bagian yang memiliki konservasi tinggi pada genom Begomovirus dan peluang terendah untuk terjadinya rekombinasi.
DeteksiBegomovirus
serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), teknik hibridisasi DNA dengan menggunakan pelacak DNA (DNA probe). Selain teknik PCR, metode deteksi hibridisasi Dot-Blot dengan menggunakan pelacak DNA merupakan metode yang telah umum digunakan untuk mendeteksi keberadaan
Begomovirus. Keberhasilan teknik deteksi ini sangat bergantung pada spesifisitas pelacak (probe) yang digunakan (Keller & Mark 1992). Teknik hibridisasi ini mampu menjawab kekurangan teknik deteksi lainnya (PCR dan ELISA) yaitu: tingkat spesifisitas yang tinggi, mudah dan cepat dilakukan dengan jumlah sampel yang banyak, seperti yang dilaporkan oleh Rom et al. (1993), Pico et al. (1999) dan Rubio et al. (2003) yang mendeteksi TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus) dengan teknik hibridisasi menggunakan pelacak DNA TYLCV yang dilabel dengan digoxigenin.
Tingkat spesifisitas yang tinggi dicerminkan oleh kemampuan teknik deteksi ini untuk mendeteksi keberadaan DNA virus dalam titer virus yang rendah. Dilaporkan oleh Aidawati (2006) bahwa pelacak DNA yang dilabel dengan digoksigenin berhasil mendeteksi cairan perasan tanaman yang terinfeksi
Begomovirushingga pengenceran 10-2.
Rubio et al. (2003) menyatakan bahwa teknik deteksi hibridisasi mampu memberikan informasi terkait adanya korelasi yang positif antara gejala dan titer virus pada tanaman terinfeksi. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Rom et al. (1993) yang menunjukkan bahwa akumulasi DNA virus yang dideteksi dengan teknik hibridisasi berkorelasi positif dengan intensitas gejala. Oleh karena itu selain bermanfaat sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), Cimanggu-Bogor, sejak Juni 2008 hingga Februari 2010.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian ini meliputi lima tahapan utama yaitu: (1) isolasi DNA total Begomovirus, (2) amplifikasi DNA Begomovirus, (3) kloning DNA
Begomovirus hasil amplifikasi dan konfirmasi klon rekombinan, (4) karakterisasi gen Begomovirus dan (5) hibridisasi DNA dengan pelabelan digoxigenin menggunakanDIG-High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit I (Roche 2004).
Isolasi DNA TotalBegomovirus
Isolat Begomovirus dalam penelitian ini berasal dari tanaman tomat yang terinfeksi oleh Begomovirus yang diperoleh dari Segunung-Cianjur, Seyegan-Sleman, Ngluwar-Magelang dan Sedan-Rembang. DNA total diperoleh dengan teknik isolasi DNA metode CTAB (Doyle & Doyle 1990).
kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, lalu ditambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M CH3COONa, pH 5,2 (408,1 g Na-asetat.3H2O di dalam 800 ml H2O) dan dicampur dengan baik. Setelah itu, ditambahkan lagi dengan 2/3 x volume isopropanol atau 2,5 x volume etanol absolut yang bertujuan untuk mengendapkan DNA dengan membolak-balik tabung perlahan. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu -20°C selama 60 menit atau semalam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit untuk mengendapkan DNA. Endapan DNA yang diperoleh kemudian dikeringanginkan.
Sebagai tahap akhir dari isolasi DNA adalah pencucian dan suspensi DNA. Pencucian DNA dilakukan dengan etanol 70% yang berfungsi untuk membersihkan sisa-sisa garam maupun kontaminan lainnya yang mengendap. Selanjutnya endapan dilarutkan dengan bufer TE 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) sebanyak 50-100 μl.
Amplifikasi DNABegomovirus
Amplifikasi DNA Begomovirus dilakukan dengan teknik PCR yang dilakukan mengikuti prosedur Rojas et al. (1993) dengan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1 yang akan mengamplifikasi bagian gen protein selubung (coat protein). Sekuen nukleotida
primer CPPROTEIN-V1 yaitu: 5’TAATTCTAGATG
dikonfirmasi dengan perunutan nukleotida dan digunakan sebagai DNA sisipan (insert) dalam proses ligasi.
Pengklonan DNABegomovirusHasil Amplifikasi
Tahapan pengklonan meliputi 3 kegiatan yaitu: Ligasi, Transformasi dan Konfirmasi klon rekombinan.
Ligasi
Ligasi merupakan proses penyambungan antara vektor dan DNA sisipan dengan bantuan enzim ligase. Ligasi dilakukan mengikuti metode Promega (2007). Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR disisipkan pada plasmidpGEM-T
Easydengan bantuan enzim ligase. Reaksi ligasi terdiri atas 60 ng fragmen DNA, 50 ng DNA vektor pGEM-T Easy, 5 μl 2x bufer ligasi T4 DNA ligase, 1 μl T4
DNA Ligase (3 Weiss Unit/μl) dan ditambahkan ddH2O sampai mencapai volume akhir 10 μl. Bahan-bahan yang sudah dicampur dalam tabung mikro kemudian diinkubasi pada suhu 4oC selama 16 jam.
Transformasi
Tahapan ligasi dilanjutkan dengan proses introduksi rekombinan yang dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Hasil ligasi diintroduksi ke dalam sel E. coli DH5α yang kompeten sebagai inang, kemudian ditumbuhkan dalam media yang mengandung agen seleksi untuk mengetahui adanya sisipan di dalam plasmid.
Penyiapan Bakteri Kompeten. BakteriE. coli DH5α yang akan digunakan dalam tahapan transformasi harus berada dalam kondisi kompeten. Penyiapan bakteri kompeten dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Sebuah koloni bakteri
Endapan yang diperoleh disuspensi dengan menambahkan 1 ml 0,1 M CaCl2, divortex secara perlahan-lahan dan dibiarkan di dalam es selama 10 menit. Setelah itu suspensi bakteri disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 1 menit. Endapan yang diperoleh kemudian disuspensi dengan hati-hati ke dalam 200 l LB cair dan dibiarkan dalam es selama 15 menit. Bakteri yang kompeten tersebut siap untuk digunakan dalam tahapan transformasi.
Introduksi DNA Rekombinan.Introduksi DNA dilakukan dengan mencampurkan 10-50 ng plasmid hasil ligasi (volumenya kurang dari 10 μl) dengan 100-200 μl bakteri kompeten dalam 1,5 ml tabung mikro dan setelah itu diinkubasi pada es selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan perlakuan panas (heat shock) pada suhu 42oC selama 90 detik dan segera diinkubasi pada es selama 2 menit. Sebanyak 250 μl media LB diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dengan kecepatan 250 rpm. Setelah itu bakteri disebar pada media LB padat yang telah mengandung 100 mg/l ampisilin. Pada media LB ditambahkan juga 0,1 M IPTG (10 μl/ cawan) dan 2% X-Gal (50 μl/ cawan) untuk memudahkan seleksi koloni. Biakan tersebut dinkubasi pada suhu 37oC semalam.
Konfirmasi Klon Rekombinan
Konfirmasi klon rekombinan dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu: seleksi plasmid rekombinan dengan media selektif, isolasi plasmid rekombinan, isolasi DNA sisipan melalui pemotongan dengan enzim restriksi EcoR1 dan perunutan DNA (sequensing) terhadap fragmen sisipan dari klon tersebut sehingga klon yang diperoleh dipastikan membawa fragmen DNA target
Begomovirus.
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif. Seleksi plasmid rekombinan dilakukan berdasarkan warna koloni yang tumbuh pada media selektif (LB + Ampisilin + IPTG/X-Gal). Koloni berwarna putih akan dipilih dan dikonfirmasi pada tahapan berikutnya.
Isolasi Plasmid Rekombinan. Isolasi plasmid dilakukan dengan menggunakan
kedalam tabung mikro yang pangkalnya meruncing (konical). Setelah itu bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada 13.000 rpm, pada suhu 4oC selama 5 menit dan hasil endapan bakteri disuspensi dalam 250 μl bufer resuspensi sel (50 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Setelah tersuspensi dengan baik, yaitu ditandai dengan tidak adanya endapan (atau gumpalan), bakteri dilisis dengan penambahan 250 μl bufer lisis (0,2 M NaOH; 1% SDS). Supaya bufer lisis tercampur rata, tabung reaksi dibalik-balikkan sebanyak 4-6 x dan dibiarkan 1-2 menit. Bakteri yang telah lisis ditambah 350 μl bufer netralisasi (1,32 M potasium asetat, pH 4,8) dan tabung reaksi dibalik-balikkan 4-6 x hingga bufer netralisasi tercampur merata. Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Cairan jernih dibagian atas diambil dan dipindahkan ke kolom tabung reaksi yang bersih. Setelah itu ditambahkan 500 μl bufer pencuci dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, diulangi kembali kemudian sentrifugasi kolom kosong (tanpa cairan) pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Langkah berikutnya adalah memindahkan kolom ke tabung mikro baru dan steril, menambahkan 50 μl bufer elusi, inkubasi selama 2 menit di suhu ruang dan sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit.
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi. DNA sisipan dipisahkan dari plasmid pGEM-T menggunakan enzim restriksi EcoR1 (Gambar 3).
Sebanyak 10 μl DNA plasmid rekombinan, 2,5 μl larutan penyangga 3NIB dan 1,5 μl enzim restriksi EcoRI (10 unit/μl) dimasukkan ke dalam tabung mikro yang kemudian ditambah H2O hingga volume akhir larutan menjadi 25 μl. Larutan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. Visualisasi hasil pemotongan dengan enzim restriksi dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,5% seperti diuraikan sebelumnya.
Perunutan DNA. Untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh dari klon rekombinan tersebut adalah DNA Begomovirus maka perlu dilakukan perunutan nukleotida dengan teknik perunutan. Perunutan dilakukan oleh PT. Macrogen, Korea Selatan.
Karakterisasi Gen Protein SelubungBegomovirus
Gen protein selubung Begomovirus yang diperoleh dalam penelitian ini selanjutnya akan dikarakterisasi melalui beberapa analisis yaitu analisis kesejajaran urutan nukleotida gen protein selubung dengan program BLAST (Basic Local Aligment Search Tools) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dan analisis spesifisitas gen protein selubung dilakukan dengan program multiple alignment, Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/Clustal W). Melalui tahapan analisis ini dipastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh adalah DNABegomovirusdan memiliki tingkat spesifisitas yang tinggi terhadap anggota Begomovirus lainnya sebagai salah satu syarat utama dalam pengembangannya sebagai metode deteksi .
Hibridisasi DNA
Hibridisasi pelacak DNA sebagai metode deteksi Begomovirus meliputi beberapa tahapan yaitu: persiapan sampel uji, persiapan membran, pelabelan pelacak DNA, prehibridisasi, pencucian membran, hibridisasi dan deteksi.
Persiapan Sampel Uji
Pengujian spesifisitas pelacak DNA dilakukan dengan menggunakan beberapa tanaman sampel yaitu: tanaman tomat sehat (bebas infeksi virus) sebagai kontrol negatif, tanaman tomat terinfeksi Begomovirus sebagai kontrol positif, tanaman target terdiri dari gulma Babadotan (Ageratum conyzoides) dan tanaman tomat yang dikumpulkan dari lapangan yang menunjukkan gejala infeksi
yang terinfeksi ToCV (Tomatto Chlorosis Virus), tanaman cabai yang terinfeksi ChiVMV (Chilli Veinal Mottle Virus) dan tanaman tembakau yang terinfeksi TMV (Tobacco Mosaic Virus). Sampel yang akan digunakan terdiri dari 3 jenis penyiapan: 1) DNA total tanaman yang diperoleh dengan metode ekstraksi Doyle&Doyle yang dimodifikasi (1990), 2) Cairan perasan tanaman yang diperoleh berdasarkan prosedur Gilbertson et al. (1991) yaitu 1 gr daun tanaman dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 200 μl bufer TE (pH 7,5) kemudian digerus dengan pistil dan selanjutnya tabung tersebut disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, dan 3) DNA produk amplifikasi menggunakan primer spesifik AV1 dengan teknik PCR (Rojaset al.1993). Sebagai pembanding digunakan plasmid rekombinan utuh, sisipan gen protein selubung Begomovirus
dan vektor pGEM-TEasyserta beberapa plasmid rekombinanBegomovirusyaitu: plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen), plasmid rekombinanFull LengthdanpartialPYLCV (WS Tsai, AVRDC). Seluruh sampel yang disiapkan dikuantifikasi (1µg/µl) melalui pengukuran nilai absorbansinya dengan spektrofotometer. Pengujian sensitifitas teknik hibridisasi dilakukan melalui pengenceran berseri terhadap seluruh sampel yaitu: 10, 10-1,10-2,10-3,10 -4
,10-5,10-6.
Persiapan Membran
Membran nilon Hybond-N (Roche) dipotong sesuai kebutuhan kemudian dicuci selama 3 menit dalam 50 ml 20x SSC (35,06 g NaCl, 17,64 g Na sitrat dalam 200 ml liter larutan, pH 7), selanjutnya membran dikeringkan di atas kertas saring Whatman steril dan disimpan atau langsung digunakan untuk hibridisasi, dengan meneteskan 1 μl sampel sesuai dengan rancangan perlakuan. Setelah itu membran diberi perlakuan UV-Crosslinkdi ruang gelap selama 3 menit dan dicuci dengan menggunakan air steril dan dikeringanginkan.
Pelabelan Pelacak DNA
Prime, dicampur secara merata, dan di sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit lalu diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya ditambahkan 2l 0,2 M EDTA pH 8 untuk menghentikan reaksi pelabelan.
Prehibridisasi
Membran yang telah diteteskan cairan perasan tanaman terlebih dahulu di prehibridisasi mengikuti metode Roche (2004). Langkah pertama yaitu dengan memanaskan larutan Dig-Easy Hyb (10 ml/100 cm2 membran) pada suhu 37oC selama 30 menit dengan sedikit goyangan. Sementara itu pelacak DNA yang telah dilabel (25 ng/ml) di denaturasi pada suhu 100oC selama 5 menit dan diinkubasi di es dengan segera. Pelacak DNA tersebut kemudian dicampurkan ke dalam Dig-Easy Hyb yang telah dipanaskan. Selanjutnya membran dalam campuran tersebut diinkubasi selama 16 jam.
Pencucian Membran
Membran di cuci dengan larutan yang mengandung 2x SSC dan 0,1% SDS pada suhu 15-25oC dengan sedikit goyangan selama 2x5 menit. Selanjutnya membran dicuci kembali dengan larutan yang mengandung 0,5x SSC dan 0,1% SDS pada suhu 65-68oC dengan sedikit goyangan selama 2x15 menit.
Hibridisasi
Hibridisasi dilakukan mengikuti metode Roche (2004). Membran yang telah diberi perlakuan pada tahapan sebelumnya di cuci selama 1-5 menit dalam bufer pencuci (0,1 MMaleic acid, 0,15 M NaCl, pH 7,5; 0,3%Tween 20) pada suhu 15-25oC dengan sedikit goyangan selanjutnya di inkubasi selama 30 menit pada suhu dan kecepatan goyangan yang sama ke dalam 100 ml Blocking solution. Setelah itu membran dinkubasi ke dalam larutan antibodi selama 30 menit pada suhu dan kecepatan goyangan yang sama. Terakhir membran di cuci dalam bufer pencuci selama 15 menit sebanyak 2 kali.
Deteksi
Membran yang telah dihibridisasi segera diinkubasi ke dalam 20 ml
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Amplifikasi DNA TotalBegomovirus Isolasi DNA Total Begomovirus
Isolasi genom DNA memegang peranan yang sangat penting di dalam tahapan analisis gen secara molekuler seperti amplifikasi DNA dengan teknik
Polymerase Chain Reaction(PCR) dan teknik pengklonan gen. Jika kualitas DNA hasil isolasi tidak baik, tahap analisis selanjutnya mungkin tidak dapat dilakukan (Saunders & Parkers 1999). Kontaminasi DNA oleh polisakarida, protein, fenol, dan berbagai komponen lainnya akan mengganggu kerja dari beberapa enzim, seperti enzim restriksi danTaq DNA Polymerase(Ausubelet al. 1994citAngeles
et al. 2005). Selain itu dalam teknik isolasi DNA yang berasal dari tumbuhan seringkali mengalami masalah karena kandungan polisakarida dan polifenol serta metabolit lain yang mempengaruhi hasil dan kualitas DNA (Sharma et al. 2002; Puchooa & Venkatasamy 2005). Oleh karena itu teknik isolasi yang dapat menghasilkan DNA dengan kualitas yang baik mutlak dilakukan.
DNABegomovirus dari keempat isolatBegomovirus yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu: Segunung-Jawa Barat, Seyegan-Sleman, Ngluwar-Magelang dan Sedan-Rembang diisolasi dengan menggunakan metode isolasi DNA total yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle (1990) yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan 2% polyvinil pyrolidone (PVP) ke dalam bufer ekstraksi. Metode yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle (1990) untuk mengisolasi DNA total
Begomovirus telah banyak dilakukan oleh para peneliti sebelumnya (Aidawati 2006; Santoso 2008; Faizah 2010; Ganefianti 2010) dan menunjukkan hasil yang baik. Prinsip dasar dari teknik isolasi DNA adalah penghancuran jaringan untuk memisahkan sel dan dilanjutkan dengan melisis sel untuk mendapatkan DNA. Penghancuran jaringan dilakukan secara fisik yaitu dengan penggerusan jaringan, karena DNA terletak di dalam sel maka untuk dapat mengekstraknya harus dilakukan pelisisan sel dengan menggunakan bufer ekstraksi CTAB yang mengandung NaCl (Natrium Chloride) dan penambahan β-Mercaptoetanol dan PVP. Penggunaan CTAB bersama-sama dengan NaCl lebih dari 0,5 M dapat memisahkan polisakarida (Peterson et al. 1993) dan penggunaan antioksidan
1997). Pada tahap ini, selain dilakukan lisis sel juga dilakukan pemeliharaan DNA akibat terbukanya sel. Tahapan berikutnya yaitu mengekstrak DNA yang telah dibebaskan dari sel yang dilakukan melalui penambahan Chloroform:Iso-amyl alcohol(24:1) untuk memisahkan DNA tersebut dari protein. Pada tahap ini DNA akan berada pada fase cair sedangkan protein dan komponen lain akan berada pada fase padat (Saunders & Parkers 1999). Tahap penambahan Chloroform: Iso-amyl alcohol sangat diperlukan untuk mengeliminasi senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu kemurnian hasil isolasi DNA. Pengulangan tahap ini tergantung jenis sel, jika di dalam sel banyak mengandung kontaminan sebaiknya tahap ini perlu diulangi sedangkan jika tidak mengandung banyak kontaminan tidak perlu diulangi. Selanjutnya DNA yang berhasil di ekstrak dipresipitasi dengan penambahan etanol absolut atau isopropanol. Waktu presipitasi dapat disesuaikan dengan kandungan DNA dalam sel. Waktu presipitasi yang panjang diperlukan bila kandungan DNA dalam sel rendah, sedangkan bila kandungan DNA dalam sel tinggi mungkin cukup dengan waktu presipitasi yang pendek. Tahap akhir dari isolasi DNA adalah pencucian dan rehidrasi DNA. Pencucian DNA dengan etanol 70% dapat membersihkan sisa-sisa garam maupun kontaminan lainnya yang mengendap. Rehidrasi DNA dengan larutan penyangga TE diperlukan untuk melarutkan DNA yang akan digunakan lebih lanjut. Metode Doyle & Doyle (1990) yang dimodifikasi berhasil digunakan untuk mengisolasi keempat isolat Begomovirus dari tanaman tomat (Data tidak ditampilkan). DNA total Begomovirus tersebut selanjutnya dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif sebelum digunakan untuk tahapan penelitian selanjutnya.
gel elektroforesis. Hasil yang baik diindikasikan dengan pita DNA yang tebal dan tegas serta bersih. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurniannya terhadap kontaminan protein dapat diamati melalui pengukuran nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. DNA diklasifikasikan murni jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm terhadap 280 nm berada pada kisaran 1,8-2,0 (Suharsono 2006). Hasil kuantifikasi dan kualifikasi terhadap DNA total ke empat isolat Begomovirus menunjukkan hasil yang baik dengan kisaran tingkat kemurnian 1,78-1,89 dan digunakan pada tahapan selanjutnya yaitu pengamplifikasian gen protein selubung (coat protein) Begomovirus dengan teknik PCR (Tabel 1).
Tabel 1 Kualifikasi DNA totalBegomovirusberdasarkan nilai adsorbansi
Nomor Nama Isolat A260/280 nm
1 Segunung - Jawa Barat 1,83
2 Seyegan – Sleman 1,80
3 Ngluwar – Magelang 1,89
4 Sedan – Rembang 1,78
Amplifikasi Gen Protein Selubung Begomovirus
Gen protein selubung (coat protein) Begomovirus diamplifikasi dengan teknik PCR mengikuti prosedur Rojas et al. (1993) dengan primer spesifik untuk gen AV1 Begomovirus (AVRDC, Taiwan) yaitu: CPPROTEIN-V1 (5’TAATTCTAGATG TCGAAGCGACCCGCCGA-3’) dan CPPROTEIN-C1 (5’-GGCCGAATTCTTAATTTTGAACAGAATCA-3’) yang secara spesifik mengamplifikasi bagian gen protein selubungBegomovirus.
780 bp
sampel kontrol positif (Gambar 4 kolom 3), tetapi pita DNA tidak tampak pada gel agarosa untuk sampel kontrol negatif (Gambar 4 kolom 1 dan 2).
Gambar 4 Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer AV1 terhadap 4 isolat
Begomovirus. M=Marker 100 bp, 1=Kontrol negatif PCR yaitu reaksi tanpa DNA template, 2= DNA total tanaman cabai sehat, 3=Kontrol positif PCR (DNA Begomovirus isolat Kaliurang-Sleman), 4=
Begomovirus isolat Sedan-Rembang, 5= Begomovirus isolat Segunung-Cianjur, 6= Begomovirus isolat Ngluwar-Magelang, 7=
Begomovirusisolat Seyegan-Sleman
Fragmen gen protein selubung hasil amplifikasi tersebut akan digunakan pada tahapan berikutnya yaitu pengklonan gen protein selubung Begomovirus.
Sebelumnya dilakukan pengisolasian fragmen gen protein selubung dari gel agarosa dengan teknik elusi, sehingga dari tahapan ini akan diperoleh fragmen tunggal gen protein selubung. Dalam tahapan ini gen protein selubung
Begomovirus isolat Ngluwar-Magelang terpilih sebagai DNA target dalam pengklonan gen protein selubung Begomovirus karena memiliki tingkat kemurnian DNA yang tertinggi (Tabel 1).
Pengklonan Gen Protein SelubungBegomovirus
Gen protein selubung memiliki peranan yang sangat penting tidak hanya sebagai pelindung genom virus juga berperan dalam penularan, pergerakan virus pada vektor dan inti sel inang serta perkembangan gejala pada tanaman inang (Briddon et al. 1989). Berdasarkan hal tersebut pengklonan gen protein selubung virus banyak dikembangkan dalam berbagai tujuan penelitian. Santoso (2008) melaporkan keberhasilannya menggunakan klon rekombinan gen protein selubung
Begomovirus dari ORF AV1 dalam pengembangan kultivar tahan Begomovirus
dengan strategi pendekatanpathogen derived resistance(PDR).
Pada penelitian ini, gen protein selubung Begomovirus isolat Ngluwar-Magelang disisipkan pada plasmid pGEM-T Easy. Pemilihan vektor pGEM-T Easy didasarkan pada beberapa sifat-sifat nya antara lain: 1) dapat digunakan untuk mengkloning fragmen hasil PCR yang menggunakan DNA polymerase
tertentu yang akan menghasilkan fragmen dengan ujungnya mempunyai ekor basa A dimana vektor pGEM-T memiliki ujung basa T, 2) vektor ini memiliki
polycloning sites yang akan mempermudah pemilihan enzim restriksi untuk kloning, 3) vektor ini juga merupakan plasmid yang memiliki kemampuan propagasi yang tinggi sehingga sangat membantu di dalam perbanyakannya pada sel kompetenE. coli(Santoso 2008).
Tahapan utama dalam pengklonan gen yaitu proses ligasi dan transformasi. Proses ligasi yaitu menggabungkan DNA sisipan (fragmen tunggal gen protein selubung) ke dalam vektor. Hasil ligasi antara plasmid sebagai vektor dengan suatu fragmen DNA diintroduksi ke dalam E. coli sebagai inangnya yang kemudian ditumbuhkan dalam media yang telah diberi ampisilin, IPTG dan X-gal sebagai agen seleksi (proses transformasi). Bakteri yang digunakan dalam proses transformasi adalah bakteri E. coli yang telah kompeten. Pada kondisi normal, bakteri ini mempunyai keterbatasan dalam mengambil DNA, sehingga harus diberi perlakuan fisik dan kimia tertentu agar menjadi kompeten dalam mengambil DNA. Keberhasilan proses ligasi hanya dapat diketahui dari keberhasilan proses transformasi melalui metode seleksi biru-putih
Konfirmasi Klon Rekombinan
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif
penyisipan terletak pada gen lacZ yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah molekul X-gal dari tidak berwarna menjadi berwarna biru, sehingga pada media yang sudah ditambah X-gal dan IPTG sebagai inducer gen lacZ akan terbentuk koloni putih, sebagai hasil dari ketidakmampuan gen lacZ mengekspresikan β-galaktosidase karena tersisipi oleh fragmen DNA. Berdasarkan seleksi rekombinan tersebut dalam tahapan penelitian ini berhasil diperoleh 14 koloni yang berwarna putih yang di duga merupakan rekombinanBegomovirus Ngluwar (Gambar 5).
Gambar 5 Klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar hasil seleksi biru-putih (A) dan replika klon rekombinan (B)
Isolasi Plasmid Rekombinan
Isolasi plasmid bertujuan untuk memperoleh DNA plasmid rekombinan dari bakteri kompeten sebagai inang. Melalui tahapan ini akan diperoleh plasmid rekombinan yang akan digunakan pada tahapan berikutnya. Hasil isolasi plasmid yang belum murni atau masih terkontaminasi oleh protein ataupun senyawa lainnya akan mengganggu atau bahkan menyebabkan kegagalan tahap reaksi selanjutnya.
Prinsip isolasi plasmid yaitu melisis membran sel, memisahkan DNA dari protein dan RNA dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom. Tahap awal dari isolasi plasmid yaitu melakukan suspensi biakan bakteri dengan penambahan bufer resuspensi yang terdiri dari Tris HCl dan EDTA. Tris HCl berfungsi mempertahankan lingkungan alkali dimana DNA sangat baik disimpan pada pH 7.5-8.2 dan EDTA berfungsi untuk menon-aktifkan nuklease dan mengkelat Mg2+ yang berasosiasi dengan membran luar sehingga terjadi destabilisasi membran (Rohde 1994). Tahapan berikutnya yaitu melisis sel dengan
M K+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 penambahan bufer lisis yaitu NaOH dan SDS, yang mampu merusak membran sel dan menyebabkan DNA terdenaturasi. Selanjutnya terjadi penurunan pH, kemudian SDS akan mempresipitasi komponen membran, DNA kromosom dan komponen sel lainnya. Dalam tahap ini DNA plasmid tidak terdenaturasi dan masih ada dalam suspensi karena ukurannya yang kecil dan berbentuk sirkuler. Tahapan berikutnya yaitu melakukan purifikasi terhadap DNA plasmid yang telah dinetralisasi sebelumnya dengan bufer pencuci yang bertujuan untuk membebaskan DNA plasmid dari protein-protein kecil dan senyawa lainnya yang masih tersisa. Setelah itu DNA plasmid diperoleh melalui sentrifugasi dengan bufer elusi. DNA plasmid yang diperoleh kemudian diendapkan dengan penambahan etanol yang akan mengikat air sehingga DNA plasmid akan berada pada fase padat.
Sebanyak 14 klon rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar yang diperoleh dalam penelitian ini telah berhasil diisolasi plasmidnya, dengan plasmid AV1 asal Tomat yang mengandung gen selubung protein AV1, TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen) sebagai pembanding (Gambar 6).
Gambar 6 Hasil isolasi plasmid terhadap 14 klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar. Keterangan: M=Marker 1 Kb, K+=Plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen), 1-14= klon DNA rekombinan
Begomovirusisolat Ngluwar A tanpa pemotongan enzim restriksi EcoR1.
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi
Enzim restriksi endonuklease atau yang biasa disingkat enzim restriksi memiliki kemampuan untuk memotong DNA secara spesifik, terbatas pada daerah atau situs yang dikenalinya (Glick & Paternak 1998). Penggunaan enzim restriksi dilakukan dengan berbagai tujuan, diantaranya untuk mengetahui ukuran molekul 1000 bp
DNA terutama DNA dengan ukuran besar atau linier, mengisolasi fragmen tertentu dan membuat celah sisipan (Suharsono & Widyastuti 2006). Enzim restriksi bekerja dengan dua tahap, yaitu pengenalan terhadap sekuen DNA dan selanjutnya pemotongan DNA. Beberapa faktor yang menentukan keberhasilan proses pemotongan DNA dengan enzim restriksi antara lain: kondisi enzim, bufer, suhu inkubasi serta kemurnian DNA.
Pada penelitian ini tujuan digunakan enzim restriksi yaitu untuk membuat celah sisipan pada plasmid pGEMT-Easy sebagai langkah konfirmasi untuk menjawab pertanyaan apakah klon rekombinan yang diperoleh berhasil disisipi oleh fragmen gen protein selubung Beegomovirusatau tidak. Enzim restriksi yang digunakan yaitu EcoR1 yang mempunyai situs pengenalan enam nukleotida.
EcoRI akan mengenali situs GAATTC dan akan memotong antara basa G dan A dan menghasilkan ujung tidak rata 5’ overhang. Pemilihan EcoR1 didasarkan pada situs pemotongan yang terdapat pada plasmidpGEMT-Easy,dimana terdapat situs pemotonganEcoR1 yang mengapit celah MCS (multicloning sites) sehingga memungkinkan untuk membebaskan DNA sisipan hanya menggunakan satu enzim saja, yaituEcoR1 (Gambar 3).
Pemotongan klon rekombinanBegomovirusisolat Ngluwar-Magelang A dan B dengan enzim restriksi EcoR1 menghasilkan 2 pita DNA masing-masing berukuran 780 bp dan 3015 bp (Gambar 7), yang merupakan fragmen DNA
Begomovirussebagai sisipan (780 bp) dan plasmid vektor (3015 bp).
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Gambar 7 Pemotongan klon rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoR1. M=Marker 1 kb, 1=Vektor pGEMT-Easy tanpa pemotongan enzim restriksi EcoR1, 2=Vektor pGEMT-Easy dengan pemotongan enzim restriksi EcoR1, 3=Plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen) tanpa pemotongan enzim restriksi EcoR1, 4= Plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen) dengan pemotongan enzim restriksi EcoR1, 5=klon DNA rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar A tanpa pemotongan enzim restriksi
EcoR1, 6=klon DNA rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar A dengan pemotongan enzim restriksi EcoR1, 7=klon DNA rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar B tanpa pemotongan enzim restriksi
EcoR1, 8=klon DNA rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar B dengan pemotongan enzim restriksiEcoR1
Perunutan DNA
Hasil perunutan nukleotida fragmen gen protein selubungBegomovirushasil amplifikasi PCR (Lampiran 1), rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar A (Lampiran 2) dan rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar B (Lampiran 3) digunakan untuk analisis kesejajaran dengan program BLAST (Basic Local Aligment Search Tools)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) untuk mengetahui identitas Begomovirus. Alignment antar ketiga sekuen Begomovirus tersebut dilakukan sebagai konfirmasi sekuen antara sekuen protein selubung
Begomovirus sebelum dikloning dengan rekombinannya yaitu gen protein selubung rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar A maupun Ngluwar B. Hasil
alignment menunjukkan bahwa antar sekuen gen protein selubung Begomovirus
rekombinan terhadap sekuen gen protein selubung Begomovirus non rekombinan yaitu hasil amplifikasi PCR memiliki kesamaan yang tinggi, diindikasikan dengan kolom-kolom nukleotida yang terkonservasi dengan baik (Lampiran 4).
3015 bp
780 bp 3000 bp
Karakterisasi Gen Protein SelubungBegomovirus
Karakterisasi gen protein selubungBegomovirusmelalui analisis kesejajaran dan analisis spesifisitas perlu dilakukan sebagai acuan dalam pengembangan pelacak DNABegomovirus sebagai metode deteksi.
Analisis Kesejajaran
Identitas gen protein selubung Begomovirus diperoleh setelah melakukan analisis homologi antara nukleotida target dengan nukleotida gen protein selubung
Begomovirusyang telah terdaftar di GenBank (Tabel 2).
Hasil analisis nukleotida menunjukkan bahwa sekuen gen protein selubung
Begomovirus rekombinan isolat Ngluwar mempunyai kemiripan yang tinggi (lebih dari 90%, e-value 0,0) dengan: Ageratum yellow vein virus-Ishigaki
(AB306314), Ageratum yellow vein virus-[G129](AM940137), Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189854) dan Soybean crinkle leaf virus-[Japan]
(AB050781). Tingkat kemiripan yang lebih rendah (< 90%) terjadi antara rekombinan isolat Ngluwar denganTomato leaf curl Malaysia virus (AF327436),
Tomato leaf curl Java virus (AB100304), Papaya leaf curl China virus
(AY650283), Tomatoyellow leaf curl Guandong (AY602166) dan Malvastrum leaf curl virus (FJ712169) (Tabel 2). Clavarie & Notredame (2003) menyatakan bahwa dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% urutan nukleotidanya atau 25% urutan asam aminonya identik, dengan panjang urutan minimal 100. Menurut pedoman dari ICTV, apabila persamaan sekuen dari gen protein selubung antara satu virus dengan virus lain lebih dari 90%, dikatakan bahwa virus tersebut merupakan spesies virus yang sama.
Berdasarkan hasil analisis kesejajaran dengan program BLAST tersebut maka dapat dipastikan bahwa gen protein selubung yang diperoleh dalam penelitian ini, baik pada gen protein selubung hasil amplifikasi PCR (produk PCR) maupun rekombinan, adalah gen protein selubung yang berasal dari
Tabel 2 Hasil analisis kesejajaran gen protein selubungBegomovirus
Analisis Spesifisitas
Spesifisitas gen protein selubungBegomovirus isolat Ngluwar terhadap gen protein selubung isolat lainnya baik yang berasal dari Indonesia maupun negara lain merupakan informasi yang sangat penting terkait dengan tujuan penelitian yaitu mengembangkan pelacak DNA sebagai metode deteksi Begomovirus. Gen protein selubung isolat Ngluwar yang diperoleh akan dilabel menjadi DNAProbe
(pelacak DNA) sebagai alat deteksi Begomovirus. Spesifisitas gen protein selubung sangat menentukan ketepatan (akurasi) serta sensitifitas alat deteksi tersebut. Analisis spesifisitas gen protein selubung Begomovirus rekombinan isolat Ngluwar terhadap ke-12 isolat Begomovirus yang telah didaftarkan di GenBank, dipilih berdasarkan tanaman inang dan lokasi asal isolat, dilakukan dengan programmultiple alignmentClustal W (http://www.ebi.ac.uk/Clustal W).
Hasil analisis spesifisitas gen selubung rekombinan Ngluwar A dan B menunjukkan bahwa kedua gen selubung rekombinan tersebut memiliki konservasi yang tinggi terhadap ke-12 isolat Begomovirus tersebut, diketahui berdasarkan nilai penyejajaran (alignment score) yang mengindikasikan kesamaan urutan nukleotida antar sekuen (Tabel 3).
No. Aksesi Isolat Virus
AF327436 Tomato leaf curl Malaysia virus 84 84 84
AB100304 Tomato leaf curl Java virus 82 81 81
AY650283 Papaya leaf curl China virus 81 81 81
AY602166 Tomatoyellow leaf curl Guandong 80 80 80
Tabel 3 Nilai penyejajaran (alignment score) gen protein selubung rekombinan terhadap ke-12 isolatBegomovirus
No No.Aksesi Isolat Virus Tanaman Inang &
Asal Geografis 1 AB100304 Tomato leaf curl Java
virus
Tomat-Indonesia 80 80
2 AB162141 Tomato leaf curl Java virus-[Ageratum]
Tomat,Gulma-Indonesia
82 82
3 AB189845 Pepper yellow leaf curl Indonesia virus [Tomato2]
Cabai Rawit-Indonesia
63 63
4 AB189848 Tomato leaf curl Java virus-[Magelang]
Tomat-Magelang,Indonesia
83 83
5 AB189913 Ageratum yellow vein virus-[Indonesia]
Gulma-Indonesia 92 92
6 AB246170 Pepper yellow leaf curl Indonesia virus
Cabai Rawit-Indonesia
66 66
7 AF314531 Pepper leaf curl
Bangladesh
Cabai Rawit-Banglades
76 76
8 AF336806 Chilli leaf curl virus-[Multan]
Cabai-Pakistan 76 76
9 AF327436 Tomato leaf curl
Malaysia virus
Tomat-Malaysia 83 83
10 X74516 Ageratum yellow vein virus
Gulma-Singapura 52 52
11 AF136222 Tomato leaf curl
Philippines virus
Tomat-Filipina 72 72
12 AB020977 Soybean crinkle leaf virus
Kedelai-Jepang 59 59
Gen selubung rekombinan Ngluwar A dan B memiliki kesamaan sekuen tertinggi terhadap isolat Begomovirus tanaman gulma asal Indonesia yaitu
Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] yang ditunjukkan oleh nilai alignment
score sebesar 92% dan kesamaan sekuen terendah yaitu terhadap isolat
Gambar 8 Kladogram sekuen klon rekombinan Begomovirus, Ngluwar A dan B dibandingkan dengan ke-12 isolat Begomovirus. Klon rekombinan Ngluwar A (A), klon rekombinan Ngluwar B (B), Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189913), Soybean crinkle leaf virus
(AB020977), Ageratum yellow vein virus (X74516), Tomato leaf curl Java virus (AB100304), Tomato leaf curl Java virus-[Ageratum]
(AB162141), Tomato leaf curl Java virus-[Magelang] (AB189848),
Pepper yellow leaf curl Indonesia virus [Tomato2] (AB189845),
Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (AB246170),Tomato leaf curl Philippines virus (AF136222), Pepper leaf curl Bangladesh virus
(AF314531), Chilli leaf curl virus-[Multan] (AF336806),Tomato leaf curl Malaysia virus(AF327436).
Kladogram menunjukkan hubungan kekerabatan gen protein selubung rekombinan Ngluwar A dan B terhadap ke-12 isolatBegomovirus tersebut terbagi menjadi tiga kelompok utama. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen protein selubung Ngluwar A berada dalam kelompok pertama, bersama 6 isolat
Begomovirus lainnya yaitu Ageratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189913),
Soybean crinkle leaf virus (AB020977), Ageratum yellow vein virus (X74516),
Tomato leaf curl Java virus(AB100304),Tomato leaf curl Java virus-[Ageratum]
(AB162141) dan Tomato leaf curl Java virus-[Magelang] (AB189848). Pada kelompok dua terdiri dari Pepper yellow leaf curl Indonesia virus [Tomato2]
(AB189845), Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (AB246170), Tomato leaf curl Philippines virus (AF136222), Pepper leaf curl Bangladesh virus
I
II
(AF314531), Chilli leaf curl virus-[Multan] (AF336806) dan Tomato leaf curl Malaysia virus (AF327436) pada kelompok tiga. Berdasarkan hasil tersebut
diketahui bahwaAgeratum yellow vein virus-[Indonesia] (AB189913) merupakan isolat Begomovirus yang memiliki hubungan terdekat dengan gen protein selubung rekombinan Ngluwar A dan B, hasil ini selaras dengan nilai kesamaan yang diperoleh melalui analisis kesejajaran, dimana Ageratum yellow vein virus -[Indonesia] memiliki nilai kesamaan tertinggi terhadap gen protein selubung rekombinan A dan B (Gambar 8).
Hal yang menarik dari hasil kladogram ini yaitu gen protein selubung rekombinan Ngluwar A dan B berada dalam satu kelompok dengan isolat
Begomovirus yang bukan berasal dari Indonesia, yaitu:Soybean crinkle leaf virus
(AB020977) yang berasal dari Jepang dan Ageratum yellow vein virus (X74516) yang berasal dari Singapura. Hal tersebut di duga bahwa kemungkinan sesungguhnya mereka berasal dari nenek moyang dengan sekuen yang sama yang kemudian terpisah karena mengalami mutasi sehingga menyebabkan keragaman antar Begomovirus (Santoso 2008). Penjelasan senada juga dilaporkan oleh Ambrozevicius et al. (2005) yaitu adanya transfer genetik Begomovirus dari tanaman inang aslinya yang liar ke tanaman budidaya yang menyebabkan rekombinasi genetik Begomovirus. Rekombinasi genetik pada Begomovirus
adalah kunci utama yang berperan dalam keragaman diversifikasi dan evolusi
Begomovirus, dengan frekuensi rekombinasi tertinggi pada N-terminal dari ORF C1/AC1 yang menyandikan gen Replication-associated protein yang berperan dalam proses replikasi virus sedangkan ORF AV1 yang menyandikan gen protein selubung merupakan daerah dengan tingkat konservasi yang tinggi terhadap rekombinasi.
Analisis kesejajaran yang dilakukan terhadap kedua gen protein selubung rekombinanBegomovirus Ngluwar A dan B menunjukkan hasil bahwa kedua gen protein selubung rekombinan tersebut memiliki nilai identitas yang tinggi terhadap berbagai isolat Begomovirus yang ada di GenBank (Tabel 2). Demikian pula hasil analisis lainnya yaitu analisis kesamaan terhadap ke-12 isolat
