Adisarwanto, T., B. Santoso, Marwoto, Suyanto, dan Sumarno. 1997. Keragaan Paket Teknologi Produksi Kedelai di Lahan Sawah dalam M. Syam, Hermanto, A. Mussaddah, dan Sunihardi hal: 1291 – 1308. Kinerja Penelitian Tanaman Pangan Buku 5. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Departemen Pertanian, Bogor.
Adisarwanto, T., N saleh, Marwoto, dan N. Sunarlim. 2000. Teknologi Produksi Kedelai. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Bogor.
Apriyantono, A., D. Ferdiaz, N.l. Puspitasari, Sudaemawati, S. Budiyanto, 1990. Petunjuk Laboratorium Analisa Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB. Bogor. Asadi, B., D.M.Arsyad, H. Zahara, dan Darmijati. 1997. Pemuliaan kedelai untuk toleran
naungan. Bul. Agrobio 1 (2):15-20.
Baharsjah, Y.S., D. Suardi, dan I. Las. 1985. Hubungan iklim dengan pertumbuhan Kedelai. dalam S. Somaatmaja, M.Ismunadji, Sumarno, M. Syam, S.O. Manurung dan Yuswadi (eds.) Kedelai hal. 87-102. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman. Bogor.
Bell, G. and T.K. Danneberger 1999. Temporal shade on creeping bentgrass turf. Crop Sci 39:1142-1146
Biro Pusat Statistik. 2005. Statistik Indonesia 2004. Biro Pusat Statistik. Jakarta.
Biswal, B. and U.C. Biswal. 1999. Photosynthesis under Stress: Stress Signal and Adaptive Response of Chloroplast in M Pessarakli. pp 315-325. Handbook of Plant and Crop Stress. Marcel Dekker. New York.
Bolhar-Nordenlampf and Draxler G. 1993. Functional Leaf Anatomy in DO Hall, JMO Seurlock and HR Bolhar-Nordenlampf. pp 91-112. Photosynthesis and Production in Changing Environment. Chapman & Hall. London.
Callan and Kennedy.1995. Intercropping strokes aster (Strokesia laevis (Hill)) E. Greene. Crop Sci :35-1110-1115
Chaturvedi, G.S., P.C. Ram, A.K.Singh, P.Ram, K.T. Ingram, B.B.Singh,R.K.Singh, and V.P.Singh. 1994. Carbohydrate status of rainfed lowland rices in relation to submergence, drought and shade tolerance. In Lucknow, V.P. pp 104-122. Physiology of Stress Tolerance in Rice. India-IRRI Philippines
Chomchalow, C.N. and L.P. Laosuwan. 1993. Soybean in Asia. Food and Agricultural Organization of The United Nation Organization. Bangkok.
Cure, J.B.,C.D. Raper, R.P. Patterson, and W.P. Robarge. 1985. Dinitrogen fixation in soybean in response to leaf water stress and seed growth rate. Crop Sci 25:52-58 Dennis, F.G. 1988. Flowering in M.B. Tesar. Physiological Basis of Crop Growth and
Development. Am. Soc. Agron. Madison.
Direktorat Jendral Bina Produksi Tanaman Pangan. 2003. Pokok-pokok Kebijakan dan Langkah Strategis Pembangunan Tanaman Pangan. Program Aksi Masyarakat Agribisnis Tanaman Pangan. Departemen Pertanian RI. Jakarta.
Elfarisna. 2000. Adaptasi Kedelai terhadap Naungan. Studi Morfologi dan Anatomi. Tesis Magister Sains, Pascasarjana IPB.
Feng, Y.L., K.F. Cao, and Y.L. Zhang. 2004. Photosynthetic characteristic, dark respiration, and leaf mass per unit area in seedling of four tropical tree species grown under three irradiance. Photosynthetica 42:431-437.
Field, T.S., T. Brodribb, and N.M. Holbrook. Acclimation of leaf anatomy, photosynthetic light use, and xylem hydraulics to light in Amborella trichopoda. Int. J. Plant Sci 162: 999 – 1008.
Gardner, F.P., R.B. Pearce, and R.L. Mitchell. 1990. Physiology of Crop Plant. Iowa State Univ Pr. Ames.
Givnish, T.J. 1988. Adaptation to sun and shade : a whole plant perspective. Aust. J. Plant Physiol 15:63-92
Hale, M.G. and D.M. Orcutt. 1987. The Physiology of Plant under Stress. J Wiley. New York.
Hall, D.O. and K.K. Rao. 1999. Photosynthesis. Cambridge Univ Pr. Cambridge, UK. Handayani, T. 2003. Pola Pewarisan Sifat Toleran terhadap Intensitas Cahaya Rendah pada
Kedelai (Glycine Max (L) Merrill) dengan Penciri Spesifik Karakter Anatomi, Morfologi, dan Molekuler. Disertasi. Program Pascasarjana IPB. Institut Pertanian Bogor.
Hang, A.N., D.E. McCloud, K.J. Boote, and W.G. Duncan. 1984. Shade effects on growth, partitioning, and yield components of peanuts. Crop Sci 24:109-115
Harper, J.E. 1987. Nitrogen Metabolism in J.R. Wilcox. Pp 497-522. Soybean: Improvement,Production, and Uses. Am. Soc. Agron. Madison.
Harn, C.E., Khayat dan J.Dale. 1993. Expression dynamics of gene encoding key carbon metabolism enzyme during sink to source transition of developing leaves. Plant Cell Physiol. 34:1045-1053
99
Hidayat, O. 1985. Morfologi Tanaman Kedelai dalam S. Somaatmaja, M.Ismunadji, Sumarno, M. Syam, S.O. Manurung dan Yuswadi (eds.) Kedelai. hal. 73-86. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman. Bogor.
Hidema, J. A. Makino, T. Mae and K. Ojune. 1992. Change in the level of chlorophyll and light harvesting chlorophyll a/b protein of photosynthesis II in rice. Plant Cell Physiol. 33: 1209-1214
Holbrook, G.P., W.J. Campbell, A. Rowland, and G. Bowes. 1994. Interspesific variation in the light/dark modulation of ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase-oxygenase activity in soybean. J. Exp. Bot. 45:1119-1126
Huber, S.C. and D.W. Israel. 1982. Biochemical basis for partitioning of photosynthetically fixed carbon between starch and sucrose in soybean (Glycine max Merr.) leaves. Plant Physiol. 69:691-696.
Iowa State University. 1994. How A Soybean Plant Develops. Iowa State University Cooperative Extension Service. Ames.
Johnston, M and L.C. Onwueme. 1998. Effect of shade on photosynthetic pigments in tropical root crops:yam, taro, tannia, cassava, and sweet potato. Exp. Agric 34:304- 312
Judel, G.K. and K. Mengel. 1982. Effect of shading on nonstructural carbohydrate and their turnover in culms and leaves during the grainfilling period of spring wheat. Crop Sci 22:958-1004
Kerstiens. 1998. Shade tolerance as a predictors of responses to elevated CO2 in tree. Physiologia Plantarum 102:472-480
Khumaida, N. 2002. Studies on Adaptability of Soybean and Upland Rice to Shade Stress . Disertasi. The University of Tokyo.
Lautt, B.S. 2003. Fisiologi Toleransi Padi Gogo terhadap Naungan: Tinjauan Karakteristik Fotosintesis dan Respirasi. Disertasi. Program Pascasarjana IPB. Institut Pertanian Bogor.
Lautt, B.S., M.A. Chozin, D. Sopandie, dan L.K. Darusman. 2000. Perimbangan Pati- Sukrosa dan Aktivitas Enzim Sukrosa Fosfat Sintase pada padi gogo yang toleran dan peka terhadap naungan. Hayati 7 (2):31-34
Lawlor, R.S. 1987. Photosynthesis:Metabolisme, Control, and Physiology. J Wiley New York. 262p
Lersten, N.K. and J. B. Carlson. 1987. Vegetative Morphology in J.R. Wilcox (ed). pp 51 – 94. Soybean Improvemnet, Production, and Uses. Am. Soc. Agron. Madison. Levitt, J. 1980. Responses of plants to environmental stresses. Vol II. Water, Radiation,
Salt, and Other Stresses. Academic Pr. New York.
Madore, M. A. 1997. Photosynthesis and Carbohydrate Formation in M. Pessarakli. pp 837-893. Handbook of Photosynthesis. Marcel Dekker. New York.
Madore, M.A. 1999. Carbohydrate synthesis and Crop Metabolism in M. Pessarakli. pp 257-272. Handbook of Plant and Crop Stress. Marcel Dekker. New York.
Mae, T., A, Makino, and K.Ohira. 1983. Changes in the Amounts of Ribulose Bisphosphate carboxylase synthesized and degraded during the life span of rice leaf (Oriza sativa L.). Plant Cell Physiol. 24 (6): 1079 – 1086.
Manwan, I dan Sumarno. 1996. Perkembangan dan Penyebaran Produksi Kedelai dalam B. Amang, M.H Sawit, dan A. Rachman (ed) hal. 151-236. Ekonomi Kedelai . IPB Press. Bogor
Marchner, H. 1995. Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Pr. New York.
Masaya, P and J.W. White. 1993. Adaptation to photoperiod and temperature in A.V. Schoonhoven and O. Voysest (eds). pp 445-500. Common Beans:Research for Crop Improvement. CAB International. Wallingford.
Mohr, H. and P. Schopfer. 1995. Plant Physiology. Springer. Berlin.
Mullet, J. 1990. Moleculer Biology of Photosynthesis in Higher Plants in D.T Dennis and D.H. Turpin. pp 198-211. Plant Physiology, Biochemistry, and Moleculer Biology.Longman Scientific and Technical. Essex, England.
Murty, K.S. and Sahu, G. 1987. Impact of low-light stress on growth and yield of rice. Proc. Intl. Workshop on the Impact of Wheather Parameters on Growth and Yield of Rice. 7-10 Apr 1986. International Rice Research Institut. Los Banos, Philipines Newcomb, W. 1990. Plastid Structure and Development in D.T Dennis and D.H.
Turpin.pp193-197. Plant Physiology, Biochemistry, and Moleculer Biology. Longman Scientific and Technical. Essex, England.
Okada, K.I., K.Yasunori, S. Kazuhiko, M. Tadahiko, and K. Sakae. 1992. Effect of light on degradation of chlorophyll and protein during senescence of detaches rice leaves. Plant Cell. Physiol. 33:1183-1191.
Portis, A.R. 1992. Regulation of Ribulose 1,5- Bisphosphate Carboxylase/ Oxygenase Activity. . Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 43: 415-437
101
Purcell, L.C., C.A. King, and R.A. Ball. 2000. Soybean cultivar differences in ureides and relationship to drought tolerant nitrogen fixation and manganese nutrition. Crop Sci 40:1062-1070.
Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi. 1995. Daftar Komposisi Zat Gizi Pangan Indonsia. Direktorat Jendral Pembinaan Kesehatan Masyarakat Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Pushpakamuri, R. and V.K. Sasidhar. 1996. Dry Matter Production and Uptake of Nutrients by Yam and Arvids as influenced by Shade Intensities.Tropical Tuber Crops Science.
Raper, C.D. dan P.J. Kramer. 1987. Stress Physiology. in J.R. Wilcox (ed). pp 589-641. Soybean:Improvement,Production, and Uses. Am. Soc. Agron. Madison.
Reed, A.J., G.W. Singletary, J.R. Schussler, D.R. Williamson, and A.L. Christy. 1988. Shading effects on dry matter and nitrogen partitioning, kernel number, and yield of maize. Crop Sci 28:819 – 825.
Sakamoto, C.M. and R.H. Shaw. 1967. Apparent photosynthesis in field soybean communities. Agron. J. 59: 73-75.
Salisburry, F.B. dan C.W. Ross. 1992. Plant Physiology. Wadsworth. Belmont.
Schoefs, B. and M Bertrand. 1997. Chlorophyll Biosynthesis. in M. Pessarakli. pp 49-65. Handbook of Photosynthesis. Marcel Dekker. New York
Shibels, R., J. Secor, and D.M. Ford. 1987. Carbon Assimilation and Metabolism in J.R. Wilcox (ed). pp 535-588. Soybean:Improvement, Production, and Uses. Am. Soc. Agron. Madison.
Smith, B. 1997. Photosynthesis, Respiration, and Growth. in M. Pessarakli. pp 811-817. Handbook of Photosynthesis. Marcel Dekker. New York
Sopandie, D., M.A. Chozin, S. Sastrosumarjo, T. Juhaeti, dan Sahardi. 2003a. Toleransi padi gogo terhadap naungan. Hayati 10:71-75.
---, S. Tjitrosemito, dan Sahardi. 2003b. Keefektifan uji cepat ruang gelap untuk seleksi ketenggangan terhadap naungan pada padi gogo. Hayati 10: 91-95
Sopandie, D., Trikoesoemaningtyas, dan N. Khumaida. 2005. Fisiologi, Genetik dan Molekuler Adaptasi Kedelai terhadap Intensitas Cahaya Rendah: Pengembangan Varietas Unggul Kedelai Sebagai Tanaman Sela. Departemen Agronomi dan Hortikultura. Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor.
Sopandie, D., Trikoesoemaningtyas, E. Sulistyono, dan N. Heryani. 2001. Pengembangan Kedelai sebagai Tanaman Sela: Fisiologi dan Pemuliaan untuk Toleransi terhadap Naungan. Laporan Penelitian Hibah Bersaing X. Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor.
Sopandie, D., Trikoesoemaningtyas, E. Sulistyono, dan N. Heryani. 2002. Pengembangan Kedelai sebagai Tanaman Sela: Fisiologi dan Pemuliaan untuk Toleransi terhadap Naungan. Laporan Penelitian Hibah Bersaing X. Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor.
Steel, R.G.D. and J.H.Torrie. 1960. Principles and Procedures of Statistics. A Biometrical Approach. McGraw-Hill Book.
Stier, J.C., J.N. Roghs, J.R. Crum, and P.E. Rieke. 1999. Flurprimedol effect on kentucky bluegrass under reduced irradiance. Crop Sci 39:1423-1430.
Sukaesih, E. 2002. Studi Karakter Iklim Mikro pada Berbagai Tingkat Naungan Pohon Karet dan Pengaruhnya terhadap Pertumbuhan 20 Genotipe Kedelai. Sekripsi. Jurusan Budi Daya Pertanian Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor.
Suhartina. 2003. Perkembangan dan Diskripsi Varietas Unggul Kedelai 1918 – 2002. Balai Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian. Malang.
Sumarno, F. Dauphin, A. Rachim, N. Sunarlim, B. Santoso, H. Kuntyastuti, dan Harnoto. 1989. Analisis Kesenjangan Hasil Kedelai di Jawa. Pusat Palawija. Bogor.
Sunarlim, N. 1985. Pengaruh naungan terhadap pertumbuhan, hasil, dan komponen hasil kedelai. Seminar Balittan Bogor vol.2 hal 213-224
Suwignyo, R.A., A. Nose, Y. Kawamitsu, M. Tsuchiya and K.Wasano. 1995. Effect of manipulation of source and sink on carbon exchangerate and some enzymes of sucrose metabolism in leaves of soybean [Glycine max (L) Merr.]. Plant Cell Physiol. 36:1439-1446.
Taiz, L. and E. Zeiger. 1991. Plant Physiology. Benyamin Cumming. Redwood.
Tomkins, J.P. and E.R. Shipe. 1996. Soybean growth and agronomic performance in response to the long juvenile trait. Crop Sci 36:1144-1149.
Udvardi, M.K. dan D.A. Day. 1997. Metabolite transport across symbiotic membranes of legume nodules. in R.L. Jones, C.R. Somerville, and V. Walbot. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 48: 493-523
Vivekanandan. M. and V. C. Saralabai. 1997. Light Activation of Photosynthetic Enzyme. in M. Pessarakli. pp 367-378. Handbook of Photosynthesis. Marcel Dekker. New York
103
Vu, C.V., L.H.Allen, and G. Bowes. 1983. Effect of light and elevated atmospheric CO2 on the ribulose bisphosphate carboxylase activity and ribulose bisphosphate level of soybean leaves. Plant. Physiol.73:729-73
Weston, E., K.Thorogood, G. Vinti. 2000. Light quantity controls leaf-cell and chloroplast development. Planta 211: 807-815
White, J.W. and J. Izquierdo. 1993. Physiology of Yield Potential and Stress Tolerance. in A.V. Schoonhoven and O. Voysest (eds). pp 287-382. Common Beans:Research for Crop Improvement. CAB International. Wallingford.
Wiebel, J., E.K. Chacko and P. Ludders. 1994. Influence of irradiance on photosynthesis, morphology, and growth of mangosteen seedling. Tree Physiol. 14:263-274
Widjaja, E. 1996. Biometrik II: Anatomi dan Morfologi Daun, Batang, dan Akar. Program Studi Biologi Fmipa-IPB. Bogor.
Wilson, K. and K.H. Goulding. 1987. Principles and Techniques of Practical Biochemistry. Edward Arnold. London. 395 pp
Yoshida, S.,D.A. Forno, J.H.Coock, K.A.Games. 1976. Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice. International Rice Research Institute. Manila.
Zhao, D. and D.Oosterhuis.1998. Cotton responses to shade at different growth stages:nonstructural carbohydrate composition. Crop Sci. 38:1196-1203
105
Lampiran 1. Produksi biji beberapa genotipe kedelai pada lahan di bawah pohon karet di Sukabumi (g/10 tanaman)
Genotipe Kontrol Karet 1 tahun (Naungan 25%) Karet 3 tahun (Naungan 67%) Karet 4 tahun (Naungan 72%) Sicinang 78.00 23.30 (30) 2.13 (3) 0.77 (1) Pangrango 66.30 19.53 (29) 3.16 (5) 1.33 (2) Mlg 3072 98.20 23.30 (24) 7.50 (8) 0.57 (1) B 618 80.96 30.13 37) 3.40 (4) 0.80 (1) B 613 56.57 38.33 (68) 8.67 (15) 0.47 (1) Ceneng 56.70 41.77 (74) 8.10 (14) 4.90 (9) Sindoro 114.80 45.00 (39) 2.73 (2) 0.50 (0) Srijono 60.00 24.17 (40) 6.67 (11) 1.20 (2) Arksoy 52.27 40.87 (78) 2.67 (5) 6.63 (13) Klungkung hijau 64.30 22.97 (36) 0.43 (1) 5.40 (8) Godek 61.20 28.97 (47) 5.83 (10) 5.43 (9) Mlg 2999 82.33 33.00 (40) 2.83 (3) 0.90 (1) Mlg 3541 76.60 30.00 (39) 3.83 (5) 5.57 (7) Tampomas 67.67 73.30 (108) 5.37 (8) 2.70 (4) Taro A 63.47 18.83 (30) 1.77 (3) 0.37 (1) Kipas Putih 83.07 24.60 (30) 10.53 (13) 0.80 (1) Wilis 84.13 27.20 (32) 6.70 (8) 0.90 (1) Sumber: Sukaesih (2002)
L
ampiran 2. Denah percoban I di kebun Cikabayan – Bogor dan naungan paranet di lapang. kontrol (tanpa naungan) Naungan paranet 75% Naungan paranet 25% Naungan paranet 50%Gi-3 Gi-2 Gi-1
Gi-3 Gi-2 Gi-1
Gi-3 Gi-2 Gi-1
Gi-3 Gi-2 Gi-1
Keterangan:
- Gi -1 artinya genotipe i ulangan 1, sedangkan i = 1, 2, 3 ,………,8 - Gi -2 artinya genotipe i ulangan 2, sedangkan i = 1, 2, 3 ,………,8 - Gi –3 artinya genotipe i ulangan 3, sedangkan i = 1, 2, 3 ,………,8
- Paranet 25%, 50%, dan 75% artinya menahan cahaya matahari berturut-turut 25%, 50%, dan 75%
- Percobaan IA dan IB pada penelitian 1, percobaan I pada penelitian 2 dan 3
107
Lampiran 3. Denah percobaan II di kebun Cikabayan – Bogor
G1T1 G1T5 G2T5 G1T4 G3T1 G4T2 G2T3 G1T2 G4T2 G4T1 G1T5 G2T3 G3T2 G4T5 G3T2 G4T4 G4T3 G3T4 G1T4 G1T3 G1T5 G1T1 G2T1 G1T2 G3T4 G3T3 G4T3 G4T5 G2T2 G2T5 G4T5 G3T1 G4T4 G2T1 G3T5 G4T3 G1T1 G3T2 G4T1 G2T4 G2T5 G2T2 G4T4 G2T3 G3T1 G1T3 G4T1 G3T5 G3T5 G3T4 G2T4 G4T2 G3T3 G2T2 G1T3 G1T2 G1T4 G3T3 G2T1 G2T4 Keterangan:
Percobaan II pada penelitian 2 dan 3 G1 = genotipe Ceneng (toleran) G2 = genotipe Pangrango (toleran) G3 = genotipe B613 (toleran) G4 = genotipe Godek (peka)
T1 = TTT= perlakuan terang/ normal terus-menerus (kontrol)
T2 = TTG = perlakuan terang/ normal terus-menerus sampai hari ke-29, lalu gelap selama 3 hari
T3 = TGT = perlakuan terang sampai hari ke-26, lalu gelap 3 hari, kemudian terang 3 hari T4 = GTG =perlakuan terang/ normal sampai hari ke-23 , lalu gelap 3 hari, terang 3 hari,
dilanjutkan gelap lagi selama 3 hari
T5 = TGN = perlakuan terang/ normal sampai hari ke-26, lalu gelap 3 hari, dilanjutkan naungan 50%
Sampel pada semua perlakuan diambil pada hari ke-32 dengan keadaan sesuai perlakuan saat itu. Sampel TGT diambil pada saat terang, TTG dan GTG pada gelap, dan TGN pada saat naungan 50%.
Lampiran 4. Jadwal perlakuan pada variasi pergiliran gelap-terang (percobaan II pada penelitian 2 dan Percobaan II pada penelitian 3).
Jenis P e r l a k u a n Pengambilan
sampel (HST) Kontrol normal sampai hari ke-23 normal normal normal 32
TTG normal sampai hari ke-23 normal normal gelap 32 TGT normal sampai hari ke-23 normal gelap normal 32 GTG normal sampai hari ke-23 gelap normal gelap 32 TGN normal sampai hari ke-23 normal gelap naungan 32 Lamanya (hari) 23 3 3 3 --- Masa (HST) 0-23 23-26 26-29 29-32 --- Keterangan:
Normal artinya kondisi biasa, yaitu siang terang dan malam gelap
Sampel pada semua perlakuan diambil pada hari ke-32 dengan keadaan sesuai perlakuan saat itu. Sampel TGT diambil pada saat terang, TTG dan GTG pada gelap, dan TGN pada saat naungan 50%.
109
Lampiran 5. Prosedur analisis laboratorium dan biokimia
a. Metode pengukuran mesofil parenchyma dan palisade (Widjaya, 1996)
Bahan yang digunakan antara lain: daun kedelai, Eau de javille (50 g CaCl3 + 100 g KCO3 + aquades sampai 1 liter), aquades, gliserin 10 %, methyl green 0.5 % dalam asam asetat 10 % dan cat kuku bening. Alat yang digunakan yaitu: jarum preparat, kuas gambar, cawan petri, sliding microtome.
Urutan prosedur pengerjaan adalah sebagai berikut. Sampel daun dipotong-potong dengan ukuran 2 x 0.5 cm. Sampel kemudian dibekukan dengan cara meletakkannya secara tegak lurus pada wadah yang disediakan untuk membekukan preparat. Lalu ditambahkan air setetes demi setetes sehingga seluruh permukaan preparat tertutup es.
Sampel yang telah dibekukan kemudian diiris dengan menggunakan sliding microtome dengan ketebalan 10 µm. Hasil potongan kemudian diletakkan ke dalam cawan petri dengan bantuan kuas gambar. Selanjutnya ditetesi beberapa tetes eau de jeville (50 g CaCl3 + 100 g KCO3 atau NaCO3 ) dalam larutan aquades dan dipanaskan pada lampu spiritus. Irisan yang berwarna hijau berubah menjadi putih. Pemanasan dihentikan setelah irisan berwarna putih dan kemudian dicuci dengan aquades.
Irisan kemudian ditetesi asam asetat 10 % dan dicuci berkali-kali dengan aquades untuk menghilangkan eau de javille dan asam asetat. Setelah irisan bersih dari asam dan eau de javille, ditetesi dengan methyl green dan didiamkan beberapa detik. Bila irisan dengan methyl green masih mengeluarkan warna coklat, dicuci kembali dengan asam asetat dan aquades. Setelah irisan terwarnai, lalu dicuci kembali dengan aquades.
Irisan diletakkan di atas object glass (gelas objek) yang telah diberi gliserin 10 % dan ditutup dengan cover glass (gelas penutup). Untuk menghindari penguapan gliserin, sekeliling gelas penutup (cover glass) ditutup dengan cat kuku bening. Preparat selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
b. Metode pengukuran stomata (Widjaya, 1996)
Daun kedelai dikerik dibagian atasnya untuk mendapatkan lapisan epidermis bagian bawah. Epidermis diwarnai dengan safranin dan dicuci dengan aquades. Epidermis yang telah dicuci diletakkan pada kertas saring dan diletakkan pada gelas objek yang telah ditetesi
dengan gliserin dan ditutup dengan gelas penutup. Sekeliling gelas penutup (cover glass) ditutup dengan cat kuku bening untuk menghindarkan hilangnya gliserin. Stomata diamati di bawah mikroskop
c. Metode analisa klorofil a dan b (Yoshida, 1976)
Daun segar sebanyak 2 gram dipotong kecil dan dihancurkan sampai halus dengan mortar, lalu ditambahkan aseton secukupnya dan diaduk. Ekstraknya dipindahkan ke dalam labu ukur 100 ml. Kemudian ditambahkan aseton 80% ke dalam labu ukur sampai mencapai 100 ml. Larutan diambil 5 ml untuk dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml lalu diencerkan dengan aquades sampai volume 50 ml.
Absorbansi ekstrak tersebut diukur pada 663 nm dan 645 nm dengan spektrofoto- meter. Kandungan khlorofil ditentukan dengan persamaan berikut:
Kl. a = 0.0127 x D663 - 0.00269 x D645 Kl. b = 0.0229 x D645 - 0.00460 x D663
d. Analisis kandungan karbohidrat (Harn et al., 1993)
Daun kedelai dipotong kecil dan dibekukan. Daun kedelai kemudian dimasukkan ke dalam etanol 80 % yang mendidih selama 5 jam dalam soxhlet untuk mengekstraksi gula terlarut. Setelah seluruh alkohol menguap, ekstrak yang tersisa dilalukan pada C18 - Prep Sep Columns (Biorad).
Sukrosa, glukosa dan fruktosa dipisahkan dengan menggunakan HPLC yang dilengkapi dengan Aminex HPX-42C Columns (Bio Rad) dan dibaca menggunakan refractive index detector. Konsentrasi sukrosa dinyatakan dengan mg/g bobot basah
e. Analisis pati (Huber dan Israel, 1982)
Sebanyak0.5 g bobot basah daun diekstrak dengan etanol 80 % dan dipanaskan hingga pigmen yang ada pada jaringan keluar. Ekstraknya disentrifugasi dan disuspensikan dengan menambahkan 2 ml 0.2 N KOH dan direndam dalam air mendidih selama 30 menit. Setelah dingin, pH diatur sampai 5.5 dengan 1 M asam asetat
Pada ekstraknya ditambahkan amyloglucosidase dengan volume yang sama (400 unit/ ml dalam 0.1 buffer sitrat ph 5.5). Setelah itu diinkubasi pada suhu 45 C selama 4-6 jam.
111
Setelah inkubasi tabung diletakkan di dalam air mendidih selama 1 menit dan superna-tannya dianalisis dengan metode Fulin Wu untuk menentukan kadar glukosa. Kandungan pati dinyatakan sebagai glukosa/gram bobot basah.
f. Analisis enzim sukrosa fosfat sintase (Suwignyo et al., 1995)
Jaringan daun yang telah disimpan dalam nitrogen cair, dihancurkan dengan mortar dalam medium (8.0 ml medium/ gram bobot basah) yang mengandung 50 mM HEPES NaOH; pH 7.5; 5 mM MgCl2 , 1 mM EDTA, 2.5 ml DTT, 2 % PEG 20 000 dan 1 % BSA. Campuran kemudian disaring dengan 2 lapis Miracloth dan disentrifugasi pada 38 000 g selama 10 menit.
Pada supernatan ditambahkan 70 µ l berisi 7.5 mM UDP-glukosa, 7.5 mM fruktosa-6- fosfat, 5 mM MgCl2 , 50 mM HEPES NaOH, pH 7.5. Campuran tersebut lalu diinkubasi selama 10 menit pada 25o C. Kemudiaan reaksi dihentikan dengan menambahkan 70 µl NaOH 1 M.
Fruktosa-6-fosfat yang tidak bereaksi dihancurkan dengan meletakkan tabung reaksi pada air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin ditambahkan 0.25 ml 0.1 % resorcinol dalam 95 % etanol dan 0.75 ml 30 % HCl dan diinkubasi pada 80o C selama 8 menit. Setelah kembali ke suhu ruang, aktivitas enzim diukur dengan spektrofotometer pada λ = 520 nm. Aktivitas enzim dinyatakan dalam satuan mM/g bobot basah.
g. Analisis aktivitas enzim rubisco (Holbrook et al., 1994)
Daun kedelai dihomogenasi dengan bantuan nitrogen cair dalam medium bebas CO2, yang berisi 100 mM TRIS HCl, 5 mM MgCl2, 5mM dithiothreitol, 10 mM isoascorbic acid, 1.5 % PVP 40 pada pH 8.0 (buffer A). Homegenat disentrifugasi pada microcen-trifuge selama 1 menit pada 13000 g. Supernatan hasil sentrifugasi digunakan untuk pengujian aktivitas awal rubisco dan aktivitas total rubisco.
Sebanyak 10 µl supernatan diinkubasi pada medium buffer B (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 , 5 mM DTT, 10 mM isoascorbic acid, 20 mM NaH14C03 , (0.5 Ci Mol) dan direaksikan dengan 1 mM RuBP pada pH 8.0. Sebelum pengujian aktivitas total rubisco, ekstrak diaktivasi terlebih dahulu selama 5 menit dengan buffer B. Setelah aktivasi ekstrak direaksikan dengan 1 mM RuBP selama 30 detik. Reaksi dihentikan dengan 0.1 ml 6 N
HCOOH dalam methanol. NaH14C03 yang tidak bereaksi dilepas ke udara melalui pemanasan. Aktivitas rubisco dihitung berdasarkan radioaktif dan perbandingan dengan larutan standar.
h. Analisis kandungan N daun (Mae et al., 1993).
Daun yang telah dibekukan dalam N cair dihomogenasi dengan 50 mM buffer Na- phosphate (pH 7.4). Perbandingan daun : buffer adalah 1 : 5. Homegenat disaring melalui empat lapis kain kasa, kemudian filtratnya disentrifugasi selama 50 menit pada 37000 g. Supernatan yang terbentuk digunakan untuk menentukan N terlarut daun dan pemisahan berikutnya.
Sebagian supernatan dipresipitasikan dengan 15 % (w/v) trichloro-acetic acid dengan volume yang sama dan disimpan pada 0 C selama 30 menit. Hasil presipitasi dipisahkan dengan sentrifugasi dan dicuci dengan ethanol. Fraksi ini digunakan untuk menentukan kandungan protein N terlarut dengan reagen Nessler.
Total N daun diukur dengan menggunakan reagen Nessler setelah sampel daun diberi H2SO4-H2O2.. N tak larut dan N terlarut TCA ditentukan sebagai berikut:
N tak larut = N total daun - N terlarut
N terlarut bukan protein = N terlarut - protein N terlarut
i. Analisis gula total (Apriyantono et al, 1990).
1.0 g sampel kering dimasukkan ke dalam gelas ukur 100 ml. 10 ml air ditambahkan ke dalam tabung dan diaduk. Kemudian ditambahkan 13 ml asam perkhlorat 52 % dan diaduk selama 20 menit. Setelah diaduk lalu disaring dan dimasukkan ke dalam labu takar, diberi air sampai sampai 250 ml.
1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan 5 ml pereaksi Anthrone secara cepat dan diaduk secara merata. Dalam keadaan tertutup tabung reaksi direndam dalam air 100o C selama 12 menit lalu didinginkan cepat dengan air mengalir. Absorbansnya dibaca pada 630 nm. Kandungan gula total dibandingkan dengan larutan standar.
113
10 ml ekstrak sampel seperti pada analisis gula total di atas diencerkan menjadi 100 ml dengan air. Tahap berikutnya sama dengan penetapan kadar gula di atas. Karbohidrat total dinyatakan dengan rumus.
Total karbohidrat = 25 x b . a x W
W = bobot sampel,
a = absorbans gula satandar, b = absorbans sampel.
k. Analisis pati total (Apriyantono et al, 1990).
0.2 g sampel dalam bentuk tepung dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 50 ml. Sampel dibasahi dengan 2 tetes etanol 80%, diberi air 5 ml dan diaduk. Ditambahkan 25 ml etanol 80% (v/v) panas, diaduk dan dibiarkan selama 5 menit, lalu disentrifus. Supernatan