Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai dari bulan September 2007 sampai dengan Agustus 2008, bertempat di Laboratorium Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah ekstrak etanol temulawak, ekstrak meniran komersial, larutan Giemsa, kloroform, NaCl fisiologis, THB
(Todd Hewitt Broth), metanol, larutan BaSO4 10% (620 nm), kapur putih, minyak
emersi, kapas, label dan pakan ayam yang mengandung coccidiostat, bakteri Staphylococcus aureus nonprotein A dan hewan penelitian berupa ayam petelur strain Isa Brown umur 16 minggu yang telah divaksinasi AI.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian meliputi kandang ayam, timbangan, gunting, pinset, syring 1 ml, peralatan untuk nekropsi serta pembuatan preparat ulas berupa gelas objek, gelas penutup dan pipet serta mikroskop cahaya untuk pengamatan.
Hewan Penelitian
Penelitian ini menggunakan ayam petelur yang berumur 16 minggu dengan bobot badan yang seragam. Sebelum perlakuan dimulai, diadakan masa adaptasi selama 7 hari untuk mengembalikan kondisi ayam dari stres karena pemindahan dan transportasi. Selama masa ini diberikan vitamin dan elektrolit (Nopstress
VitaminTM) lewat air minum sesuai dengan rekomendasi pabrik pembuat.
Sebanyak 24 ekor ayam didistribusikan ke dalam kandang-kandang individu dengan sistem baterai yang berukuran sesuai standart komersial. Ayam dibagi ke dalam 3 kelompok perlakuan yaitu : (1) kelompok ayam yang divaksin AI tetapi tidak diberi ekstrak temulawak, sebagai kontrol negatif, dengan distribusi ayam
21 sebanyak 3 ekor. (2) kelompok ayam yang divaksin AI dan diberi ekstrak meniran komersial, sebagai kontrol positif, dengan distribusi ayam sebanyak 3 ekor. (3) kelompok ayam yang divaksin AI dan diberi ekstrak temulawak (dengan 3 tingkat dosis yang berbeda), dengan distribusi ayam sebanyak 18 ekor. Selama percobaan, pemberian pakan dan minum sesuai dengan perlakuan di peternakan ayam komersil.
Isolat Bakteri
Pada penelitian ini untuk membantu mendeteksi aktivitas dan kapasitas fagositosis dari sel fagosit (makrofag), dilakukan uji tantang dengan menggunakan bakteri Staphylococcus aureus nonprotein A yang disuntikan secara intraperitoneal.
Metode Penelitian Persiapan kandang
Kandang ayam percobaan dibuat menurut sistem baterai. Seluruh dinding dan lantai ruangan percobaan dikapur dengan kapur tembok berwarna putih, didesinfeksi dengan desinfektan kelompok fenol sintetik dua hari sebelum ayam percobaan dimasukkan.
Pembuatan Ekstrak Etanol Temulawak
Pembuatan ekstrak temulawak menggunakan metode maserasi. Jenis pelarut ekstrak temulawak yang digunakan terdiri dari 2 jenis etanol dengan konsentrasi berbeda yaitu etanol 70% dan 96%. Etanol dipakai karena relatif aman untuk makanan. Sebelumnya dibuat terlebih dahulu simplisia rimpang temulawak. Selanjutnya simplisia temulawak direndam dengan pelarut etanol dan aquabidest menggunakan perbandingan 1:10. Selama perendaman, campuran ini diaduk setiap 3 jam selama 24 jam. Kemudian campuran ini diperas untuk memisahkan larutan dan ampasnya. Setelah itu pelarut untuk ekstraksi dipisahkan kembali
dengan penguapan menggunakan pompa vakum evaporator pada suhu 50 oC
22 17,5; 35 dan 52,5 mg/kg BB. Dosis didapat dari hasil uji aktivitas biologik fraksi bioaktif pada penelitian sebelumnya.
Preparasi Suspensi Bakteri Staphylococcus aureus nonprotein A
Inokulasi bakteri dilakukan dua hari sebelum hewan percobaan ditantang dan persiapan suspensi dilakukan satu hari menjelang proses tantang. Bakteri Staphylococcus aureus yang sebelumnya sudah disiapkan, diinokulasikan dari kulturnya ke dalam 1000 ml THB, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada
suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah 24 jam, biakan tersebut disentrifus selama 10
menit dengan kecepatan 1500 rpm sampai terbentuk pelet. Pelet yang terbentuk diambil dan disuspensikan kembali dengan NaCl fisiologis steril sampai sepersepuluh volume awal. Suspensi bakteri kemudian disentrifus kembali sampai terbentuk pelet, dibilas dan disuspensikan dengan NaCl fisiologis steril sampai mencapai volume 100 ml. Suspensi bakteri disetarakan dengan larutan
BaSO4 10% pada panjang gelombang 620 nm menggunakan spektrofotometer,
sehingga diharapkan suspensi bakteri setara dengan konsentrasi 109 partikel
bakteri per ml suspensi. Suspensi tersebut disimpan pada suhu 4 oC sampai pada
hari penginfeksian hewan percobaan.
Pemberian Vaksin AI
Vaksin AI komersial yang secara legal telah mendapat persetujuan pemerintah digunakan dalam penelitian ini. Dosis yang digunakan sesuai dengan petunjuk pabrik pembuat. Sebelum mendapat suntikan vaksin, semua ayam dipastikan harus dalam keadaan sehat.
Pemberian Perlakuan Terhadap Hewan Percobaan
Perlakuan diberikan selama 4 minggu dengan interval 24 jam. Ayam distirahatkan selama 3 hari tanpa perlakuan setelah 7 hari pemberian perlakuan. Delapan perlakuan yang diberikan adalah perlakuan pertama diberikan pencekokan ekstrak temulawak secara oral dengan dosis 17,5 mg/kg BB dengan pelarut etanol 70%. Perlakuan kedua diberikan pencekokan ekstrak temulawak secara oral dengan dosis 35 mg/kg BB dengan pelarut etanol 70%. Perlakuan
23 ketiga diberikan pencekokan ekstrak temulawak secara oral dengan dosis 52,5 mg/kg BB dengan pelarut etanol 70%. Perlakuan keempat diberikan pencekokan ekstrak temulawak secara oral dengan dosis 17,5 mg/kg BB dengan pelarut etanol 96%. Perlakuan kelima diberikan pencekokan ekstrak temulawak secara oral dengan dosis 35 mg/kg BB dengan pelarut etanol 96%. Perlakuan keenam diberikan pencekokan ekstrak temulawak secara oral dengan dosis 52,5 mg/kg BB dengan pelarut etanol 96%. Perlakuan ketujuh diberikan pencekokan meniran komersial secara oral dengan dosis 0.2 cc/kg BB sebagai kontrol positif. Perlakuan kedelapan diberikan pencekokan NaCl fisiologis secara oral dengan dosis 0.5 cc/kg BB sebagai kontrol negatif.
Pemeriksaan Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis
Pengamatan aktivitas dan kapasitas fagositosis secara in vitro, dilakukan
langkah sebagai berikut dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan ekstrak temulawak terakhir, semua ayam percobaan ditantang dengan bakteri Staphylococcus aureus non A sebanyak 1 ml suspensi bakteri (109 partikel bakteri/ml) melalui intraperitoneal. Setelah 1 jam, ayam-ayam percobaan disembelih, dipanen cairan peritoneal, dibuat preparat ulas, dikeringkan, difiksasi dengan metanol selama 3 menit, diwarnai dengan Giemsa, lalu dihitung aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag peritoneal.
Variabel Pengamatam Aktivitas Fagositosis
Aktivitas fagositosis adalah jumlah makrofag yang aktif melakukan proses fagositosis dalam 50 makrofag yang diamati, dan dinyatakan dalam persen. Penghitungan dilakukan sebanyak 2 kali (duplo).
Kapasitas Fagositosis
Kapasitas fagositosis adalah jumlah rata-rata bakteri Staphylococcus aureus nonprotein A yang difagosit oleh makrofag yang aktif dan besaran kapasitas fagositosis adalah jumlah partikel bakteri per butir sel makrofag peritoneal yang aktif. Penghitungan dilakukan sebanyak 2 kali (duplo).
24
Rancangan Percobaan
Penelitian ini bertujuan untuk mengamati interaksi dan pengaruh dari ekstrak temulawak terhadap aktivitas dan kapasitas fagositosis sel makrofag peritoneal dari hewan ayam petelur. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari 8 perlakuan dosis dimana masing-masing
perlakuan diulang sebanyak 2 kali yaitu : (1) A1B1 = dosis 17,5 mg/kg BB pelarut
etanol 70%, (2) A2B1 = dosis 35 mg/kg BB pelarut etanol 70%, (3) A3B1 = dosis
52,5 mg/kg BB pelarut etanol 70%, (4) A1B2 = dosis 17,5 mg/kg BB pelarut
etanol 96%, (5) A2B2 = dosis 35 mg/kg BB pelarut etanol 96%, (6) A3B2 = dosis
52,5 mg/kg BB pelarut etanol 96%, (7), K1 = kontrol positif dan (8) K2 = kontrol
negatif.
Model Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal menurut Gaspersz (1991) adalah sebagai berikut:
dengan
Yij =Nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-j yang memperoleh
kombinasi perlakuan ke-i µ = Nilai tengah umum
τi = Pengaruh perlakuan ke-i
εij = Pengaruh galat percobaan ke-j yang memperoleh kombinasi perlakuan
ke-i
Data hasil pengamatan dianalisis dengan analisis ragam (ANOVA) untuk mengetahui pengaruh pemberian dosis ekstrak temulawak pada aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag peritoneal pada ayam petelur. Selanjutnya uji Duncan dilakukan untuk perlakuan yang berpengaruh nyata. Terakhir uji ortogonal polinomial dilakukan untuk melihat persamaan pengaruh peningkatan dosis ekstrak etanol temulawak pada pelarut etanol 70% dan 96% terhadap aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag peritoneal ayam petelur.
25