BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
H. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
1. Definisi dan Instrumentasi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut
dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan
teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian
senyawa tertentu dalam suatu sampel. KCKT merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kuantitatif
maupun kualitatif (Ganjar dan Rohman, 2007).
Pada sistem KCKT sampel akan dibawa masuk ke dalam kolom
oleh fase gerak. Proses pemisahan komponen dalam sampel terjadi karena
adanya interaksi yang berbeda antara komponen dalam sampel dengan fase
gerak dan fase diam yang berada di dalam kolom (Harvey, 2000).
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen
pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak (pompa),
alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer
Gambar 6. Diagram Skematik Alat KCKT (Ahuja dan Dong, 2005).
a. Wadah Fase Gerak dan Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase
gerak. Larutan fase gerak atau eluent biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur dan secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel menentukan daya elusi
dan resolusi. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi
fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi
fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan
untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika
sampel memiliki kisaran polaritas yang lebar. Fase gerak sebelum
digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil. Fase gerak juga harus diultrasonikasi (penghilangan
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Pada saat menyiapkan pelarut untuk fase gerak sangat dianjurkan
menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang
sangat tinggi. Adanya pengotor dalam fase gerak dapat menyebabkan
gangguan pada sistem kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).
b. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yaitu: pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan untuk
pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa
yang digunakan seharusnya mampu memberikan tekanan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa adalah unuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT
yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan (Gandjar dan Rohman, 2007).
c. Tempat Penyuntikan Sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom
katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal. Pada saat penyuntikkan, katup diputar sehingga
fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan mengalir sampai ke
kolom. Kelebihan penyuntikan sampel akan dikeluarkan ke pembuang
(Gandjar dan Rohman, 2007).
d. Kolom
Kolom pada KCKT berbentuk tabung silinder berisi partikel silika
yang ukurannya 1,5-5 µm. Pori-pori pada silika dilapisi oleh fase diam
yang berikatan dengan partikel-patikel silika. Fase diam yang biasa
digunakan adalah C18 (oktadesilsilan), C8 (oktilsilan), dan C4
(butilsilan). Pada dasarnya pori-pori pada silika adalah ruang yang ada
diantara partikel-partikel silika yang beragregasi (Snyder dkk., 2010).
Pada kolom KCKT terjadi proses pemisahan antar komponen
dalam sampel. Pemisahan terjadi berdasarkan interaksi yang terjadi
antara komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam. Pada
sistem KCKT fase terbalik, fase diam yang digunakan bersifat lebih
nonpolar dari fase gerak yang digunakan. Komponen dalam sampel
yang bersifat polar akan terelusi lebih dahulu dari kolom KCKT,
sedangkan komponen dalam sampel yang bersifat nonpolar akan
terelusi lebih lambat dari kolom KCKT. Hal ini disebabkan karena
interaksi antara komponen polar dalam sampel dengan fase diam
lemah sehingga lebih terbawa fase gerak dan interaksi antara
komponen nonpolar dalam sampel dengan fase diam lebih kuat
sehingga lebih sukar terbawa fase gerak (Snyder dkk., 2010).
e. Fase Diam
Fase diam yang banyak digunakan pada KCKT adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen
seperti klorosilan. Gugus silanol akan bereaksi dengan klorosilan dan
mengganti gugus silanol dengan gugus fungsional. Hasil modifikasi
tersebut adalah silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis, karena
adanya ikatan siloksan (Si-O-Si).
Interaksi antara silika dengan fase diam stabil pada pH diatas 2. R
merupakan gugus metil yang terikat, banyakanya gugus metil yang
terikat akan menentukan sifat kepolaran. Fase diam bersifat polar
apabila gugus metil yang terikat pendek dan bersifat semakin non polar
apabila gugus metil yang terikat semakin panjang (Ahuja dan Dong,
2005).
Gambar 9. Interaksi Silika dengan Fase Diam (Ahuja dan Dong, 2005).
Oktadesilsilan (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
dengan kepolaran rendah, sedang, dan tinggi. Oktil atau rantai alkil
yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut polar (Gandjar dan
Rohman, 2007).
f. Detektor
Detektor KCKT yang ideal memiliki karakteristik sebagai berikut:
1. Memiliki respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2. Memiliki sensitivitas yang tinggi, mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil
3. Stabil pada pengoperasiannya
4. Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi
solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada KCKT ada dua jenis detektor, yaitu:
1. Detektor Pemisahan
Teknik pengukuran ini menggunakan detektor universal
yang dapat mendeteksi banyak komponen. Detektor akan
mengukur setiap komponen yang terbawa oleh fase gerak.
Salah satu detektor pemisahan adalah detektor indek bias.
Keunggulan detektor pemisahan adalah dapat mendeteksi
kolom akan terdeteksi sehingga menjadi kurang
selektif(Rohman, 2009).
2. Detektor Spesifik sampel
Teknik pengukuran ini didasarkan pada karakter sampel
yang unik. Detektor akan mendeteksi keunikan dari karakter
sampel, contohnya pengukuran komponen sampel yang
mengabsorpsi sinar uv panjang gelombang spesifik(Snyder
dkk., 2010).
