BAB III METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan Asam Fosfat 0,1 M
Larutan pekat H3PO4 dengan konsentrasi 85% diambil sebanyak
1,2 mL, kemudian diencerkan dengan akuabides 100,0 mL sehingga
konsentrasi H3PO4menjadi 0,1M.
2. Pembuatan Bufer Kalium Dihidrogen Fosfat 0,01M
Sebanyak 0,68 g KH2SO4ditimbang seksama dan dilarutkan dalam
akuabides hingga 500,0 mL sehingga konsentrasi menjadi 0,01 M,
kemudian pH diatur dengan penambahan asam fosfat 0,1 M hingga
mencapai pH 3,0.
3. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak dibuat dari campuran metanol : 0,01 M bufer kalium
gerak tersebut disaring dengan kertas saring Whatman dengan bantuan
pompa vakum, kemudian diultrasonikasi selama 15 menit.
4. Pembuatan Larutan Baku Salbutamol Sulfat dan Guaifenein untuk
Penentuan Panjang Gelombang
a. Pembuatan Larutan Baku Salbutamol Sulfat
Larutan baku salbutamol sulfat konsentrasi 1000 µg/mL dibuat
dengan menimbang secara seksama baku salbutamol sulfat sebanyak
10,0 mg dan dilarutkan dengan metanol ke dalam labu takar 10,0 mL
hingga tanda, kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi
berbeda yaitu 100; 300; dan 600 µg/mL dengan mengencerkan 1,0;
3,0; dan 6,0 mL larutan stok tersebut dengan metanol hingga 10,0 mL.
b. Pembuatan Larutan BakuGuaifenesin
Larutan baku guaifenesin konsentrasi 400µg/mL dibuat dengan
menimbang secara seksama baku guaifenesin sebanyak 20,0 mg dan
dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur 10,0 mL hingga tanda,
kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 20;
60; dan 100 µg/mL dengan mengencerkan 0,5; 1,5; dan 2,5 mL larutan
stok tersebut dengan metanol hingga 10,0 mL.
5. Penetapan Panjang Gelombang(λ) Maksimum Salbutamol Sulfat dan
Guaifenesin dengan Spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing konsentrasi larutan seri baku salbutamol sulfat
100; 300; dan 600μg/mL dan guaifenesin 20; 60; dan 100μg/mL dibacaserapannya pada panjang gelombang 200-400 nm dengan
spektrofotometer UV-Vis. Nilai λ maksimum merupakan λ yang
memberikan serapan terbesar dan sama pada tiap konsentrasi dari tiga seri
larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin.
6. Pembuatan Larutan Baku Salbutamol Sulfat
a. Pembuatan Larutan Stok Salbutamol Sulfat
Larutan stok salbutamol sulfat konsentrasi 200 μg/mL dibuat dengan menimbang secara seksama baku salbutamol sulfat sebanyak
10,0 mg dan diencerkan dengan metanol ke dalam labu takar 50,0 mL
hingga tanda.
b. Pembuatan Larutan Intermediet Salbutamol Sulfat
Larutan intermediet salbutamol sulfat konsentrasi 20μg/mL dibuat dengan mengambil sebanyak 500,0 µ L larutan stok salbutamol
sulfat denganmicropipetdan dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL,
kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda
7. Pembuatan Larutan Baku Guaifenesin
Larutan stok guaifenesin konsentrasi 900 μg/mL dibuat dengan menimbang secara seksama baku guaifenesin sebanyak 22,5 mg dan
diencerkan dengan metanol dalam labu takar 25,0 mL hingga tanda.
8. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran Salbutamol Sulfat dan
Guaifenesin
Seri larutan baku campuran salbutamol sulfat dan guafenesin
konsentrasi (0,8 dan 36); (1 dan 45); (1,2 dan 54); (1,4 dan 63); dan (1,6
700,0; 800,0µL larutan intermediet salbutamol sulfat dan mengambil
sebanyak 400,0; 500,0; 600,0; 700,0; 800,0µL larutan baku guaifenesin
dengan micropipet dan masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar
10,0 mL, kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda. Larutan
kemudian disaring denganmilliporedan diultrasonikasi selama 15 menit.
9. Pengujian Stabilitas Baku Pembanding
Pengujian stabilitas baku pembanding menggunakan tiga seri
larutan baku salbutamol sulfat konsentrasi 0,8; 1,2; 1,6 µg/mL dan
guaifenesin konsentrasi 36; 54; 72 µg/mL yang telah disaring dengan
milipore dan diultrasonikasi selama 15 menit. Tiga seri larutan baku
salbutamol sulfat dan guaifenesin masing-masing konsentrasi diinjeksikan
sejumlah 20 µL pada sistem KCKT fase terbalik dengan komposisi fase
gerak campuran metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3,0
(40:60) dan kecepatan alir 1,0 mL/menit hasil optimasi. Pengujian
stabilitas baku pembanding dilakukan selama tiga hari.
10. Pembuatan Kurva Baku Salbutamol Sulfat dan Guaifenesin
Pembuatan kurva baku salbutamol sulfat dan guaifenesin
menggunakan seri larutan baku campuan salbutamol sulfat dan guaifenesin
konsentrasi (0,8 dan 36); (1 dan 45); (1,2 dan 54); (1,4 dan 63); dan (1,6
dan 72) μg/mL yang telah disaring dengan millipore dan diultrasonikasi selama 15 menit. Seri larutan baku campuran salbutamol sulfat dan
guaifenesin masing-masing konsentrasi diinjeksikan sejumlah 20 µL pada
metanol : 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3,0 (40:60) dan
kecepatan alir 1,0 mL/menit hasil optimasi. Berdasarkan kromatogram
akan diperoleh luas area salbutamol sulfat dan guaifenesin untuk
masing-masing konsentrasi seri larutan baku campuran. Deteksi luas area ini
kemudian diplotkan terhadap konsentrasi seri larutan baku campuran
salbutamol sulfat dan guaifenesin untuk memperoleh regresi linear dengan
persamaan y = bx + a dengan kriteria keberterimaan (r) ≥ 0,998
(Kazakevich dan Lobrutto, 2007).
11. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil 10 unit sediaan
sirup secara acak yang mewakili satu batch dari produksi sediaan sirup
merek“X”kemudian dicampur menjadi satu hingga homogen.
12. Keseragaman volume
Keseragaman volume menggunakan piknometer untuk mengetahui
berat jenis sampel dengan standar air yang memiliki berat jenis 0,997
g/mL pada suhu 250C. Pengukuran berat jenis sampel dikakukan replikasi
sebanyak tiga kali.
13. Preparasi Sampel
a. Pembuatan Larutan Stok Sampel
Sediaan sirup merek “X” mengandung 1,20 mg salbutamol
sulfat dan 50,0 mg guaifenesin tiap 5,0 mL.Larutan stok sampel
konsentrasi 12 µg/mL salbutamol sulfat dan 500,0 μg/mL guaifenesin dibuat dengan mengambil sampel yang telah dicampur
homogen menggunakan micropipet sebanyak 250,0 µL kemudian
dimasukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL dan diencerkan dengan
metanol hingga tanda.
b. Pembuatan Larutan Sampel
Larutan sampel konsentrasi 1,2 µg/mL salbutamol sulfat
dan 50,0μg/mL guaifenesin dibuat dengan mengambil larutan stok sampel menggunakan micropipet sebanyak 500,0 µL kemudian
dimasukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL dan diencerkan dengan
metanol hingga tanda. Larutan sampel disaring menggunakan
milliporedan diultrasonikasi selama 15 menit.
14. Penetapan Kadar Sampel
Larutan sampel yang telah dipreparasi diinjeksikan sejumlah 20 µL
ke sistem KCKT yang telah dioptimasi dan divalidasi.Berdasarkan
kromatogram sampel akan diperoleh AUC salbutamol sulfat dan
guaifenesin dari masing replikasi. Selanjutnya AUC
masing-masing sampel di masukkan ke persamaan regresi linear bakusalbutamol
sufat dan guaifenesin yang diperoleh dari hasil validasi, sehingga
diperoleh kadar salbutamol sulfat dan guaifenesin dalam sampel.
