BAB 4 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
4.1.1 Determinasi Tanaman
Sampel daun halban yang digunakan dalam penelitian ini dideterminasi di Herbarium Bogoriensis, bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Vitex Pinnata L famili Verbenaceae (Lampiran 1).
4.1.2 Hasil Uji Skrining Fitokimia pada daun Tanaman Halban
Hasil pemeriksaan awal (skrining fitokimia) yang bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan mentabolit sekunder pada daun tanaman halban yang telah dilakukan dapat dilihat pada Tabel 4.1 di bawah ini.
Tabel 4.1 Hasil uji skrining fitokimia pada daun tanaman halban (Vitex Pinnata L)
Jenis Sampel
Sampel dalam fraksi metanol metabolit Sekunder Sampel dalam Fenolik Terpen/
Steroid Alkaloid Saponin Etanol
Pereaksi Pereaksi Pereaksi Pereaksi Pereak si
Keterangan : (+) mengandung senyawa metabolit sekunder (-) Tidak mengandung senyawa metabolit sekunder
4.1.3 Hasil Ekstraksi Daun Halban (Vitex pinnata L)
Daun halban yang diperoleh dari Desa Mananggini, Kecamatan Kuala Simpang Kabupaten Aceh Tamiang diangin-anginkan sampai kadar selama 1 minggu sampai kadar air relatif berkurang, kemudian ddaun halban tersebut digiling sampai menjadi serbuk halus, selanjutnya diambil sebanyak 6 kg untuk dimaserasi dengan metanol selama 48 jam (dua hari) sebanyak tiga kali ulangan sampai ekstraksnya benar-benar telah habis. Hasil maserasi kemudian disaring dan dilakukan penguapan pelarut dengan rotary evaporator, sampai diperoleh ekstrak kental, ekstrak kental tersebut diangin-anginkan sampai diperoleh ekstrak metanol padat. Ekstraks metanol padat yang diperoleh sebanyak 480 gram. Dari 480 gram yang diperoleh diambil sebanyak 60 gram kemudian ditambahkan dengan air lalu disaring. Tujuan penambahan air adalah untuk membuang tanin.
Ekstraks air yang diperoleh selanjutnya dipartisi dengan etil asetat sebanyak empat kali ulangan, diperoleh ekstrak etil asetat dan air. Ekstraks etil asetat diuapakan menggunakan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak air diberi perlakuan lebih lanjut yaitu dipartisi dengan n-heksan sebanyak empat kali ulangan, diperoleh ekstrak air dengan ekstrak n –heksan. Ekstraks n –heksan diuapakan kembali dengan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Dari 60 gram ekstraks metanol yang diekstrak lebih lanjut diperoleh fraksi etil asetat, fraksi air dan fraksi n-heksan yang bobotnya dapat dilihat pada Tabel 4.2 di bawah ini.
Tabel 4.2 Berat ekstrak metanol, etil asetas, air dan n-heksan hasil eksraksi dari 60 gr
Ekstrak yang diperoleh dari Tabel 4.2 di atas selanjutnya dilakukan pengujian antioksidan. Tujuan pengujian antioksidan adalah untuk melihat ekstrak mana yang memiliki aktivitas antioksidan. Jika dalam suatu ekstrak memiliki aktivitas antioksidan maka ekstrak tersebut diduga mengandung senyawa aktif tertentu sehingga ekstrak
tersebut dapat diberi perlakuan lebih lanjut yaitu isolasi senyawa aktif yang terdapat di dalam ekstrak. Hasil pengujian antioksidan ini akan menjadi rujukan untuk proses selanjutnya yaitu proses isolasi dan pemurnian ekstrak. Hasil penggujian antioksidan dan nilai inhibitor concentration 50 (IC50) terhadap ekstrak n-heksan, etil asetat dan estrak air dapat dilihat pada Tabel 4.3 di bawah ini.
Tabel 4.3 Hasil pengujian antioksidan serta nilai IC50 pada tiap-tiap ekstrak Ekstrak/
Grafik hasil pengujian antioksidan pada masing-masing fraksi berturut-turut yaitu fraksi n-heksan, etil asetat, air dan metanol dapat dilihat pada Gambar 4.1, 4.2. 4.3 dan 4.4 di bawah ini.
Gambar 4.1 Grafik hasil uji antioksidan ekstrak fraksi n-heksan
Gambar 4.2 Grafik hasil uji antioksidan ekstrak etil asetat
Gambar 4.3 Grafik hasil uji antioksidan ekstraks air
y = 0.3132x + 2.1738
Gambar 4.4 Grafik hasil uji antioksidan ekstraks metanol
Nilai IC50 (inhibitor concentration) merupakan konsentrasi larutan substrat atau sampel yang mampu mereduksi aktivitas DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazil) sebesar 50% atau konsentrasi antioksidan (μg/mL) yang mampu menghambat 50% radikal bebas. Nilai IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara 50% daya hambatan dengan sumbu konsentrasi (Choudhary et al, 2013). Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan. Secara spesifik suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50 ppm (IC50 < 50 ppm), kuat (50 ppm < IC50 < 100 ppm), sedang (100 ppm < IC50 < 150 ppm), lemah (150 ppm < IC50 <
200 ppm), dan sangat lemah (IC50 > 200 ppm) (Molyneux, 2004). Berdasarkan gambar di atas nilai IC50 lebih kecil dari 50 ppm yang berarti ekstrak tersebut memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat. Aktivitas yang sangat kuat dimulai dari ekstrak metanol, ekstraks etil asetat dan ekstrak air, sedangkan pada ekstraks n-heksan memiliki aktivitas antioksidan yang lemah. Dari hasil pengujian aktivitas antioksidan pada semua ekstrak yang diperoleh maka ekstrak etil asetat dan ekstrak air dapat diisolasi dengan melakukan pemurnian lebih lanjut.
4.1.4 Pemurnian Ekstraks Etil Asetat dan Air dengan Kromatografi Kolom 4.1.4.1 Isolasi dan Pemurnian Fraksi Etil Asetat dengan Kromatografi Kolom
Ekstrak/fraksi etil asetat sebanyak 9,98 gram diisolasi/dipisahkan menggunakan kolom kromatografi gravitasi menggunakan pelarut n-heksan : etil asetat (EtAc). Dari
y = 0.7299x + 36.086
hasil kolom kromatografi diperoleh 110 fraksi. Untuk memudahkan penyebutan fraksi ini selanjutnya disebut dengan VDH (Vitex pinnata daun halban). Hasil kromatografi kolom fraksi etil asetat dapat dilihat pada Tabel 4.4 di bawah ini.
Tabel 4.4 Hasil kromatografi kolom fraksi etil asetat No Fraksi No.Vial Fase Gerak
Selanjutnya seluruh fraksi yang diperoleh dilakukan pengujian dengan plat kromatografi lapis tipis (KLT). Fraksi 1-40 menggunakan fase gerak n-heksan : Etil asetat (EtAC) (10:1), fraksi 41-79 n-heksan : EtAc ( 5: 1), fraksi 80-91 n-heksan : EtAc (5:1) dan fraksi 92-110 n-heksan : EtAc (1:1). Hal ini bertujuan untuk mengabungkan fraksi yang memiliki Rf (Retadansi solute) yang sama yang dilihat berdasarkan jarak noda/spot atau nilai Rf dapat diperoleh dengan rumus : Jarak yang ditempuh zat terlarut (noda/) dibagi dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Proses penggabungan dengan KLT tersebut diperoleh sepuluh fraksi. Kesepuluh fraksi tersebut memiliki berat yang berbeda-beda. Berat masing-masing fraksi, nomor botol vial dan Rf dapat dilihat pada
5 VDH5 21-47 208,9 0,25
6 VDH6 48-70 145,6 0,22
7 VDH7 71-79 113,0 0,18
8 VDH8 80-100 551,8 0,15
9 VDH9 101-110 345,1 0,1
10 VDH10 111-150 4015,3 0,01
Hasil penggabungan sebanyak sepuluh fraksi menggunakan fase gerak n-heksan : EtAc (5:1) dan (2:1) dapat dilihat dapat dilihat pada Gambar 4.5 di bawah ini.
Gambar 4.5 Kromatogram sepuluh fraksi hasil penggabungan dari kromatografi kolom dengan eluen n-heksan : etil asetat (a) 5:1 dan (b) 2:1
Setelah diperoleh sepuluh fraksi selanjutnya setiap fraksi diuji aktivitas antioksidannya pada konsentrasi sampel tertinggi yaitu 100 ppm menggunakan metode DPPH dengan kontrol positif vitamin C. Pada pengujian ini ingin dlihat persentase hambatannya. Hasil pengujian aktivitas antioksidannya:dapat dilihat pada Tabel 4.6 di bawah ini.
(a) (b)
Tabel 4.6 Aktivitas antioksidan fraksi VDH1 sampai dengan VDH10
Berdasarkan uji antioksidan yang telah dilakukan pada 10 fraksi gabungan, terlihat bahwa fraksi VDH9 memiliki persen inhibisi yang paling tinggi, dilanjutkan dengan fraksi VDH10 dan fraksi VDH7. Diantara keseluruhan fraksi yang diuji antioksidannya, fraksi VDH9 memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi. Fraksi Hasil uji antioksidan ini menentukan untuk pemurnian selanjutnya.
Selain uji antioksidan dilakukan juga uji toksisitas pada pada fraksi VDH1 sampai dengan fraksi VDH 10. Hasil uji toksisitas dapat dilihat pada Tabel 4.7 di bawah ini.
Tabel 4.7 Hasil uji toksisitas pada fraksi VHD1 sampai VDH10
No Fraksi Fraksi LC50
Berdasarkan hasil uji antioksidan (Tabel 4.6) dan uji toksisitas (Tabel 4.7) terlihat bahwa fraksi VDH 9 memiliki antioksidan tertinggi dan fraksi VDH8 memiliki toksisitas tertinggi, dengan nilai LC50 (lethal concentration) 59, 41 sehingga pemurnian selanjutnya difokuskan pada kedua fraksi tersebut yaitu VDH9 dan VDH8.
Pemurnian Fraksi VDH9 dengan Kromatografi Kolom
Pemurnian lebih lanjut terhadap fraksi VDH9 menggunakan pelarut n heksan : etil asetat, yaitu sebanyak 345,1 mg dimurnikan lebih lanjut menggunakan kolom kromatografi dengan eluen n-heksan : etil asetat (2 : 1) dan (1 : 1). Pada pemurnian kedua ini dihasilkan 106 fraksi. Hasil kromatografi kolom, fase gerak, bobot, dan nilai Rf dapat dilihat pada Tabel 4.8 di bawah ini.
Tabel 4.8 Hasil kromatografi kolom, fase gerak, bobot dan nilai Rf VDH9 No Fraksi No.Vial Fase gerak Bobot (dalam
miligram) Rf
1 VDH9-1 1-4 n-heksan EtAc (2:1) 16,26 0,95
2 VDH9-2 5-7 n-heksan EtAc (2:1) 6,51 0,90
3 VDH9-3 8-11 n-heksan EtAc (2:1) 13,02 0,85
4 VDH9-4 12-19 n-heksan EtAc (2:1) 26,04 0,75
5 VDH9-5 20-31 n-heksan EtAc (2:1) 39,07 0,60
6 VDH9-6 32-61 n-heksan EtAc (2:1) 97,68 0,62
7 VDH9-7 62-81 n-heksan EtAc (2:1) 65,12 0,55
8 VDH9-8 82-106 n-heksan EtAc (1:1) 81,40 0,50
Hasil penggabungan fraksi VDH9 ini setelah dilakukan pemisahan dengan teknik kromatografi kolom diperoleh delapan fraksi. Kedelapan fraksi tersebut diuji aktivitas antioksidannya. Fraksi VDH 9-8 dan VDH9-5 tidak diuji antioksidannya karena nilai Rfnya sama. Fraksi VDH9-6, VDH9-7dan VDH9-8 nilai Rfnya sama dan fraksi VDH9- 5 nilai Rf sama dengan VDH9-4. Hasil uji antioksidan kolom ke dua fraksi VDH9-1 sampai VDH 9-7 dapat dilihat pada Tabel 4.9 di bawah ini.
Tabel 4.9 Hasil uji antioksidan kolom kedua fraksi VDH9-1 sampai VDH9-7 No Fraksi Konsetrasi sampel
dalam ppm (triplo) % Inhibisi (Hambatan)
VDH9-1 100 ppm 58,42
VDH9-2 100 ppm 37,35
VDH9-3 100 ppm 91,16
VDH9-4 100 ppm 94,95
VDH9-7 100 ppm 96,52
Berdasarkan hasil KLT fraksi VDH9-3 dan VDH9-4 memiliki jarak noda yang sama sehingga kedua fraksi tersebut digabungkan. Setelah digabungkan kedua fraksi memiliki berat 144 mg. Kedua fraksi ini juga terlihat belum begitu murni, untuk itu dilakukan pemurnian lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom (kolom ke 3). Dari hasil kolom kromatografi tersebut diperoleh 52 fraksi. Untuk melihat apakah senyawa dari fraksi tersebut sudah murni dilakukan KLT kembali pada 52 fraksi yang diperoleh menggunakan eluen n-heksan: aseton (1:1). Hasil kromatografi kolom fraksi VDH9-3-13 dan VDH9-3-14 yang sudah yang sudah murni dapat dilihat pada Gambar 4.6 di bawah ini.
Gambar 4.6 Hasil kromatografi kolom fraksi VDH9-3-13 dan VDH9-3-14 yang sudah murni
Berdasarkan Gambar 4.6 senyawa yang diperoleh sudah murni yaitu pada fraksi VDH9-3.-13 dan VDH9-3-14, digabung menjadi fraksi VDH9-3- 13 yaitu berupa kristal
1 4 7 10 13 52
𝑅𝑓 =4,5 7 𝑐𝑚 = 0,6 𝑐𝑚
bening berwarna putih. Isolat yang sudah murni tersebut juga ditentukan aktivitas antioksidannya. Hasil pengujian pengujian aktivitas antioksidan dan nilai IC50 dapat dilihat pada Tabel 4.10 berikut ini.
Tabel 4.10 Uji aktivitas antioksidan dan nilai IC50 isolat VDH9-3-13 Ekstrak/
Berdasarkan pengujian aktivitas antioksidan Ttabel 4.10 di atas menunjukkan bahwa nilai IC50 41,087 hal ini menunjukkan bahwa isolat VDH9-3-13 memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat. Berdasarkan hal data-data di atas maka fraksi VDH9-3-13 yang sudah murni tersebut diambil data spektroskopinya.
Pemurnian Fraksi VDH8 Menggunakan Kolom Kromatografi
Berdasarkan hasil uji toksisitas VDH8 dengan berat 551,8 mg memiliki nilai toksitas yang paling baik yaitu nilai LC50 (lethal concentration) 59,41, untuk itu fraksi etil asetat VDH8 dimurnikan lebih lanjut yaitu dilakukan kolom ke dua pada fraksi VDH8. Pada pemurnian menggunakan kolom kromatografi yang ke dua digunakan eluen n-heksan: etil asetat (5:1). Pada kolom kedua ini diperoleh 138 fraksi. Kemudian fraksi tersebut digabungkan berdasarkan nilai Rf nya, untuk penggabungnan digunakan eluen n-heksan : etil asetat (5:1) ( untuk fraksi 1-12). Sedangkan untuk fraksi 13-138 digunakan eluen n-heksan : etil asetat (2:1). Hasil penggabungan fraksi 1-146 diperoleh 6 fraksi yang dapat dilihat pada Tabel 4.11 di bawah ini.
Tabel 4.11 Hasil penggabungan 138 fraksi, bobot dan nilai Rf No Fraksi No.Vial Fase gerak Bobot (dalam
miligram)
Rf
1 VDH8-1 1-2 n-heksan EtAc (5:1) 7,56 0,95
2 VDH8-2 3-12 n-heksan EtAc (5:1) 37,80 0,80
3 VDH8-3 13-61 n-heksan EtAc (2:1) 185,18 0,60
4 VDH8-4 62-86 n-heksan EtAc (2:1) 94,48 0,64
5 VDH8-5 87-114 n-heksan EtAc (2:1) 105,82 0,50 6 VDH8-6 115-146 n-heksan EtAc (2:1) 120,96 0,45
Setelah fraksi-fraksi digabungkan kemudian di lakukan KLT untuk melihat apakah senyawa tersebut sudah murni. Hasil KLT dapat dilihat pada Gambar 4.7 di bawah ini.
Gambar 4.7 Kromatogram hasil KLT pada fraksi VDH8-1 sampai VDH8-6
Berdasarkan kromatogram hasil KLT pada Gambar 4.7 yang hampir murni adalah fraksi VDH8-3 sehingga fraksi VDH8-3 di kromatografi kolom kembali (kolom ke 3). Hasil kromatografi kolom ke tiga menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (1:1)
1 2 3 4 5 6
diperoleh 42 fraksi. Hasil dari fraksi tersebut kemudian di KLT menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (1:1), untuk menggabungkan fraksi dengan melihat nilai Rf yang sama. Hasil penggabungan dari 42 fraksi menjadi enam fraksi yang dapat dilihat pada Tabel 4.12 di bawah ini.
Tabel 4.12 Hasil penggabungan 42 fraksi, bobot dan nilai Rf
No Fraksi No.Vial Fase gerak Bobot (dalam miligram)
Rf
1 VDH8-3-1 1-2 n-heksan EtAc (1:1) 7,48 0,94
2 VDH8-3-2 3-5 n-heksan EtAc (1:1) 11,22 0,68
3 VDH8-3-3 6-10 n-heksan EtAc (1:1) 18,70 0,50
4 VDH8-3-4 11-16 n-heksan EtAc (1:1) 22,44 0,40
5 VDH8-3-5 17-24 n-heksan EtAc (1:1) 29,92 0,37
6 VDH8-3-6 25-42 n-heksan EtAc (1:1) 67,32 0,35
Setelah digabungkan ke enam fraksi yang diperoleh di KLT kembali dengan tujuan untuk melihat apakah senyawa yang dihasilkan sudah murni. Hasil KLT menunjjukkan bahwa senyawa yang dihasilkan sudah murni, senyawa tersebut terdapat pada fraksi VDH8-3-2. Hasil kromatogram dapat dilihat pada Gambar 4.8 di bawah ini.
Gambar 4.8 Kromatogram hasil KLT (a) fraksi gabungan 1-24 (b) fraksi VDH8-3-2 yang sudah murni
(a) (b)
𝑅𝑓 =3,5 7 𝑐𝑚 = 0,5 𝑐𝑚
Berdasarkan Hasil KLT fraksi VDH8-3-2 sudah murni. Senyawa yang sudah murni tersebut juga diuji aktivitas antioksidannya, dengan tujuan untuk melihat apakah setelah menjadi isolat murni fraksi VDH8-3-2 memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 4.13 berikut ini.
Tabel 4.13 Hasil pengujian antioksidan untuk isolat VDH8-3-2 Ekstrak/
Berdasarkan data dari Tabel 4.13 ternyata VDH8-3-2 tidak memiliki aktivitas antioksidan, dengan nilai IC50 sebesar 423,543 tetapi hanya memiliki nilai toksisitas yang tinggi selanjutnya isolat VDH8-3-2 diambil data spektroskopinya.
4.1.4.2 Pemurnian Ekstrak Air dengan Kolom Kromatografi
Ektrak air yang sudah diperoleh sebanyak 32,9 gram, selanjutnya di kolom kromatografi dengan fase gerak diklroro metan/metilen klorida (CH2Cl2): metanol (MeOH) : air (H2O) serta fase diam silika gel (SiO2). Perbandingan pelarut yang digunakan adalah metilen klrorida : metanol (5:1) diperoleh 1 sampai dengan 10 fraksi.
Perbandingan pelarut metilen klorida : metanol (2:1) diperoleh 11 sampai dengan 20 fraksi, perbandingan pelarut 1: 1 diperoleh fraksi 21 sampai 28 fraksi. Untuk eluen metilen krorida : metanol : air ( 5: 5: 1) diperoleh 29 sampai 44 fraksi (kolom kromatografi pertama), dengan tampungan sebanyak 50 mL perfraksi.
Penyebutan untuk fraksi air ini selanjutnya disebut dengan VDHFA (Vitex
Kemudian dari hasil kolom kromatografi tersebut dilakukan KLT untuk penggabungan, dari hasil penggabungan diperoleh 4 fraksi yaitu (VDFA1 sampai dengan VDHFA4).
Keempat fraksi tersebut diuji aktivitas antioksidannya seperti terlihat pada Tabel 4. 15 di bawah ini.
Tabel 4.15 Hasil pengujian aktivitas antioksidan VDHFA1 sampai VDHFA4 Ekstrak/
VDHFA2 antioksidan terbaik terdapat pada fraksi VDHFA1 yaitu dengan nilai IC50 28,550, tetapi berdasarkan hasil KLT senyawa yang hampir murni terdapat pada fraksi VDHFA4 dengan IC50 adalah 49,763. Berdasarkan data hasil pengujian antioksidan dan KLT tersebut maka fraksi VDHFA4 yang dimurnikan lebih lanjut menggunakan kolom kromatografi (kolom kedua). Fraksi VDHFA1 dengan berat 2,3025 gram di kolom kromatografi kembali (kolom kromatografi ke 2) dengan eluen metilen klorida : metanol (5:1) diperoleh 65 fraksi. Hasil KLT 65 fraksi dapat dilihat pada Gambar 4.9 di bawah ini.
Gambar 4.9 Kromatogram hasil KLT fraksi 1 sampai 65
Berdasarkan hasil KLT menggunakan eluen metilen klorida : metanol (5:1) kemudian fraksi – fraksi yang diperoleh dari hasil kolom kkromatografi di atas digabungkan. Hasil penggabungan fraksi-fraksi tersebut diperoleh 6 fraksi yaitu fraksi VDHFA 2-1 sampai dengan VDHF2-6. Untuk lebih jelasnya semua fraksi yang telah digabungkan, fase gerak dan nilai Rf nya dapat dilihat pada Tabel 4. 16 di bawah ini.
Tabel 4.16 Hasil penggabungan fraksi VDHFA1 fase gerak dan nilai Rf
No Fraksi No.Botol Fase Gerak Rf
1 VDHFA2-1 1-15 Metilen klorida : metanol (5:1)
0,75
2 VDHFA2-2 16-29 Metilen klorida : metanol (5:1)
Dari hasil penggabungan fraksi pada Tabel 4.16 selanjutnya semua fraksi di KLT kembali untuk melihat apakah senyawa yang dihasilkan tersebut sudah murni. Dari hasil KLT senyawa yang hampir murni terdapat pada fraksi VDHFA2-4 yaitu fraksi 40-46.
Untuk mempertegas kembali apakah fraksi VDHFA2-4 sudah murni atau belum, selanjutnya fraksi tersebut di kromatografi lapis tipis (KLT) kembali. Kromatogram hasil KLT terlihat pada Gambar 4.10 di bawah ini.
Gambar 4.10 Kromatogram hasil KLT isolat VDHFA2-4
Selain di KLT isolat VDHFA2-4 tersebut juga diuji aktivitas antioksidannya. Hasil pengujian aktivitas antioksidannya dapat dilihat pada Tabel 4.17 di bawah ini.
Tabel 4.17 Hasil pengujian antioksidan VDHFA2-1 sampai VDHFA2-5 Ekstrak/
Dari hasil penegasan pada KLT dan juga hasil uji aktivitas antioksidan terlihat bahwa fraksi yang sudah murni terdapat pada fraksi VDHFA2-4 yaitu ( Fraksi 40-46) dan hasil uji aktivitas antioksidan juga menghasilkan nilai IC50 terbaik pada fraksi VDHFA2-4 yaitu 42,524. Berdasarkan hasil KLT dan uji aktivitas antioksidan maka fraksi tersebut selanjutnya digabungkan dan ditentukan data spekroskopinya.
Dari semua fraksi yang sudah dimurnikan diperoleh tiga isolat murni yaitu satu isolat murni dari fraksi air yaitu FDHFA2-4 (12mg) dan dua dari fraksi etil asetat VDH9-3-13 (29,0 mg) dan VDH8-3-2 (20,5 mg). Hasil isolasi yang sudah dimurnikan tersebut kemudian ditentukan struktur kimianya menggunakan spektroskopi UV-Vis, FTIR dan NMR 1 dimensi (1H-NMR, 13C-NMR, dan APT = Attached proton test), NMR 2 dimensi (1H-1H TOCSY, HSQC dan HMBC) serta LCMS.
4.2 Pembahasan
Penentuan struktur kimia untuk isolat (hasil isolasi) dilakukan pada isolat yang sudah murni yaitu sebanyak tiga isolat satu dari fraksi air VDHFA2-4 dan dua isolat dari fraksi etil asetat (EtAc) VDH9-3-13 dan VDH8-3-2. Semua isolat yang sudah murni selanjutnya dianalisis data spektranya menggunakan UV-Vis, FTIR dan NMR 1 dimensi (1H-NMR, 13C-NMR, dan APT = Attached proton test), NMR 2 dimensi (1H-1H
TOCSY, HSQC dan HMBC) serta LCMS. Hasil pengambilan data spektra untuk masing-masing isolat dapat dilihat di bawah ini.
4.2.1 Penentuan Struktur Kimia Isolat VDHFA2-4 dari Fraksi Air dengan Metode Spektroskopi
Penentuan struktur kimia untuk isolat VDHFA2-4 adalah dengan dengan melihat analisis data spektra dari UV-Vis, FTIR dan NMR 1 dimensi (1H-NMR, 13C-NMR, dan APT), NMR 2 dimensi (1H-1H TOCSY, HSQC dan HMBC) serta LCMS.
4.2.1.1 Hasil Analisis Spektra UV-Vis untuk Isolat VDHFA2-4
Isolat yang sudah murni dari VDHFA2-4 fraksi air dianalisis data spektranya menggunakan UV-Vis. Hasil analisis spektra UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 4.11 di bawah ini.
Gambar 4.11 Hasil analisis spectra UV-Vis untuk isolat VDHFA2-4
Berdasarkan Gambar 4.11 terlihat bahwa panjang gelombang maksimum untuk isolat VDHFA2-4 adalah λ257,5 nm. Menurut (Naggar et al, 1982). Isolat VDHFA2-4 panjang gelombang maksimumnya adalah 258 nm dalam air, dan dalam metanol menurut
257,5
(Oluwasesan et al, 2017) adalah λ232nm. Panjang gelombang 257,5/258 nm merupakan ciri dari kelompok iridoid glikosida dengan kerangka aucubin (Naggar et al, 1982).
4.2.1.2 Hasil Analisis Spektra FT-IR untuk Isolat VDHFA2-4
Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi tingkat energi getaran (vibrasi) yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat secara kovalen mengalami getaran (vibrasi) atau osilasi seperti dua buah bola yang terikat oleh sebuah pegas. Pada spektrum IR akan menghasilkan getaran sesuai dengan tipe ikatan yang menyusun suatu senyawa (Supratman, 2010). Sepektrum FTIR (Fourier Transformans Infra Red) untuk isolat VDHFA2-4 dapat dilihat pada Gambar 4.12 di bawah ini.
Gambar 4.12 Spektrum FTIR untuk Senyawa VDHFA2-4
Berdasarkan Gambar 4.12 menunjukkan bahwa isolat VDHFA2-4 mengandung gugus fungsi OH pada bilangan gelombang 3370 cm-1, karbon yang mengandung gugus karbonil (C=O) asam streching pada bilangan gelombang 1725-1700 cm-1, gugus fungsi
OH
C=O asam
C-O eter C=C
aromatik
eter (C-O) pada bilangan gelombang 1300-1000 cm-1. gugus fungsi C=C aromatik 1600-1450 cm-1.
4.2.1.3 Hasil Analisis Spektra 1H-NMR 1D untuk Isolat VDHFA2-4
Spektrum 1H- NMR dan 13C-NMR diperoleh dengan melarutkan cuplikan dalam deuterium kloroform (CDCl3) (0,5µL) masing-masing dalam tabung NMR (5 mm).
Spektrum direkam pada spektrofotometer JEOL untuk 1H-NMR MHz dan 13C-NMR dengan frekuensi masing-masing 500 dan 125 MHz. Spektrum 1H-NMR senyawa VDHFA2-4 menunjukkan jenis dan jumlah proton yang terdapat pada senyawa tersebut pada rentang δH0-8,50 ppm. Spektrum proton H menunjukkan jeni-jenis proton yang terdapat di dalam suatu senyawa yang ditunjukkan dengan sinyal-sinyal pada pergeseran kimia tertentu. Pergeseran kimia tersebut khas pada setiap jenis proton yang menyususn senyawa. Spektrum 1H- NMR untuk senyawa VDHFA2-4 untuk pergeseran kimia antara (δH 2,70 – 3,90 ppm) dapat dilihat pada Gambar 4.13 di bawah ini.
Gambar 4.13 Spektrum 1H- NMR untuk senyawa VDHFA2-4 (δH 2,70 – 3,90 ppm)
Berdasarkan Gambar 4.13 terlihat bahwa pada pergeseran kimia δH 2,70 ppm terdapat sinyal proton yang bertumpuk sehingga menyulitkan untuk menentukan unit struktur yang menyusun suatu senyawa. Hal ini menandakan bahwa pada posisi δH 2,70 ppm terdapat banyak proton H. Pada posisi pergeseran kimia δH 3,00 ppm terdapat proton H dengan nilai pergeseran kimia sebesar δH 2,99 ppm yaitu untuk H-9 dengan besaran kopling sebesar 7,9 Hz. Pergeseran kimia δH 4,45-5,15 ppm dapat dilihat pada Gambar 4.14 di bawah ini.
Gambar 4.14 Spektrum 1H- NMR untuk senyawa VDHFA2-4 (δH 4,45 – 5,15 ppm) Berdasarkan Gambar 4.14 terlihat bahwa terdapat banyak proton H, pada pergeran kimia (δH 4,47 ppm) terdapat proton H-6. Pada pergeseran kimia δH 4,70 ppm adanya proton H-1”. Pada pergeseran kimia δH 4,91 ppm terdapat proton H-10, sedangkan pada peergeseran kimia δH 4,99 ppm adalah pergeseran kimia untuk H-1 dan δH 5,10 ppm adalah pergeseran kimia untuk proton H-4. Selanjutnya untuk melihat pergeseran kimia
pada δH 5,80 ppm sampai dengan δH 8,0 ppm dapat dilihat pada Gambar 4.15 di bawah ini.
Gambar 4.15 Spektra 1H-NMR untuk isolat VDHFA2-4 δH (5,8 -8,0 ppm)
Berdasarkan Gambar 4.15 terlihat bahwa pada pergeseran kimia (δH 5,83 ppm) terdapat proton H-7, dari spektra di atas juga terlihat bahwa terdapat satu proton pada pergeseran kmia (δH5,83 ppm) dengan multiplisitas triplet yang diidentifikasi sebagai suatu proton vinil. Pada pergeseran kimia ( δH 6,34 ppm) terdapat sinyal untuk proton H-3.
Sedangkan pada posisi pergeseran kimia (δH 6,84 ppm) terdapat dua sinyal untuk proton H yaitu H-5’ dan H-3’ dan untuk (δH 7,91 ppm) juga terdapat dua sinyal untuk proton H-2’ dan H-6’.
Pembesaran spektra 1H-NMR lengkap dari dari pergeseran kimia (δH 0 sampai 8,0 ppm) dan sebagian proton-proton H yang terdapat dalam isolat VDHFA2-4 dapat dilihat pada Gambar 4.16 di bawah ini.
Gambar 4.16 Pembesaran spektra 1H-NMR untuk senyawa VDHFA2-4 (δH0-8,0 ppm) Berdasarkan Gambar 4.16 di atas terlihat bahwa spektra isolat VDHFA2-4 memiliki dua sinyal pada daerah aromatik dengan integrasi masing-masing 2H. Kedua sinyal tersebut terdapat pada pergeseran, (δH 6,84 ppm) untuk H-3’ dan H-5’, untuk H-2’ dan H-6’
terdapat pada pergeseran kimia (δH 7,92 ppm). Kedua sinyal itu memiliki multipilitas doublet. Sinyal dengan karakteristik tersebut merupakan ciri khas untuk benzena 1,4-disubstitusi. Sepasang proton alkena cis teridentifikasi pada pergeseran (δH 6,34 ppm
H-1”
H-2’
H-6’
H-3’
H-5’
H-3 H-7
H-9 H-5 H-6
H-1 H-4 H-10 H-10
H-6’’
yaitu H-3 dan pergeseran kmia (δH 5,10 ppm untuk H-4 dengan multiplisitas dd (doublet-doublet). Pada pergeseran kimia (δH 4,70 ppm) terdapat 1 proton anomerik (H-1”) yang cukup khas dengan multiplisitas doublet (d). Proton anomerik pada pergeseran kimia (δH 4,70 ppm untuk H-1” merupakan karakteristik O-glukosida. Nilai pergeseran kimia, multiplisitas dan nilai coupling (J) dirangkum pada Tabel 4.18 berikut ini
Tabel 4.18 Korelasi antara atom 1H-NMR, HMBC dan 13C-NMR serta nilai pergeseran kimia, kopling dan multiplisitas dari senyawa VDHFA2-4
No 1H(δ, i, m, J) 13C HMBC
Berdasarkan Tabel 4.18 Selain dirangkum pergeseran kimia untuk proton dan pergeseran kimia untuk karbon dan juga terlihat nilai pergeseran kimia karbon pada spektrum HMBC untuk masing-masing posisi karbon. Setelah mengetahui perseran
kimia 1H dan 13C selanjutnya di lakukan penentuan struktur kimia VDHFA2-4 dengan
kimia 1H dan 13C selanjutnya di lakukan penentuan struktur kimia VDHFA2-4 dengan