BAB 2 TINJUAUAN PUSTAKA
2.9 Penentuan Struktur Kimia
Kebanyakan pendekatan modern untuk elusidasi struktur dari senyawa flavonoida melibatkan penggunaan spektroskopi UV-Vis, FTIR, NMR, LC-MS.
Spektofotometer adalah alah yang digunakan untuk mengukur energi secara relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV- Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai untuk data sekunder atau data pendukung.
Pada penentuan panjang gelombang maksimum didasarkan atas perhitungan pergeseran panjang gelombang maximum karena adanya penambahan gugus pada sistem kromofor induk Senyawa yang mengandung ikatan sigma seperti pada ikatan tunggal C-C akan tereksitasi pada panjang gelombang sangat pendek di bawah 150 nm berada di luar daerah ukur spektrofotometer sehingga tidak akan menimbulkan serapan. Senyawa memiliki elektron phi (π) (mempunyai ikatan rangkap) dan mempunyai pasangan elektron bebas lebih mudah tereksitasi dan menyerap pada panjang gelombang yang lebih tinggi sehingga menimbulkan serapan pada spektrofotometer. Spektrofotometri digunakan untuk menganalisis struktur dan memberikan petunjuk adanya gugus kromofor, menetapkan kadar, menggunakan serapan maksimum dari kurva absorbsi, memeriksa kemurnian, memeriksa langsung konsentrasi analit (Gandjar, 2015)
Pada prinsipnya terdapat dua jenis spektrometer IR yang digunakan dalam teknik analisis untuk karakterisasi senyawa organik: spektrometer IR-disversed dan spektrometer IR Transformasi Fourier (FT-IR). Radiasi spektrometer IR dan FT-IR diperoleh dari emisi termal dari sumber yang tepat, sumber radiasi yang paling umum adalah padatan inert yang dipanaskan dengan listrik dalam kisaran 1.000°C sampai 1.800°C. Keunggulan dari FTIR adalah menghasilkan data dengan sangat cepat, sensitif (resolusi tinggi, dapat menganalisis sampel dalam kondisi yang berbeda (cair, padat, dll) serta membutuhkan sampel yang lebih sedikit.
Gambar 2.12 Komponen dasar dari spekrometer FTIR (Ordonez, 2012)
Massa spektrometri (MS) adalah teknik analisis untuk menentukan massa ion bebas bertekanan tinggi dan untuk menentukan komposisi unsur dan struktur molekul kimia. Sebuah spektrometer massa terdiri dari tiga modul (1) Sumber ion mengkonversi molekul fase-gas menjadi molekul bermuatan atau fragmen molekul (2) Analisis massa dengan memisahkan molekul bermuatan atau fragmen ion menurut rasio massa terhadap muatannya (m / z) dengan menerapkan medan elektromagnetik (3) Detektor mengukur nilai indikator kuantitas dan dengan demikian, akan dihasilkan Data untuk menghitung kelimpahan dari setiap ion yang ada(Hiraoka, 2013).
Sejak akhir 1990-an, HR-ESI-MS juga telah diterapkan untuk karakterisasi struktur triterpen Actaea. Demikian pula, rumus molekul dengan mudah dapat ditentukan berdasarkan puncak molekul ion MS memiliki keunggulan tertentu dalam mengidentifikasi senyawa terhalogenasi, di mana pola isotop karakteristik dapat diamati pada spektrum massa (Mann, 2014). Contoh spektrum MS dapat dilihat pada Gambar 2.13 di bawah ini.
Gambar 2.13 Spektrum MS dari senyawa yang tidak diketahui (Popp et al, 2012)
Spektroskopi NMR (Nuklear Magnetic Resonance) mengukur frekuensi (Lamor, v1) yang berasal dari dari perbedaan energi (ΔE) kemagnetan spin inti atom yang dibenamkan dalam medan magnet yang sangat kuat.merupakan metode yang sering dipakai dalam mempelajari struktur molekul. Untuk melengkapi bagian-bagian lain dari
suatu molekul organik yang belum diketahui (unknown Compound) dapat digunakan.
NMR yang dapat memberikan informasi yang berguna dalam penentuan struktur adalah
1H-NMR dan 13C-NMR 1 dimensi dan 1H-NMR dan 13C-NMR 1 dimensi. Spektrum NMR karbon dan DEPT memberikan informasi jenis atom karbon primer (CH3), sekunder (CH2) tersier (CH), dan kuarterner (q). DEPT merupakan salah satu tipe spektra NMR karbon yang memberikan informasi jumlah karbon dari CH3, CH2, CH dan C yang diukur berdasarkan sudut pengukuran NMR karbon. Selain NMR karbon tipe DEPT, percobaan NMR 1 dimensi multi pulsa salah satumya adalah APT ( Attached Proton Test ) percobaa menngunakan APT bertujuan untuk membedakan sinyal C yang dari CH2 dan sinyal C dari CH3. Sinyal karbon C/CH2 berlawanan dengan fasa sinyal karbon C/CH3. Fasa sinyal karbon dari C/CH2 sefasa dengan sinyal karbon pelarut dalam hal ini CDCl3 pada posisi 77,0 ppm.
Spektrum NMR 2 Dimensi seperti TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) yaitu mirip dengan COSY (Correlation Spectroscopy), yaitu sama-sama mencari hubungan (korelasi) homonuklir berdasarkan hubungan kopling (J). Namun ada perbedaan COSY menghasilkan korelasi kopling terutama untuk dua gugus tetangga yang berseblahan.. Sesuai namanya korelasi sebagai korelasi total, TOCSY dapat mencapai lebih luas yaitu dapat mencapi empat bahkan lima gugus yang bersebelahan, yang membentuk unit struktur tertentu (hanya dibatasi oleh adanya atom karbon kuarterner).
HSQC ( Heternuclear Singel Quantum Coherence) merupakan percobaan NMR 2 dimensi dimana yang dikumpulkan adalah sinyal proton H yang juga didasarkan pada kopling 1H dan 13C satu ikatan. APT bisa disipkan dengan HSQC. Dengan penyisipan ini maka korelasi 1H dan 13C satu ikatan pada spektrum HSQC untuk gugus CH2 (metilen) akan berlawanan fasa dengan kontur-kontur korelasi dari gugus-gugus CH (metin) dan CH3(metil). Dengan memiliki spektrum HSQC yang diedit dengan APT, maka bukan saja dapat ditentukan nilai-nilai geseran karbon yang mengikat hidrogen tertentu (atau sebaliknya), juga dapat ditentukan identitas gugus-gugus sebagai gugus metin, metilen dan metil. Perbedaan fasa pada spektrum HSQC yang diedit APT dinyatakan dengan perbedaan warna kontur, yaitu kontor berwarna biru untuk korelasi dari gugus CH2, dan
kontur berwarna merah untuk korelasi dari gugus CH dan CH2. Contoh spektrum HSQC dapat dilihat pada Gambar 2.14 di bawah ini.
Gambar 2.14 Spektrum HSQC
HMQC (Hetero Multiple Quantum Coherence) adalah untuk mengkorelasikan frekuensi 1H dan 13C dengan jarak satu ikatan dan HMBC (Hetero Multiple Bond Correlation) adalah bentuk lain dari HMQC yang dirancang untuk menghadirkan korelasi 1H dan 13C jarak jauh yaitu yang disebabkan oleh 2JCH dan 3JCH dan menekan/menghilangkan koheren akibat kopling 1H dan 13C satu ikatan. Kopling 1H dan
13C dua ikatan adalah 1H-12C-13C dan kopling 1H-13C tiga ikatan artinya 1H-12C-12C-13C yaitu hidrogen-hidrogen yang terikat ke 13C yang disebut dengan kopling 1H-13C jarak jauh.
Apabila hubungan 1H-13C satu ikatan dideteksi oleh spektrum HSQC (HMQC) maka untuk hubungan 1H-13C jarak jauh diidentifikasi dengan pengukuran HMBC. Pada dasarnya mirip dengan pengukuran HSQC tetapi parameter kopling 1H-13C yang digumakan adalah 8Hz yaitu rata-rata besarnya kopling 1H-13C jarak jauh (dua atau tiga ikatan) yang rentangnya 0-16Hz Contoh spektrum HMBC dapat dilihat pada Gambar 2.15 di bawah ini.
Gambar 2.15 Spektrum HMBC
Pengukuran 2 dimensi ini terutama ditujukan untuk menidentifikasi posisi atom karbon kuarterner atau atom karbon C=O terhadap suatu gugus CHn. Karena adanya karbon kuarterner atau C=O memutuskan sistem spin hidrogen dari untaian gugus-gugus CHn, maka spektrum HMBC digunakan untuk menggabungkan unit-unit struktur.Besarnya kopling jarak jauh lebih kecil dari 1JCH, yaitu antara 0-16 Hz atau sekitar 8Hz dan seorde dengan kopling homonuklir ( 1H-1H) (Syah, 2016).
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
a. Pelaksanan penelitian berupa skrining fitokimia, ekstraksi sampel dan isolasi dilakukan di Laboratorium Pasca Kimia dan Kimia Organik Bahan Alam FMIPA USU.
b. Uji antioksidan dan uji toksisitas serta pemurnian dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor.
c. Pengambilan data spektra UV, FTIR, NMR dan MS dilakukan di Puslit Kimia LIPI Serpong dan Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB.
Penelitian ini dilakukan dari Januari tahun 2015 sampai Juni tahun 2017.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Pada tahap isolasi dan pemisahan senyawa, peralatan yang digunakan adalah peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, chamber, peralatan rotary evaporator, peralatan kromatografi gravitasi menggunakan silaka gel dan kolom kromatografi dengan berbagai ukuran Pada tahap karakteristik peralatan yang digunakan adalah spektrofotometer ultraviolet Variant Conc.100, spektrofotometer FTIR Perkin Elmer Spectrum One, spektrometer NMR JEOL JNM A5000 yang beroperasi pada frekuensi 500 MHz NMR (1H) dan 125 MHz (13C) dengan menggunakan TMS sebagai standar internal.
3.2.2 Bahan
Bahan Kimia yang digunakan meliputi berbagai pelarut organik, silika gel dan pereaksi penampak noda pada kromatografi lapis tipis (KLT). Pelarut yang digunakan antara lain adalah metanol teknis, aseton teknis, etil asetat teknis, n-heksan teknis yang kemudian di uapkan dengan rotavapor serta kloroform proanalis. Jenis-jenis silika gel yang digunakan dalam penelitian ini antara lain silika gel Merck 60 GF254 untuk kromatografi kolom dan pelat alumunium berlapis silika gel Merck Kieselgel 60 GF254
dengan ketebalan 0,25 mm untuk analisis KLT. Pereaksi untuk uji kualitatif yaitu 3%
serium sulfat dalam asam sulfat 2N. Uji antioksidan menggunakan reagen DPPH, vitamin C dan metanol p.a. untuk uji toksiitas mengunakan larva udang dan DMSO.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Pengumpulan Sampel dan Diterminasi
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman tanaman halban (Vitex pinnata. L) yang diperoleh dari Kota Kuala Simpang yaitu di desa Manangini. Daun tanaman tersebut kemudian dikeringkan/ diangin-anginkan sampai beratnya relatif tidak berubah, kemudian dihaluskan hingga berupa serbuk selanjutnya dilakukan pengujian awal terhadap sampel yaitu uji skrining fitokimia untuk mengetahui zat aktif yang terkandung di dalam daun tanaman halban. Untuk diterminasi tanaman halban dibawa ke pusat herbarium “Herbarium Bogoriense” bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor untuk ditentukan taksonomi dari tanaman halban tersebut.
3.3.2 Uji Skrining Fitokimia a.Tes untuk uji Fenolik
Ekstrak metanol sebanyak 2 mL dilarutkan dengan beberapa tetes larutan besi (III) klorida 0,1M. Pembentukan warna hitam kebiruan menunjukkan adanya senyawa fenol.
b. Tes untuk uji alkaloid (Iqbal et al 2015)
Sekitar 50 gram serbuk daun halban direndam di dalam metanol selama 15 menit, kemudian fitratnya disaring dan dibagi menjadi empat bagian yang sama ke dalam empat tabung reaksi, tabung satu ditambahkan 1 mL pereaksi Dragendorff (Potassium bismut iodida), jika terbentuk endapan merah hingga oranye menunjukkan adaanya alkaloid. Tabung ke dua di tambahkan 1 mL pereaksi Mayer (Potassium iodida merkuri), jika terbentuk endapan putih kekuningan menunjukkan adanya alkaloid. Tabung ke tiga ditambahkan dengan beberapa tetes pereaksi Wagner (Kalium iodida 2 gr dan yodium 1,27 gr) dilarutkan dalam air suling 5 mL dan selanjutnya larutan diencerkan menjadi 100 mL dengan air suling ). Jika
terbentuk endapan berwarna coklat menunjukkan adanya alkaloid. Tabung ke empat ditambahkan dengan 3 tetes pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam, menunjukkan adanya alkaloid.
c. Pemeriksaan Flavonoida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 gram lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 mL air suling, setelah dingin ditambahkan 5 mL eter, dikocok hati-hati, lalu didiamkan sebentar. Lapisan metanolnya diambil, diuapkan pada temperatur 40oC, sisanya dilarutkan dalam 5 mL etil asetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoida dengan cara berikut:
1) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 2 ml etanol 95%, lalu ditambahkan 0,5 gram serbuk seng dan 2 mL asam klorida 2 N, didiamkan selama 1 menit, kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam waktu 2 – 5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoida.
2) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 2 mL etanol 95%, lalu ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terbentuk warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan adanya flavonoida.
3) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 2 mL etanol 95%, lalu ditambahkan pereaksi NaOH 10%. Jika terjadi warna biru violet menunjukkan adanya flavonoida.
4) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dengan 2 mL etanol 95%, lalu ditambahkan pereaksi FeCl3 1%. Jika terbentuk warna hitam menunjukkan adanya flavonoida.
5) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dengan 2 mL etanol 95% lalu ditambahkan pereaksi H2SO4 pekat. Jika terjadi warna hijau kekuning-kuningan menunjukkan adanya flavonoida.
d. Pemeriksaan Terpenoida/Steroida ((Tarigan et al, 2008)
Sebanyak 1 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam, disaring kemudian dilakukan pemeriksaan pada masing-masing pereaksi dengan prosedur sebagai berikut:
1) Filtrat sebanyak 2 mL ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Salkowsky (H2SO4
pekat). Apabila terbentuk warna merah menunjukkan adanya terpenoida/steroida.
2) Filtrat sebanyak 2 mL ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Liebermann – Bouchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya terpenoida/steroida.
3) Filtrat sebanyak 2 mL ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi cerium sulfat 1%.
Apabila terbentuk warna coklat menunjukkan adanya terpenoida/ steroida.
e. Pemeriksaan Tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 gram, dimaserasi dengan 10 ml air suling lalu disaring. Filtrat diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan dengan 1 – 2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%.
Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
f. Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 – 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin.
3.3.3 Ekstraksi Senyawa Kimia dari Daun Halban (V. pinnata Linn)
Serbuk daun daun Halban sebanyak 5 Kg dimaserasi dengan metanol selama 48 jam, kemudian dilakukan penyaringan. Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dikeringkan sebagian dengan rotary evaporator. Ekstrak metanol hasil evaporasi kemudian ditambah air dengan volume yang sama dan kemudian disimpan di tempat gelap selama 24 jam untuk mengendapkan klorofil yang terdapat di daun. Setelah terbentuk endapan klorofil di dasar tabung, ekstrak kemudian disaring dan dilanjutkan
dengan proses partisi dengan n-heksan untuk memisahkan klorofil yang masih tersisa pada ekstrak metanol-air tersebut.
Ekstrak metanol-air kemudian dipartisi dengan pelarut etil asetat sebanyak 3 kali dan fraksi etil asetat yang diperoleh dikeringkan sehingga diperoleh ekstrak etil asetat yang berwarna hijau kehitaman pekat. Selanjutnya masing-masing ekstrak yang dihasilkan di uji aktivitas anttioksidannya yaitu ekstrak etil asetat, ekstrak air dan ekstrak n-heksan. Selain diuji aktivitas antioksidan, ekstrak juga diuji kandungan metabolit sekundernya.
3.3.4 Uji Bioaktivitas Ekstrak Daun Halban 3.3.4.1 Pengujian Toksisitas dengan BSLT
Pengujian toksisitas dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach terhadap ekstraks etil asetat, ekstraks mtanol dan ekstraks kloroform (aglikon).
Penetasan Telur Artemia salina Leach, yaitu sejumlah lebih kurang 20 mg telur Artemia salina Leach dimasukkan ke dalam bejana penetas yang telah berisi air laut sintetik yang dibuat dengan cara menimbang 38 gram garam tanpa yodium dan dilarutkan dalam 1 L air, kemudian disaring dengan kertas Whatman dan diberi penyinaran dengan lampu TL 18 watt. Setelah 24 jam, telur yang sudah menetas menjadi nauplii dipindahkan ketempat lain, 24 jam setelah itu nauplii tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji. Bejana penetas disekat sehingga memiliki dua sisi ruang, yaitu dua sisi terbuka dan tertutup.
Persiapan Larutan Uji
Sebanyak lima belas vial disiapkan, larutan uji dibuat dengan tiga konsentrasi yang berbeda yaitu 1000 bpj, 100 bpj dan 10 bpj. Masing-masing dibuat tiga kali pengulangan (triplo). 3 vial digunakan untuk kontrol. Larutan induk dibuat dengan melarutkan 20 mg ekstrak yang dilarutkan dengan 2 mL pelarut yang sesuai. Jika sampel sukar larut, maka ditambahkan dimetil sulfoksida (DMSO) 1% sebanyak 10-50 μL.
Uji Toksisitas dengan BSLT
Larutan induk dengan pelarut etanol tersebut sebanyak 500, 50 dan 5 μL berturut-turut dimasukkan kedalam vial yang telah disiapkan untuk konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm, kemudian diuapkan sempurna sampai kering. Setiap konsentrasi dibuat dalam 3 vial, kemudian kedalam masing-masing vial dimasukkan lebih kurang 3 mL air laut dan 10 ekor nauplii, kemudian ditambahkan air laut sampai diperoleh 5 mL.
Larutan diaduk sampai homogen, untuk setiap konsentrasi dibuat tiga kali pengulangan.
Nilai LC50 diperoleh menggunakan progam statistik SPSS 11.5. Dimana nilai LC50 yaitu konsentrasi zat uji yang dapat membunuh larva udang sebanyak 50%. Suatu sampel dikatakan sangat toksik terhadap larva udang Artemia salina Leach apabila mempunyai LC50 < 30 μg/mL, toksik apabila mempunyai LC50 30-1000 μg/mL dan tidak toksik apabila mempunyai LC50 > 1000 μg/mL.
3.3.4.2 Uji Aktivitas Antioksidan
Berat sampel/ekstrak sebanyak 2,5 mg ditambahkan dengan metanol p.a 5 mL sehingga diperoleh konsentrasi sampel 500 ppm ( larutan induk). Dari larutan induk dilakukan pengenceran untuk mendapatkan konsentrasi 5ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm dan 100 ppm. Setelah masing-masing konsentrasi diperoleh, selanjutnya ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 0,6 mL DPPH 0,4 mM lalu ditambahkan metanol sampai tanda 3 mL ke dalam tabung reaksi (yang sudah ditutup dengan aluminium foil), kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex mixer dan diinkubasi selama 30 menit pada T= 37oC. Kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum (517 nm). Pada tiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan. Asam askorbat (Vitamin C) digunakan sebagai pembanding (kontrol positif). Kemampuan untuk menangkap radikal bebas oleh DPPH (inhibisi) dihitung dengan menggunakan persamaan :
% Penangkapan (peredaman) = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
𝑥 100
3.4 Fraksinasi dengan Metode Kromatografi Kolom Gravitasi Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air
Fraksinasi ekstrak etil asetat menggunakan kromatografi kolom dilakukan dengan sampel sebanyak 9,92 gram ekstrak EtAc menggunakan fase diam silika gel 60 mesh dan fase gerak n-heksan-etil asetat (10:1, 5:1, 2:1 dan 1:1) total fase gerak yang digunakan adalah 600 mL). Perbedaan perbandingan fase gerak dilakukan untuk mengelompokkan senyawa-senyawa dalam sampel (simplisia) berdasarkan kepolarannya. Hasil yang deperoleh berupa fraksi-fraksi. Untuk fraksi air, berat sampelnya 32,9 gram menggunakan fase diam silika gel 60. Fase gerak yang digunakan diklorometana dan metanol, diklorometana : metanol : air ( 5:1, 2:1, 1:1 dan 5: 5:1).
Selanjutnya langkah yang ditempuh untuk memisahkan fraksi-sfraksi dari senyawa yang terdapat di dalam sampel dengan cara kromatografi adalah dengan cara memasang gelas kolom yang telah dibersihkan dengan tegak lurus pada statif, kemudian dibilas dengan fase gerak yang akan digunakan dan dikeringkan, beri tanda batas tinggi silika gel/fase diam yang akan dimasukkan ke dalam kolom gelas tersebut. Dasar kolom paling bawah diisi dengan kapas. Setelah dasar kolom di isi dengan kapas selanjutnya masukkan fase gerak n-heksan kira-kira 25% dari panjang kolom. Timbang silica gel (70-230 mesh) sebanyak 200 gr (tergantung jumlah sampel), kemudian silika gel tersebut dibuburkan menggunakan pelarut n-heksan dan diaduk sampai benar-benar homogen, lalu dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan sampai semuanya habis.
Setelah fase diam (silica gel benar sudah menyatu dengan kolom) lalu masukkan sampel yang sudah dilarutkan dengan sedikit kloroform melalui dinding kolom, selanjutnya masukkan kapas dibagian paling atas setelah masukkan eluen /fase gerak n-heksan-etil asetat secara perlahan-lahan secukupnya dengan perbandingan. Eluen yang dimasukan beurutan. Hasil berupa fraksi ditampung menggunakan botol vial ukuran 12 mm sebanyak 5 mL, kemudian fase geraknya diuapkan. Lalu di KLT kembali, fraksi yang mempunyai pola kromatogram yang sama digabung, agar diperoleh fraksi yang lebih sederhana. Hasil fraksinasi gabungan kemudian dimurnikan lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom atau kromatograafi lapis tipis preparatif.
3.5 Uji Kemurnian Menggunakan KLT
Hasil fraksi gabungan diperoleh 4 fraksi, kemudian di KLT kembali menggunakan plat alauminium silika gel. Selanjutnya di KLT preparatif menggunakan fase diam lempeng kaca silika gel GF254 dengan fase gerak n-heksan - etil asetat untuk fraksi 1 (9:1) yang dilakukan di dalam bejana kromatografi (chamber), sedangkan untuk fraksi 3 sampai 4 menggunakan fase gerak benzena-etil asetat dengan perbandingan pelarut (8:2) jumlah fase gerak yang digunakan adalah semua sama yaitu 100 ml). Cara melakukan KLT preparatif adalah sebagai berikut : ambil selembar plat kaca beri garis pembatas pada bagian bawah kira-kira 2 cm. Kemudian ambil sampel dan larutkan dengan sedikit etil asetat lalu totolkan di sepanjamg garis pembatas plat kaca. Setelah semua sampel habis ditotolkan selanjutnya plat tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang sebelumnya sudah disi dengan fase gerak yang sesuai dengan perbandinngannya.
Jika memiliki 4 fraksi maka plat yang digunakan sebanyak 4 plat Kemudian dielusi selama satu jam, setelah satu jam hasil KLT di angkat dari chamber kemudian dikeringkan dan selanjutkan untuk melihat jumlah noda pada plat digunakan lampu UV (jika nodanya kurang terpisah maka dielusi kembali selama satu jam). Noda-noda yang nampak terpisah dengan baik diberi tanda dengan pensil kemudian plat KLT yang berisi noda-noda tersebu digerus secara terpisah dan dimasukkan masing-masing ke dalam corong dengan diameter 5 mm secara terpisah untuk disaring, menggunakan pelarut metanol-etil asetat (1:1) yang dicampur senbanyak 100 mL. Hasil penyaringan tersebut dimasukkan ke dalam botol vial kemudian pelarutnya dikeringkan sampai diperoleh isolat dalam bentuk padat yang sudah murni. Hasil yang diperoleh diuji aktivitas antioksidan dan toksisitas serta penentuan struktur kimia menggunakan metode spektroskopi.
Selain prosedur di atas pemurnian senyawa juga dapat dilakukan dengan KLT dimensi. Caranya adalah sampel hasil kromatografi kolom dianalisis menggunakan fase diam lempeng silika gel GF254 dengan fase gerak kloroform-metanol (2:1) dan kloroform-asetonitril (2:1). Fraksi ditotolkan dengan cara yang sama seperti analisis KLT biasa, hanya berbeda pada sistem eluasi lempeng pada bejana kromatografi (chamber), yaitu dilakukan eluasi dua kali pada lempeng tersebut secara vertikal dan
horizontal. Bercak noda yang terbentuk dari hasil eluasi pertama verikal diberi tanda dengan pensil dibawah sinar UV, kemudian lempeng tersebut dieluasi kembali pada sisi horizontalnya. Bercak noda yang terlihat setelah elusi kedua pada sisi horizontal diberi tanda dengan pensil dibawah sinar UV. Analisis ini bertujuan untuk melihat noda yang dihasilkan tetap tunggal atau tidak setelah dilakukan pengulangan eluasi pada dua sisi yang berbeda, sehingga dapat ditentukan senyawa sudah murni atau belum.
horizontal. Bercak noda yang terbentuk dari hasil eluasi pertama verikal diberi tanda dengan pensil dibawah sinar UV, kemudian lempeng tersebut dieluasi kembali pada sisi horizontalnya. Bercak noda yang terlihat setelah elusi kedua pada sisi horizontal diberi tanda dengan pensil dibawah sinar UV. Analisis ini bertujuan untuk melihat noda yang dihasilkan tetap tunggal atau tidak setelah dilakukan pengulangan eluasi pada dua sisi yang berbeda, sehingga dapat ditentukan senyawa sudah murni atau belum.