BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Efek Induksi E. coli dan Terapi Ekstrak Etanol Daun Sawo
Organ Kolon
Gastroenteritis ditandai dengan diare dan muntah, salah satu bakteri yang dapat menimbulkan gastroenteritis yaitu E. coli. Pada kelompok kontrol positif yang dilakukan pada penelitian, yaitu tikus ( Rattus norvegicus) mengalami diare semicair, feses berwarna hijau kecoklatan, dan berat badan mengalami penurunan sekitar 5 sampai 10 gram per ekor. E. coli melakukan invasi menembus sel mukosa pencernaan sehingga menyebabkan terjadinya iritasi dan diare (Khairil dkk., 2014). Keadaan tersebut menimbulkan gangguan fungsi usus dimana peristaltik dan sekresi usus meningkat, namun fungsi dan absorpsi usus berkurang.
Analisis kadar radikal bebas dalam penelitian ini dilakukan dengan mengukur kadar malondialdehyde (MDA) organ kolon. MDA digunakan secara luas sebagai indikator keberadaan radikal bebas dalam tubuh dan kerusakan oksidatif.
Gambar 5.1 Rataan Kadar MDA organ kolon
Keterangan: (P1): kontrol negatif (tikus sehat); P(2): kontrol positif (tikus gastroenteritis); (P3): terapi I dosis 200 mg/kg BB; (P4): terapi dosis 300 mg/kg BB; (P5): terapi dosis 400 mg/kg BB.
Pada hasil post hoc dengan menggunakan uji Tukey didapatkan hasil bahwa kelompok kontrol positif rata-rata kadar MDAnya meningkat dan berbeda nyata dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif dikarenakan efek radikal bebas pada kontrol positif (P2) (Gambar 5.1). Kelompok kontrol negatif menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap kelompok perlakuan (P3). Pada kelompok perlakuan (P3) tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol positif (P2) (Lampiran 15).
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000 10.000
Kontrol - Kontrol + Terapi 1 terapi 2 terapi 3
4,790 ± 0,487(a)
8,998 ± 0,504(c)
7,981 ± 0,551(c)
6,490 ± 0,325(b)
Hasil analisis uji one way ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sawo manila dapat menurunkan kadar MDA secara signifikan (Lampiran 15).
Tabel 5.1 Kadar MDA dari organ kolon tikus
Kelompok Rata-rata Kadar
MDA (mg/mL) % Kadar MDA Peningkatan Penurunan Kontrol – (P1) 4,790 ± 0,487 a - -Kontrol + (P2) 8,998 ± 0,504 c 88 -Terapi 1 (200 mg/kgBB) (P3) 7,981 ± 0,551 c - 11 Terapi 2 (300 mg/kgBB) (P4) 6,490 ± 0,325 b - 28 Terapi 3 (400 mg/kgBB) (P5) 5,086 ± 0,845 a - 43
Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05). Persentase peningkatan terhadap kontrol negatif. Persentase penurunan terhadap kontrol positif .
Rata-rata dari kelompok perlakuan pemberian ekstrak etanol daun sawo manila cenderung menurunkan kadar MDA pada perlakuan kontrol negatif (P1) tidak berbeda nyata dengan perlakuan kelompok (P4) dan kelompok (P5) dan perlakuan kelompok (P3) tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol positif
(P2) (Tabel 5.1). Berdasarkan kadar MDA pada masing-masing kelompok perlakuan, dihasilkan presentase perbandingan antara kelompok tikus kontrol negatif dan terapi dengan tikus model gastroenteritis. Tikus model gastroenteritis dianalogikan mempunyai kadar MDA tertinggi yaitu 88%, sehingga didapatkan hasil pada masing-masing kelompok tikus; kontrol positif; terapi dosis 200 mg/kg BB; 300 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB adalah 88%; 11%; 28%; dan 43%.
Berdasarkan tabel diatas (tabel 5.1), hasil analisa uji one way ANOVA dan uji Tukey menunjukkan bahwa pemberian terapi ekstrak etanol daun sawo manila dapat menurunkan kadar MDA organ kolon secara signifikan dan menunjukkan perbedaan yang nyata. Pada persentase kadar MDA kolon kelompok tikus gastroeteritis juga ditunjukkan mengalami peningkatan jika dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol negatif (P1). Menunjukkan bahwa E. coli dapat menyebabkan terjadinya stress oksidatif yang mengakibatkan gangguan pada organ kolon. Stress oksidatif memicu terjadinya peroksidasi lipid pada kolon yang dapat merusak organel sel dan fungsi membran sel dari kolon. Terjadinya peroksidasi lipid akan meningkatkan produksi malondialdehyde (MDA). Menurut Grotto et al ., (2009), peroksidasi lipid terjadi ketika Polyunsuturated Fatty Acid (PUFA) sebagai komponen penyusun membran sel diserang oleh radikal bebas. PUFA memiliki ikatan ganda karbon-karbon yang menjadi target utama dari radikal bebas. Radikal bebas akan melemahkan ikatan karbon hidrogen, sehingga pemindahan hidrogen dapat terjadi dengan mudah. Atom hidrogen yang terlepas akan membentuk radikal lipid dan menghasilkan suatu radikal lipid peroksil ketika mengalami oksidasi. Radikal peroksil selanjutnya mengalami reaksi dengan PUFA lain, pemindahan elektron, sehingga dihasilkan lipid hiperoksida dan radikal lipid lain. Reaksi tersebut terjadi secara berantai. Salah satu produk akhir dan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid untuk menilai stress oksidatif adalah Malondialdehid (MDA). Peroksidasi lipid dapat mengganggu fisiologi membran, menyebabkan gangguan pada aliran cairan dan permeabilitas, mengubah transport ion serta menghambat reaksi metabolisme.
Pada kelompok perlakuan (P3) dan (P4) kadar MDA menurun, tetapi tidak lebih rendah dari kelompok perlakuan (P5). Hal ini berarti kelompok perlakuan (P5) (400 mg/kg BB) merupakan dosis terbaik yang dapat digunakan sebagai antioksidan pada tikus model gastroenteritis. Data ini ditunjang dengan penelitian yang dilakukan oleh Islam dkk (2012) yang menyebutkan bahwa flavonoid dan tanin dapat berperan sebagai antioksidan. Pada kelompok perlakuan lima menunjukkan bahwa flavonoid dan tanin yang terkandung dalam dosis 400 mg/kg BB dapat berperan optimal sebagai antioksidan untuk menstabilkan radikal bebas yang reaktif sehingga reaksi berantai yang terjadi akibat stress oksidatif dapat terhambat dan MDA sebagai produk hasil proksidasi lipid juga menurun. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi pemberian dosis terapi maka penurunan kadar MDA sama dengan kelompok kontrol sehat.
Pemberian terapi ekstrak etanol daun sawo manila pada dosis 400 mg/kg BB dapat menekan adanya peningkatan kadar MDA di dalam kolon yang diakibatkan oleh E. coli yang menghasilkan endotoksin berupa lipopolisakarida (LPS) yang memicu sel makrofag kemudian menghasilkan sitokin, adanya aktifitas makrofag ini menimbulkan ekspresi pada jaringan yang mengalami paparan bakteri, sehingga terjadi ketidak seimbangan radikal bebas yang mengaibatkan terjadinya stress oksidatif. Maka dosis terapi tersebut merupakan dosis yang terbaik dan signifikan serta terdapat perbedaan nyata dalam penurunan kadar MDA pada organ kolon yang ditunjukkan dengan penurunan kadar MDA organ kolon jika dibandingkan dengan kelompok yang tidak diterapi serta kelompok terapi dosis 200 mg/kg BB dan 300 mg/kg BB.
Malondialdehyde (MDA) adalah senyawa kristal higroskopis berwarna putih yang terbentuk dari hidrolisis asam 1,1,3,3- tetraethoxypropane. Salah satu biomarker yang sering digunakan untuk mengetahui level peroksidasi lipid total adalah kadar dari malondialdehyde plasma. Pengukuran MDA memberikan perkiraan aktivitas radikal bebas serta sebagai penanda terjadinya stres oksidatif di
dalam tubuh (Karim, 2011).
Pada kelompok kontrol negatif (P1) terdapat kadar MDA. Adanya kadar MDA pada kelompok kontrol negatif tersebut menunjukkan bahwa kondisi normal ataupun sehat juga masih terdapat radikal bebas. Radikal bebas di dalam tubuh berasal dari oksigen yang dihirup, oksigen menghasilkan banyak energi namun hasil samping dari reaksi pembentukan energi tersebut akan menghasilkan Reactive Oygen Species (ROS), metabolisme aerobik pada organisme selalu diikuti terbentuknya radikal bebas, proses metabolisme terjadi karena teroksidasinya zat-zat makanan yang dikonversi menjadi senyawa pengikat energi (adenosin triphospat) dengan bantuan oksigen, dalam proses oksidasi tersebut terbentuk juga radikal bebas (ROS), yaitu anion superoksida dan hidroksil (Khaira, 2010). Penurunan kadar MDA organ kolon ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak daun sawo manila mengandung senyawa flavonoid dan tanin sebagai antibakteri dan antioksidan. Flavonoid akan berikatan dengan DNA bakteri sehingga menyebabkan kerusakan permeabilitas dinding sel, mikrosom
dan lisosom bakteri serta senyawa tanin diharapkan dapat menginaktivasi adhesin sel mikroba sehingga bakteri tidak dapat melakukan perlekatan pada epitel usus, mengganggu sintesa peptidoglikan sehingga pembentukan dinding sel menjadi
kurang sempurna, membentuk kompleks dengan protein sehingga menyebabkan denaturasi protein. Hal ini menyebabkan pertumbuhan bakteri menjadi terhambat dan menyebabkan kematian bakteri. Selain itu, tanin juga dapat menstimulasi sel-sel fagosit yang berperan dalam respon imun sel-seluler berupa MMP, grow factor . Mekanisme ini akan menstabilkan ROS dan menurunkan kadar Malondialdehyde (MDA) maka terjadi penurunan kerusakan jaringan kolon.
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat reaksi oksidasi atau zat yang mampu menetralkan radikal bebas (Widjaya, 2003). Antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan non enzimatik yang didapat dari luar tubuh seperti flavonoid dan antioksidan enzimatik yang didapat dalam tubuh. Produksi ROS dalam tubuh yang normal dapat diseimbangkan oleh enzim Superoksida Dismutase (SOD) (Droge, 2002). Pada kondisi gastroenteritis induksi E. coli dapat mengaktifkan makrofag yang akan menyebabkan pelepasan sitokin inflamasi dan Reactive Oxygen Species (ROS), meningkatkan radikal bebas di dalam kolon mengakibatkan antioksidan endogen tidak dapat menyeimbangkan radikal bebas yang jumlahnya berlebih sehingga radikal bebas tersebut dapat menyebabkan kerusakan jaringan. Maka diperlukan antioksidan eksogen yang berasal dari luar tubuh salah satunya kandungan flavonoid dan tanin dalam ekstrak etanol daun sawo.
5.2 Pengaruh Terapi Ekstrak Etanol Daun Sawo Manila Terhadap Perbaikan Gambaran Histopatologi Pada Kolon Tikus (
Rattus norvegicus
) Gastroenteritis Hasil InduksiE.coli
Dalam penelitian ini selain menggunakan parameter MDA juga menggunakan parameter histopatologi dengan pewarnaan Hemaktosilin Eosin (HE) yang berfungsi sebagai salah satu penentu keberhasilan suatu terapi. Histologi kolon tikus secara normal, yaitu kripta liberkuhn (kelenjar intestinal) lebih panjang dan lurus jika dibanding dengan usus halus dan mempunyai lebih banyak sel goblet dibandingkan dengan usus halus yang menghasilkan mukus,
mukus berperan dalam melindungi dinding kolon terhadap ekskoriasi dan melindungi dari aktivitas bakteri yang berlangsung dalam feses (Guyton, 2008). Epitel berbentuk kolumnar simplek, lamina propria terdiri dari jaringan ikat retikuler dan nodulus limfatikus, tunika muskularis mukosa terdiri dari lapisan sirkuler sebelah dalam dan lapisan longitudinal sebelah luar. Tunika mukosa terdiri atas jaringan ikat longgar, lemak, dan pleksus Meissner. Di sebelah luar tunia mukosa terdapat tunika muskularis eksterna dan tunika serosa. Tunika serosa ini terdiri atas mesotelium dan jaringan ikat subserosa. Secara teori histopatologi kolon yang mengalami inflamasi dapat dilihat adanya edema di lamina propia disertai infiltrasi sel-sel radang. Selain itu ruang antar kripta menjadi lebih lebar, adanya kerusakan pada lapisan mukosa, pembesaran pembuluh darah, hilangnya sel goblet, dan adanya ulcer (Geobes, 2003). Hasil pengamatan preparat Hemaktosilin Eosin (HE) kolon tikus pada masing-masing kelompok perlakuan.
Gambar 5.2 Histopatologi kolon kelompok kontrol negatif pewarnaan HE a) adalah lapisan mukosa pada kolon b) lumen pada kolon c) sel goblet d) kripta liberkuhn (perbesaran 100x dan 400x)
a
b
c
Gambar histopatologi kolon pada tikus kontrol negatif (P1) (Gambar 5.2) terlihat normal meliputi adanya mukosa yang terdiri dari kripta liberkuhn (kelenjar intestinal) yang terlihat panjang dan lurus serta sel goblet yang mendominasi. Sel goblet menghasilkan mukus, mukus berperan dalam melindungi dinding kolon terhadap ekskoriasi dan melindungi dari aktivitas bakteri yang berlangsung dalam feses (Guyton, 2008). Dapat diamati bahwa pada lapisan mukosa tidak terjadi kerusakan, tersusun rapi dan teratur. Histologi ini dijadikan patokan adanya perubahan dan kerusakan yang terjadi pada kelompok lainnya.
Gambar 5.3 Histopatologi kolon kelompok kontrol positif gastroenteritis f e e e d c b b a e f
pewarnaan HE a) merupakan erosi epitel pada mukosa b) merupakan edema c) sel radang (limfosit) d) makrofag e) karioreksis f) kariopiknosis (perbesaran 100x dan 400x)
(menjorok)Hasil histopatologi (Gambar 5.3) bold apa endak ? pada kelompok yang diinduksi E.coli terdapat kerusakan jaringan, sesuai dengan pendapat Gebeos (2003) bahwa pada inflamasi pada kolon ditandai dengan adanya kerusakan pada lapisan mukosa, berupa kerusakan mukosa, erosi epitel, adanya edema, banyaknya infiltrasi sel radang dan hilangnya sel goblet. Pada parameter aktivitas ROS bahwa pada kelompok induksi E.coli mengalami peningkatan aktivitas peroksidasi lipid kolon tikus yang dikarenakan induksi E.coli 106 CFU/ml. Parameter histopatologi ini digunakan sebagai pendukung hasil pengukuran ROS.
Kerusakan yang terjadi pada jaringan mukosa kolon tikus model gastroenteritis (Gambar 5.2) dikarenakan induksi E.coli. E. coli masuk dalam tubuh pada mukosa usus gastroenteritis sehingga terjadi peningkatan jumlah E. coli di dalam kolon. Bakteri ini menghasilkan endotoksin berupa Lipopolisakarida (LPS) dan dilepaskan saat bakteri mengalami lisis atau pecahnya sel, yang dapat memicu sel makrofag dan sel lainnya yang memiliki reseptor LPS sehingga terjadi reaksi peradangan (inflamasi).
Gambar 5.4 Histopatologi kolon kelompok perlakuan 1 terapi dosis 200 mg/kg pewarnaan HE a) adanya erosi epitel b) merupakan edema c)
merupakan sel radang (makrofag) (perbesaran 100x dan 400x) (keterangan gambar fontnya lbh kecil bukan sih beb? 11 leg gak salah)
b
a
c c
(menjorok (Gambaran histopatologi pada kelompok terapi 200 mg/kg BB pada pengamatan dengan perbesaran 400x terlihat adanya perbaikan. (titik) Perbaikan
tersebut ditandai dengan adanya sel goblet yang lebih banyak , tetapi masih terdapat adanya erosi epitel serta infiltrasi sel radang dan masih terdapat edema dengan permukaan yang luas titik ilang (Gambar 5.4) Menunjukkan bahwa kolon belum berada pada kondisi normal sehingga mengurangi fungsi optimal kolon
a
a
a c
Gambar 5.5 Histopatologi kolon kelompok (P4) terapi dosis 300mg/kg BB pewarnaan HE a) terdapat erosi epitel b) adanya edema c)
merupakan sel radang (limfosit) (perbesaran 100x dan 400x)
menjoorok Gambaran histopatologi pada kelompok (P4) terapi 300 mg/kg BB pada pengamatan perbesaran 400x terlihat adanya perbaikan yang ditandai
terdapat banyak sel goblet, adanya perbaikan erosi epitel, berkurangnya sel radang, tetapi edema masih terlihat jelas dan luas (Gambar 5.5) Menunjukkan bahwa kolon belum mendekati kondisi normal sehingga mengurangi fungsi
a b
Gambar 5.6 Histopatologi kolon kelompok (P5) terapi dosis 400 mg/BB HE a) perbaikan epitel b) edema tidak meluas
Gambaran histopatologi pada kelompok terapi 300 mg/kg BB pada pengamatan perbesaran 400x terlihat adanya perbaikan yang ditandai mulai perbaikan sel
goblet, susunan epitel yang teratur akan tetapi masih terdapat edema dengan luas permukaan yang kecil (Gambar 5.6). Tingkat perbaikan jaringan mukosa kolon
lebih baik pada terapi 400 mg/BB dibanding dengan terapi 200 mg/BB dan 300 mg/BB.
Sel-sel epitel mukosa kolon diketahui memiliki tingkat regenerasi yang cepat, yaitu sekitar 3 sampai 6 hari. Terapi dengan dosis 200 mg/Kg BB, 300 mg/Kg BB, 400 mg/Kg BB selama 8 hari (Modifikasi Islam dkk, 2012). Sel-sel pada mukosa kolon termasuk sel labil. Sel labil merupakan sel yang memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi, terjadi terus-menerus dan mempunyai fase G0 yang singkat (fase istirahat). Sel yang rusak merupakan stimulus untuk sel yang istirahat untuk memasuki fase mitosis sel, sehingga terjadi perbaikan kerusakan jaringan kolon (Pringgoutomo et al ., 2002).
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN