2. TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Ekstraksi Karotenoid
Ekstraksi karotenoid merupakan suatu proses untuk memperoleh karotenoid dari bahan yang diduga mengandung karotenoid, seperti kulit udang. Karotenoid dalam kulit udang merupakan senyawa kompleks yang berikatan secara nonkovalen dengan protein (Gimeno et al. 2007).
Babu et al. (2008) menyatakan ekstraksi karotenoid telah banyak dilakukan dengan berbagai metode, yaitu menggunakan pelarut kimia, minyak, superkritikal karbondioksida, bakteri, dan enzim. Ekstraksi karotenoid meggunakan pelarut kimia telah banyak dilakukan diantaranya menggunakan heksana, aseton, metanol, dan etanol. Ekstraksi karotenoid menggunakan pelarut kimia memang efektif akan tetapi memiliki beberapa kekurangan, yaitu proses pemisahan pelarut kimia dengan karotenoid sangat sulit sehingga dapat mendegradasi karotenoid dan hasil ekstraksinya tidak aman bagi kesehatan. Maoka dan Akimoto (2008) telah mengekstraksi karotenoid dari kulit udang menggunakan aseton menghasilkan rendemen sebesar 0,1 mg/g. Gimeno et al. (2007) menyatakan bahwa ekstraksi karotenoid menggunakan aseton lebih efektif dibandingkan dengan etanol.
Ekstraksi menggunakan pelarut minyak tidak dapat dijadikan sebagai suplemen kesehatan karena kandungan asam lemak tak jenuhnya sangat tinggi sehingga tidak baik untuk kesehatan (Lee et al. 1999). Shacindra et al. (2005) telah melakukan ekstraksi karotenoid menggunakan pelarut aseton pada berbagai bagian tubuh udang dan menghasilkan rendemen sebesar 10,4-17,4 ppm pada daging udang, 35,8-153,1 ppm pada kepala, dan 59,8-104,7 ppm pada kulit udang.
Ekstraksi karotenoid menggunakan superkritikal karbondioksida juga telah banyak dilakukan. Hasil ekstraksi menggunakan metode ini sangat kecil dan merusak struktur dari astaxanthin. Lopez et al. (2004) membandingkan bahwa ekstraksi karotenoid menggunakan superkritikal karbondioksida menghasilkan rendemen 71% lebih kecil dibandingkan dengan cara manual. Chakrabarti (2002) telah melakukan penelitian ekstraksi karotenoid menggunakan enzim protease dan rendemen yang dihasilkan sebesar 30 – 40 ppm. Penggunaan enzim protease berguna untuk memutus ikatan protein dengan karotenoid sehingga diperoleh karotenoid bebas. Penggunaan
13
enzim dalam ekstraksi karotenoid tidak menghasilkan residu yang berbahaya bagi tubuh dan lingkungan.
2.4 Enzim Protease
Enzim merupakan suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam proses aktivitas biologis. Enzim terdapat pada hewan, tumbuhan, maupun mikroba. Enzim berperan sebagai katalisator pada sel dan sifatnya sangat khas karena enzim hanya bekerja pada substrat tertentu dan dengan jenis reaksi tertentu (Lehninger 1995). Enzim memiliki efisiensi katalitik yang tinggi dimana sebuah molekul enzim dapat mengurai 10 ribu sampai 1 juta substrat per menit (Richardson 1976).
Kelebihan enzim sebagai katalisator dibandingkan dengan bahan-bahan kimia lainnya adalah memiliki sifat spesifitas yang tinggi, hanya mengkatalisis substrat tertentu, tidak terbentuk produk samping yang tidak diinginkan, mempunyai produktivitas yang tinggi sehingga dapat mengurangi biaya, produk akhir pada umumnya tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi dan mengurangi efek kerusakan terhadap lingkungan (Chaplin dan Burke 1990).
Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptide dalam peptide, polipeptida, dan protein dengan menggunakan reaksi hidrolisis menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana seperti peptide rantai pendek dan asam amino (Naiola & Widyastusti 2002). Aktivitas enzim ini membutuhkan air sehingga dikelompokkan dalam kelas hidrolase. Hidrolisis ikatan peptide adalah reaksi penambahan-penghilangan, dimana protease bertindak sebagai nukleofili membentuk intermediet tetrahedral dengan atom karbon karbonil pada ikatan peptide (Bauer et al.
1996). Protease berperan dalam sejumlah reaksi biokimia seluler yang diperlukan untuk degradasi protein nutrien, mekanisme patogenisitas, proses koagulasi darah, proses sporulasi, diferensiasi, sejumlah proses pasca translasi protein, dan mekanisme ekspresi protein ekstra seluler (Rao et al. 1998). Enzim protease dapat dibagi menjadi empat golongan sebagaimana disajikan pada Tabel 2.
14
Tabel 2 Pengelompokan enzim protease
Pengelompokan Jenis Enzim Keterangan Contoh
Golongan pertama Enzim
protease serin
Sisi aktifnya adalah residu serin
Tripsin, kimotripsin, elastase, subtilin
Golongan kedua Enzim protease sulfhidril
Sisi aktifnya adalah residu sulfhidril
Papain, fisin, bromelin
Golongan ketiga Enzim
protease metal Sisi aktifnya tergantung pada adanya hubungan metal Karboksipeptidase A
Golongan keempat Protease asam Pada sisi aktifnya terdapat dua gugus karbonil
Pepsin, renin
Sumber : Winarno (1986)
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain suhu dan pH. Suhu yang semakin tinggi dapat memprcepat terjadinya reaksi kimia dan juga mempercepat reaksi yang dikatalisis enzim, tetapi kenaikan suhu dapat mempengaruhi struktur enzim sehingga terjadi inaktivasi (Reed 1975). Semua enzim adalah protein, dan aktivitasnya tergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Penataan tertentu pada rantai samping asam amino suatu enzim di sisi aktifnya menentukan tipe molekul yang dapat terikat dan bereaksi di situ. Ada sekitar lima rantai samping dalam enzim. Banyak molekul-molekul nonprotein kecil yang terhubung pada sisi aktif enzim, molekul-molekul ini disebut kofaktor atau koenzim (Ngili 2009). Sumber enzim adalah organisme hidup seperti hewan, tanaman, dan mikroba. Enzim protease dibagi menjadi dua golongan yaitu golongan eksopeptidase dan golongan endopeptidase.
2.4.1 Papain
Papain merupakan salah satu enzim proteolitik yang paling banyak digunakan dalam industri. Aplikasinya cukup luas, mulai dari bahan pelunak daging hingga berbagai industri pangan, minuman, farmasi, detergen, kulit, wool, kosmetika, dan
15
industri biologi lainnya (Winarno 1986). Papain stabil terhadap suhu tinggi pada pH mendekati netral. Pada pH asam (kurang dari 4) papain akan cepat menjadi inaktif pada suhu tinggi. Pada pH yang sangat asam (kurang dari 2) inaktivasi sangat cepat terjadi walaupun pada suhu 25OC. Papain mempunyai pH optimum 7,2 pada substrat Benzoil Arginil Etil Ester (BAEE), pH 6,5 pada substrat kasein, pH 7,0 pada albumin, dan pH 5,0 pada gelatin (Muchtadi et al. 1992).
Berat molekul papain adalah 20.500 kDa, di bawah mikroskop bentuk kristal papain dari getah kering buah papaya berupa jarum tetapi setelah disimpan beberapa bulan pada suhu rendah akan berubah hexagonal pipih memanjang. Perubahan bentuk kristal ini tidak merubah aktivitasnya (Arief 1975). Enzim ini tergolong protease sulfhidril. Papain mempunyai keaktifan sintetik. Disamping keaktifan untuk memecah protein, papain mempunyai kemampuan membentuk protein baru atau senyawa yang menyerupai protein yang disebut plastein dari hasil hidrolisis protein (Winarno 1986). Kemurnian aktivitas enzim papain ditandai dengan daya aktivitas proteolitik yang tinggi dan kelarutan dalam air yang tinggi juga. Daya proteolitik enzim papain sangat aktif pada suasana reduktif sehingga dengan penambahan bahan-bahan pereduksi akan menambah aktivitas yang besar terhadap sisi aktif sehingga enzim menjadi inaktif. Penambahan garam NaCl dan KCl konsentrasi rendah akan menambah aktivitas enzim, tetapi konsentrasi lebih dari 2% akan merusak enzim papain (Arief 1975).
Kemampuan papain dalam menghidrolisis sebagian besar substrat protein lebih ekstensif dibandingkan dengan protease lainnya, seperti tripsin dan pepsin (Leung 1996). Aktivitas katalisis papain dilakukan melalui hidrolisis yang berlangsung pada sisi aktif papain. Mekanisme pengikatan enzim terhadap substrat tersusun atas dua tahap yaitu, tahap pertama reaksi asilasi dengan bentuk intermediet acyl-enzim dan tahap kedua merupakan deasilasi yang menghidrolisis hasil intermediet (Wong 1989). Komposisi asam amino penyusun papain dapat dilihat pada Tabel 3.
16
Tabel 3 Komposisi asam amino penyusun papain
Asam Amino Jumlah (Unit) Asam Amino Jumlah (Unit)
Lisin 10 Glisin 28
Histidin 2 Alanin 14
Arginin 12 Valin 18
Asam Aspartat 6 Isoleisin 12
Aspargin 13 Leusin 11
Asam Glutamat 8 Tirosin 19
Glutamin 12 Fenilalanin 4
Treonin 8 Triptofan 5
Serin 13 Sistein 1
Sumber: Arief (1975)
Semua jenis asam amino ikut menyusun struktur papain kecuali metionin. Aktivitas papain ditentukan oleh 2 gugus sulfhidril bebas dari 6 gugus sulfhidril yang dimiliki. Protease sulfhidril ini mengandung unsur sulfur sekitar 1,2% (Glazer dan Smith 1971).
Logam berat seperti Cd2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+, dan Pb2+ bersifat menghambat papain. Papain dapat diaktifkan kembali dengan penambahan sistein serta Etilen Diamin Tetra Asetat (EDTA) dengan cara mengikat logam yang telah terikat pada sisi aktif logam. Aktivitas papain dipengaruhi oleh gugus aktif –SH bebas, maka pelarut tiol juga bertindak sebagai penghambat papain. Iodoasetat atau iodoasetamida bereaksi dengan gugus sulfhidril bebas dari papain menyebabkan inaktivasi irreversibel begitu juga dengan pereaksi aldehida (Liener 1974).
2.4.2 Pepsin
Pepsin adalah kelompok enzim protease asam. Enzim pepsin memiliki penamaan EC 3.4.4.1 dan mempunyai gugus aktif karbonil. Pepsin merupakan enzim hidrolase yang mengkatalisis reaksi hidrolisis suatu substrat dengan pertolongan molekul air (Winarno 1986). Pepsin dapat memecah protein menjadi fragmen yang lebih kecil. Pepsin adalah enzim pencernaan yang dibentuk di dalam mukosa lapis lambung berbentuk pepsinogen. Keasaman isi lambung yang tinggi
akan membantu perubahan pepsinogen menjadi pepsin secara autokatalitik (De Man 1997). Pepsin merupakan enzim endopeptidase yang memecah protein dari
17
dalam enzim ini suka memecah ikatan peptida yang terdapat diantara gugus aromatik dari asam amino. Enzim ini akan menghirolisis ikatan peptida antara asam amino seperti –Leu-Val-, -Glu-Ala-, -Ala-Leu- (Bergmeyer 1983).
Pepsin sangat aktif pada pH rendah (pH1,0). Pada pH di bawah 5, pepsinogen terpecah dan terbentuklah pepsin yang aktif. Berat molekul pepsin adalah 33.000 kDa mempunyai 321 residu asam amino, sangat stabil pada pH 5-5,3, dan aktif pada pH 1-4 dengan keaktifan optimum pada pH 1,8 (Winarno 1986).
Enzim pepsin mempunyai daya katalitik yang lebih tinggi pada keasaman yang tinggi sehingga menguntungkan karena dapat mencegah kontaminasi bakteri dan pembusukan. Indonesia mempunyai potensi yang besar sebagai penghasil enzim pepsin, karena enzim pepsin dapat diperoleh dari lambung hewan ruminansia, seperti sapi, kambing, dan domba dimana populasi hewan ternak tersebut sangat tinggi (Mahdi dan Aulannia`am 2001)