3.3 Metode Penelitian
3.3.3 Ekstraksi komponen antioksidan
Ekstraksi komponen antioksidan dilakukan dengan menghasilkan ekstrak kasar terlebih dahulu. Komponen antioksidan diperoleh melalui ekstraksi bertingkat dengan menggunakan tiga jenis pelarut. Pelarut yang digunakan yaitu pelarut non polar (kloroform), semi polar (etil asetat), dan polar (metanol).
Sampel kering (daging dan jeroan) yang telah dihancurkan masing-masing sebanyak 25 gram, dimaserasi dengan menggunakan pelarut kloroform terlebih dahulu sebanyak 100 ml selama 3x24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan disaring dengan menggunakan kertas saring whatman 42 sehingga dihasilkan residu dan filtratnya. Residu yang dihasilkan akan dimaserasi selama 3x24 jam dengan menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 100 ml, kemudian disaring kembali dengan menggunakan kertas saring whatman 42 yang dihasilkan residu dan filtratnya. Residu dari ekstrak etil asetat ini akan dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 100 ml selama 3x24 jam. Hasil larutan maserasi tersebut akan disaring kembali dengan menggunakan kertas saring whatman 42 sehingga dihasilkan residu dan filtratnya.
Filtrat dari ekstraksi kloroform, etil asetat dan metanol akan dievaporasi sehingga pelarut terpisah dengan ekstraknya. Proses evaporasi menggunakan vakum evaporator pada suhu 40 °C sehingga dihasilkan ekstrak kasarnya. Ekstrak kasar ini kemudian akan dimasukkan ke dalam botol ekstrak yang akan digunakan untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Bois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) dan uji fitokimia secara kualitatif (Harborne 1987). Proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4.
Masing-masing 2 kali ulangan
Gambar 4 Tahapan proses ekstraksi daing dan jeroan keong pepaya Sumber: Quinn (1988) diacu dalam Darusman et al. (1995)
yang dimodifikasi Sampel kering
Daging 25 gram
Maserasi dengan kloroform selama 3x24 jam
Penyaringan
Residu
Maserasi dengan etil asetat selama 3x24 jam
Penyaringan Evaporasi Ekstrak kloroform Maserasi dengan metanol selama 3x24 jam Residu Penyaringan Residu Filtrat Filtrat Evaporasi Ekstrak etil asetat Filtrat Evaporasi Ekstrak metanol Jeroan 25 gram
a. Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005)
Ekstrak kasar keong pepaya yang diperoleh dari ektraksi bertingkat dengan kloroform, etil asetat, metanol akan dilarutkan dengan pelarut metanol p.a dengan konsentrasi 200, 400, 600, 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Sebanyak 4,5 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 0,5 ml larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm, aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding BHT dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) dan persen inhibisinya diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%) dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%.
b. Uji fitokimia (Harborne 1987)
Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar keong keong pepaya masing-masing pelarut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, molisch, benedict, biuret, dan ninhidrin. Metode uji ini berdasarkan Harborne (1987).
a) Uji Alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, terbentuk endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan terbentuk endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff.
b) Uji Steroid/triterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhrida asetat ditambahkan sebanyak 10 tetes kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 3 tetes ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif mengandung steroid dan triterpenoid yaitu dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c) Uji Flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
d) Uji Saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
e) Uji Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)
Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Hasil uji positif sampel mengandung Fenol hidrokuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru.
f) Uji Molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya
karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
g) Uji Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.
h) Uji Biuret
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi Biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida dengan terbentuknya larutan berwarna ungu.
i) Uji Ninhidrin
Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino ditunjukkan warna biru.