BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
E. Ekstraksi
dilarutkan dengan etil asetat (1:1). Dibuat perbandingan sama juga bertujuan untuk mengurangi resiko perpindahan solute karena adanya perbedaan jumlah pelarut. Jika zat padat ditambahkan ke dalam campuran dari dua cairan tidak bercampur, zat itu akan mendistribusi diri menjadi dua fase sehingga keduanya menjadi jenuh(Martin, Swarbick, dan Cammarata, 1990). Ekstrak air kemudian diekstraksi sebanyak tiga kali. Ekstraksi berulang-ulang ini bertujuan memaksimalkan perpindahan zat sesuai kepolarannya. Karena untuk mendapatkan hasil yang efisien jumlah pengulangan harus besar (Martin, Swarbick, dan Cammarata, 1990).
Fraksi etilasetat kemudian diuapkan dengan menggunakan vaccum
rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak yang pekat. Digunakan vaccum rotary evaporator bertujuan untuk meminimalkan kerusakan senyawa fenolik
karena pemanasan. Sisa fraksi etil asetat kemudian dipanaskan dengan waterbath untuk menguapkan sisa pelarut sehingga didapatkan ekstrak kental. Sebelumnya cawan ditimbang untuk mendapatkan bobot fraksi etil asetat. Fraksi kental etil asetat kemudian ditaruh dalam cawan petri yang dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium foil supaya tidak terpapar udara dan sinar UV yang mungkin terpejankan dan dapat mendegradasi senyawa fenolik yang terkandung. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukkan didalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,73 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,81%.
Gambar 4. Pemakaian alat (A=Corong pisah, B= Integrasi vaccum dan corong
Buchner, C= vaccum rotary evaporator)
D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Tujuan dilakukan uji pendahuluan ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif aktivitas antioksidan dari fraksi air ekstrak etanolik daun benalu (Dendrophthoe pentandra (L). Miq.). Uji ini menggunakan reaksi antara senyawa uji dan DPPH. Prinsip dari metode DPPH dalam mengetahui aktivitas antioksidan adalah didasarkan dari reaksi reduksi dari DPPH. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan dan berwarna violet dalam metanol. Radikal bebas tersebut merusak rantai yang bertanggung jawab sebagai warna tersebut menjadi warna kuning ketika radikal bereaksi dengan antioksidan (Badarinath et al., 2010). Pengujian fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu ini menunjukan warna kuning saat direaksikan dengan DPPH yang menanjukan bahawa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu positif memiliki aktivitas antioksidan. Aktifitas dibuktikan dengan dibandingkan dengan kontrol positif yang digunakan adalah kuersetin.
C
B
Gambar 5. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif [blanko],B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu]+DPPH, C
=kontrol positif [kuersetin]
2. Uji pendahuluan fenolik
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu. Prinsip uji ini adalah reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan suatu produk yang berwarna biru disekitar panjang gelombang 745-750 nm (Huanget al., 2005).
Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan ion fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat, juga semakin pekatnya warna biru yang terbentuk juga menandakan semakin banyak kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi (Singleton and Rossi, 1985).
Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu berwarna biru setelah direaksikan dengan Folin–Ciocalteu dan natrium karbonat, berbeda dengan kontrol negatif tanpa larutan uji yang berwarna bening dan memiliki warna yang mirip dengan kontrol positif yaitu asam galat.
A
Gambar 6. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu]+Folin Ciocalteu dan Na2CO3, C
=kontrol positif [asam galat])
E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum DPPH atau absorbsi maksimum untuk mendapatkan hasil lineritas dari pengukuran kurva baku. DPPH merupakan senyawa yang memiliki warna violet dengan panjang gelombang maksimum teoritis 517 nm. Namun dalam prakteknya, panjang gelombang yang dihasilkan tidak memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang teoritis, hal ini tergantung dari instrumen pengukuran yang digunakan. Warna yang ditimbulkan ini muncul karena DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Menurut Fessenden (1986) kromofor adalah struktur parsial yang berperan dalam warna (gugus tak jenuh yang dapat menjalani transisi π→π* dan n→π* dan auksokrom adalah gugus yang tidak dapat menjalani transisi π→π* tetapi dapat menjalani transisi elektron n).
A
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah yaitu 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Hal ini bertujuan agar dapat mempresentasikan panjang gelombang maksimum untuk kurva baku dari setiap konsentrasi. Absorbansi sampel dihitung dengan auto zero menggunakan pelarut yang digunakan yaitu metanol. Hal ini dilakukan supaya tidak adanya gangguan serapan dari metanol atau kontaminan yang mungkin tercemar dalam metanol. Rata-rata panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 515,5 nm. Seperti yang telah digunakan 515,5nm (Rollando, 2012), 515 nm (Bondet, et al., 1997).
Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi Konsentrasi larutan DPPH λ maksimum hasil scanning λ maksimum rata-rata λ maksimum teoritis 0,02 mM 515.5 515.5 517 0,04 mM 515.5 0,08 mM 515.5
2. Penentuan Operating Time
Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan waktu optimum dimana reaksi antara baku pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak etanol) terhadap reagen (DPPH) yang diberikan. Penentuan Operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Estimasi waktu yang dilihat adalah dalam waktu satu jam dengan selang waktu lima menit. Waktu dihitung setelah reagen dicampurkan dan absorbansi pertama dihitung setelah lima menit pertama.
Panjang gelombang maksimum yang dipakai adalah panjang gelombang yang telah didapatkan dalam penetapan λ maksimal yaitu 515,5 nm.
Gambar 7. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)
Gambar 8. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat (Replikasi 2)
Dari hasil yang diperoleh baik kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki OT yang sama yaitu 30 menit. Penyimpulan waktu operating time 30 menit dikarenakan pada waktu ini reaksi mulai stabil atau bereaksi sempurna. Hal ini
diyakinkan dengan selisih waktu yang semakin kecil. Nilai OT 30 menit merupakan waktu yang sering dipergunakan dalam mereaksikan DPPH (Molyneux, 2004).