Tujuan penelitian III : Membuat sediaan padat berupa kultur kering probiotik yang berisi L. salivarius sehingga mudah diaplikasikan ke pakan ternak.
Pengukuran kinetika pertumbuhan L. salivarius sebagai probiotik
Bakteri ditumbuhkan di medium MRS cair secara anaerob dengan mengalirkan campuran gas CO2 dan N2O selama 5 menit. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam dengan diamati OD nya pada 600 nm tiap 3 jam, menggunakann UV-VIS spektrofotometer, UV mini 1240, Shimadzu. Untuk mendapatkan laju pertumbuhan spesifik (µ) dihitung dengan menggunakan rumus:
µ = Ln (N2/N1) / (t2-t1),
dimana N1= Jumlah sel sebelum dikulturkan, N2= jumlah sel setelah waktu t, t1= waktu sebelum dikulturkan, t2 = waktu setelah dikulturkan.
Inokulasi isolat probiotik pada media MRS cair dan penggandaan skala (scale up)
Metode pengawetan kering beku (freeze-drying) dilakukan terhadap isolat BAL terpilih dilakukan menurut Jalali et al. (2012). Isolat BAL disubkultur dua kali dalam MRS cair tiap 24 jam. Kemudian, 100 ml dari kultur BAL diinokulasikan ke dalam 2 L MRS cair steril dan diinkubasi pada 37oC selama 24 jam. Setelah inkubasi, untuk mengetahui populasi BAL sebelum proses freeze-drying dihitung dengan cara metode hitungan cawan pada media MRSA.
Inokulasi pellet bakteri pada susu skim
Sebanyak 200 mL kultur dimasukkan dalam tabung sentrifugasi 250 mL steril dan sel dalam kultur dipanen dengan sentrifugasi pada 7 500 x g selama 10 menit, suhu 4oC dengan menggunakan Kubota Highspeed Refrigerated Centrifuge
27
dalam larutan susu skim 5 % sebagai media cryoprotective. Suspensi dipindahkan ke dalam tabung erlenmeyer dan dibekukan pada - 20oC.
Proses freeze-dry isolat L. salivarius sebagai probiotik
Tabung erlenmeyer yang berisi media beku dari suspensi bakteri dalam susu skim dipasangkan di freeze-dryer (Eyela, type FDU-1200, Tokyo, Japan) untuk diambil airnya/desikasi dari freeze-dryer dengan kondisi suhu -47.8oC di bawah vakum 1.12 pa selama minimal 12 jam dan bubuk kering beku ditempatkan ke dalam kemasan plastik tahan panas steril dan diklem dengan zipper hot. Viabilitas sel setelah freeze-drying ditentukan dengan metode hitungan cawan pada media padat MRS.
Tahap IV. Efikasi L. salivarius sebagai Probiotik dalam Pakan terhadap Penampilan dan Kesehatan Ayam serta Komunitas Mikrobiota Ras Pedaging/ Broiler
Tujuan penelitian pada tahap IV adalah untuk mengetahui penampilan dan kesehatan ayam pedaging, komunitas mikroba yang diberi perlakuan pakan dengan penambahan probiotik.
Ternak
Dalam penelitian ini digunakan sebanyak 200 ekor Day Old Chick (DOC) galur Cobb dari Charoen Phokphan (CP 707) dengan rata-rata bobot DOC 42.8±0.21 g, dan memilih hanya jantan saja (sexing) supaya diharapkan tidak terjadi banyak variasi data yang timbul.
Kondisi kandang
Kandang terlebih dahulu dibersihkan dan didesinfeksi untuk menjaga kebersihan dan sanitasi terhadap bakteri patogen. Kandang peliharaan yang digunakan adalah 20 kandang koloni ukuran 1x1x1 meter dengan alas litter menggunakan sekam padi. Masing-masing unit terdiri atas 10 ekor ayam. Setiap unit kandang dilengkapi lampu pemanasan/penerangan 40 watt, tempat pakan, tempat minum. Pada minggu pertama sekam ditutup dengan kertas koran, tempat ransum menggunakan nampan (feeder tray). Ruangan kandang dilengkapi dengan 1 kipas angin besar untuk menjaga kondisi temperatur kandang dan mengusir gas-gas beracun seperti amonia
Pakan ayam
Bahan yang digunakan dalam formulasi pakan adalah tepung jagung kuning, bungkil kedelai, dedak padi halus, tepung ikan (Tabel 1) dan komposisi nutrisinya (Tabel 2). Pakan diberikan berdasarkan kebutuhan ransum ayam
pedaging pada fase starter (3 minggu) dan fase finisher (2 minggu) sesuai dengan Leeson & Summers (2008). Pakan diberikan secara ad libitum dalam bentuk
crumble.
Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 macam perlakuan dengan masing 5 ulangan, dan masing-masing ulangan terdiri atas 10 ayam :
R0 = pakan kontrol ( pakan basal, tanpa pemberian antibiotik dan probiotik) R1 = pakan dengan pemberian antibiotik (pakan basal + Bambermicin 0,1 %) R2 = pakan dengan pemberian probiotik kultur tunggal (pakan basal + 1 % kultur
kering L. salivarius CSP004)
R3 = pakan dengan pemberian probiotik kultur campuran (pakan basal + 1 % campuran kultur kering L. salivarius CCM011 , CSP004 dan CVM002).
Tabel 1 Susunan pakan perlakuan dalam penelitian pada ayam broiler selama pemeliharaan 5 minggu
Keterangan: 1) Kandungan per kg : Vitamin A 10.0 IU, Vitamin D3 3.3 IU, Vitamin E 30 IU, Riboflavin 6.0 g, Thiamin 4 g, Pyridoksin 3.3 g, Asam pantothenat 15.0g, Vitamin B12 0.015g, Niasin 50.0g, Vitamin K 2.0g, Asam folat 1.0 g, Biotin 0.2g, Mangan 70.0g, Seng 60.0g, Kuprum 8.0 g, Selenium 0.3g, Besi 70.0 g
Bahan Ransum
Pakan Basal Pakan Basal+antibiotik Pakan Basal Pakan Basal+antibiotik
(%) (%) (%) (%) Tepung Jagung 59.3 59.2 58.1 57.97 Dedak Padi 4.8 4.8 8.52 8.52 Minyak 2 2 3.7 3.7 Tepung Ikan 6 6 5 5 MBM 1 1 0 0 Bungkil Kedele 20 20 17.21 17.21 CGM 5 5 5 5 CACO3 1 1 1.5 1.5 DCP 0.1 0.1 0 0 Premik1) 0.5 0.5 0.5 0.5 Nacl 0.2 0.2 0.2 0.2 DL.Met 0.1 0.1 0.14 0.14 L.Lysin 0 0 0.13 0.13 Bamber misin 0 0.1 0 0.13 Jumlah 100 100 100 100
29
Tabel 2 Kandungan nutrisi ransum perlakuan
1)
Hasil analisis Laboratorium
Pelaksanaan penelitian in vivo pada ayam broiler selama 35 hari atau 5 minggu. Pemberian probiotik pada hari ke 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35 ( 3 hari pertama dan setelah penimbangan tiap minggunya) dengan jumlah probiotik L. salivarius dalam bubuk kering beku minimal 1.0 x 108 CFU/g dan diberikan 1% dari pakan. Pada perlakuan tanpa probiotik ditambahkan susu skim 5% pada pakannya. Air minum yang diberikan pada semua perlakuan diberi vitamin / vita stress (mengandung 11 vitamin dan 4 elektrolit, non-antibiotic). Berat badan dan pakan konsumsi ayam dicatat mingguan untuk menentukan kinerja ayam dan rasio konversi pakan (FCR). Kematian ayam / mortalitas dicatat setiap hari hingga 5 minggu perlakuan (Amer et al. 2012). Pada minggu ke 5 diambil sampel darahnya untuk ditentukan profil darah dan analisa kolesterol darahnya. Setelah beberapa sampel disembelih juga dilakukan pengambilan sampel untuk penentuan kolesterol dan lemak daging serta analisa organ dalam.
Peubah yang diukur
1. Bobot badan, diperoleh dari penimbangan bobot badan ayam tiap minggu dan dilakukan sampai minggu ke 5
2. Konsumsi pakan, diperoleh dari selisih pakan yang disediakan dengan sisa pakan, dihitung tiap minggu sampai akhir minggu ke 5
3. Konversi pakan, konversi pakan dihitung menggunakan rumus : Nutrisi
P. Basal P. Basal+antibiotik P. Basal P. Basal+antibiotik Pakan starter Pakan Finisher
Berat kering1) 87 88 88 88 -
-Protein kasar1) 19.98 21.2 19.13 21 22 18
Energi bruto (kkal/kg) 1) 4112 4210 4087 4120 -
-Lemak kasar (%) 4.95 4.95 6.64 6.64 - -Serat kasar (%) 2.87 2.87 3.16 3.16 - -Ca (%) 0.93 0.93 0.95 0.95 0.95 0.89 P tersedia (%) 0.46 0.46 0.41 0.41 0.45 0.38 Na (%) 0.16 0.16 0.15 0.15 0.22 0.20 Cl (%) 0.21 0.21 0.20 0.20 0.20 0.20 Metionin(%) 0.57 0.57 0.58 0.58 0.50 0.38 Metionin + sistin (%) 0.92 0.92 0.89 0.89 0.95 0.75 Lysin (%) 1.18 1.18 1.15 1.15 1.30 1.00 Asam linoleat 1.98 1.98 2.00 2.00 -
-Pakan Starter (1-3 minggu) Pakan Finisher (4-5 minggu)
Kandungan nutrisi Standar menurut Leeson & Summers, 2005
Konversi pakan = Rataan konsumsi pakan --- Rataan pertambahan bobot badan
4. Persentase bobot karkas, dihitung dengan menggunakan rumus Persentase karkas (%) = Bobot karkas
--- x 100% Bobot hidup pada akhir penelitian
5. Persentase Mortalitas, dihitung dengan rumus :
Mortalitas (%) = Jumlah ayam yang mati selama penelitian
---x100% Jumlah seluruh ayam pada awal penelitian
6. Profil darah, pengujian dilakukan di Laboratorium Fisiologi, departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fak. Kedokteran Hewan – IPB. Pengujian profil hematologi dilakukan dengan metode standard (Jain 1993). Sampel darah diperoleh sebelum pemberian pakan pada pagi hari, diambil dari pembuluh darah vena. Darah dimasukkan ke dalam tabung vakum berheparin. Sampel darah segera dimasukkan ke dalam termos es sebelum dianalisa. Packed cell volume (PCV) dihitung dengan metode
micro hematocrit, konsentrasi hemoglobin (Hb) dengan metode spektrofotometer, Sel darah merah/eritrosit/BDM dan sel darah putih/leukosit/ BDP dihitung dengan metode hematocytometer. Jumlah differensiasi leukosit ditentukan dengan pewarnaan Giemsa pada lapisan tipis dan sel-sel leukosit dihitung dan diklasifikasikan.
7. Analisis kolesterol darah, pengujian dilakukan di Laboratorium Nutrisi dan Ternak Daging dan Kerja, departemen INTP, Fakultas Peternakan, IPB.
8. Analisis kolesterol daging menurut metoda Liebermann-Burchard dilakukan di Laboratorium Terpadu, Depatemen INTP, Fakultas Peternakan, IPB.
9. Analisis lemak daging, pengujian dilakukan di Puslit Sumberdaya hayati dan Bioteknologi, Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat, IPB.
10.Analisis organ dalam. Sampel ayam diambil dan ditimbang, dipotong, ditimbang, dikeluarkan organ dalamnya dengan membelah bagian bawah perutnya. Ayam dibersihkan bulunya, ditimbang, kemudian dipotong kaki dan kepala untuk mengetahui bobot karkas, kemudian ditimbang bagian organ dalam satu per satu.
11.Analisis proksimat pakan dan feses dilakukan di Laboratorium Ilmu dan teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, IPB. Analisa proksimat meliputi bahan kering, energi bruto, dan protein kasar pakan dan feses perlakuan. 12.Total bakteri asam laktat (log CFU pada minggu ke 4 dan 5).
Sampel berupa isi sekum 0.1 g dibuat pengenceran serial dan dihitung total BAL dengan cara hitungan cawan pada media MRS agar+ 0.5% CaCO3,
31
inkubasi secara anaerob pada suhu 37oC selama 48 jam. Dihitung jumlah BAL yang tumbuh.
13.Total koliform (log CFU pada minggu ke 4 dan 5).
Sebanyak 0.1 g isi sekum dibuat pengenceran serial dan dihitung total coliform dengan cara hitungan cawan pada media Mac Conkey, inkubasi secara aerob pada suhu 37oC selama 24 jam. Dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
14.Analisis T-RFLP untuk deteksi probiotik (L. salivarius) pada minggu ke 5. Sebanyak 0.1 g isi sekum dicuci dengan 500 uL bufer PBS (phosphat buffer saline, pH 7.2 ) dengan sentrifugasi pada 13 000 x g selama 5 menit. Kemudian pellet yang dihasilkan diekstraksi DNA, di amplifikasi dan dipotong DNAnya dengan enzim restriksi HaeIII dan MspI dan analisa potongan DNA-nya dengan metode T-RFLP dengan menggunakan metode sebelumnya seperti pada tahap I dengan primer yang digunakan adalah primer forward 27F dilabel dengan 6-carboxyfluorescein (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') dan primer reverse spesifik untuk bakteri asam laktat SG-Lab-0677 (5'-CACCGCTACACATGGAG-3') yang tidak berlabel (Heilig et al. 2002).
15.Analisis T-RFLP untuk mengetahui komunitas bakteri secara umum pada sekum di minggu ke 5.
Preparasi seperti analisa komunitas BAL tetapi primer yang digunakan adalah primer forward dilabel dengan 27F 6-carboxyfluorescein (5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3') dan reverse primer 1492R (5'-GTTACGACTTCACCCTCCT-3') yang tidak berlabel.
16.Penentuan energi metabolis.
Metode yang digunakan yaitu metode modifikasi Farrel (1994). Kandang metabolis disiapkan dan berat awal ayam ditimbang, kemudian dipuasakan selama 24 jam tetapi tetap diberi air minum, kecuali yang untuk endogenous dipuasakan selama 2 x 24 jam. Timbang pakan kontrol dan perlakuan sebanyak konsumsi ayam untuk 4 hari. Setelah selesai puasa pakan diberikan sedikit demi sedikit setiap harinya sampai 4 hari, kemudian H2SO4 0.01% disemprotkan setiap 2 jam untuk mengikat N dalam feses. Feses diambil setiap hari selama 5 hari, dimasukkan dalam kantong plastik tahan panas dan ditimbang, kemudian disimpan ke freezer
sampai siap dikeringkan dalam oven suhu 50oC.
Pengukuran energi metabolisme terhadap pakan dilakukan berdasarkan teori Sibbald dan Wolynetz (1985), yaitu :
a. Energi metabolis semu (EMS) (kkal/kg) (EBxK)-(EBexE)
EMS = --- x 1000 K
(EBxK)- {(EBexE) + (8,22xRN)}
EMSn = --- x 1000 K
Keterangan:
EB = Energi bruto bahan makanan (Kkal/kg) EBe = Energi bruto ekskreta (Kkal/kg)
K = Konsumsi pakan (gram)
E = Berat ekskreta bahan uji (gram) RN = Retensi nitrogen (gram)
= (Konsumsi ransum x N ransum) – (berat ekskreta x N ekskreta)
8.22 = Nilai yang terkoreksi sebagai asam urat (kkal/g RN)
Analisis Statistik
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dan untuk melihat kecenderungan dari pengaruh masing-masing perlakuan dilakukan uji Duncan dengan menggunakan program statistik IBM SPSS 21.0.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian Tahap I : Analisis Keragaman BAL dari Saluran Pencernaan Ayam Cemani dengan Menggunakan Metode T-RFLP
Keanekaragaman hayati BAL dari beberapa relung (tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum) yang terdapat di saluran pencernaan ayam Cemani dianalisis dengan menggunakan profil potongan DNA / T-RF peak / filotipe. Untuk analisis komunitas mikroba dalam ekosistem yang kompleks, seperti isi saluran pencernaan, diperlukan kualitas dan kuantitas DNA yang memadai. DNA yang murni berasal dari lingkungan dalam penelitian ini digunakan sebagai
template dalam melakukan amplifikasi daerah-daerah/gen 16S rRNA, untuk menentukan populasi bakteri asam laktat dengan menggunakan primer forward
universal 27F yang dilabel dengan 6-carboxyfluorescein dan primer reverse
spesifik untuk BAL SG-Lab-0677.
Ekstraksi DNA dengan menggunakan kit khusus untuk sampel fekal diperoleh konsentrasi DNA berkisar antara 5.95 - 88.0 ng/µ L dengan kualitas DNA yang baik, dimana rasio A260/280 yang diperoleh berkisar antara 1.24 sampai 2.04 dengan rerata sebesar 1.76. Nilai ini mendekati nilai kualitas DNA yang ditetapkan sebesar 1.8 (Sambrook et al. 1998). Hasil penelitian ini juga menunjukkan amplifikasi gen 16S rRNA telah berhasil dilakukan dengan ukuran fragmen sekitar 650 bp (Gambar 2). Selanjutnya, dilakukan pemotongan DNA produk PCR dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII dan MspI untuk mendeteksi polimorfisme sekuen gen 16S rRNA. Enzim restriksi HaeIII dan MspI telah banyak digunakan untuk analisa T-RFLP dan bekerja dengan baik dengan hasil T-RF sesuai target (Dinoto et al. 2006; Kaplan et al. 2001 ).
Ukuran fragmen yang diperoleh berkisar 53-584 bp, karena standar internal yang digunakan dalam penelitian ini adalah GS 500 ROX, sehingga kemungkinan tidak seluruh kelompok bakteri asam laktat dapat diamati sepenuhnya. Namun, berdasarkan analisis Microbial Community Analysis
(MiCA3) secara online dari RDP (R10, U27) yang terdiri dari 1.519.356 database gen 16S rRNA dapat digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa seluruh T-RF yang diperoleh merupakan kelompok BAL (Tabel 3) dan tidak ada spesies non target
Gambar 2 Produk amplifikasi gen 16S rRNA dari saluran pencernaan ayam Cemani menggunakan primer 27F-FAM dan S-G-Lab 0677R: marker (M), tembolok (1), ventrikulus (2), ileum (3), dan sekum (4) Untuk prediksi spesies menggunakan MiCA3, tidak semua filotipe yang dipotong dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII atau MspI dapat diklasifikasikan ke takson bakteri tertentu. Beberapa filotipe BAL (41 %) tidak dapat diidentifikasi (unidentified) mengacu pada database yang tersedia di MiCA3. Misalnya filotipe 63 dan 163 bp yang ditemukan di semua komunitas saluran pencernaan yang diamati (Gambar 3), tetapi belum dapat diidentifikasi spesiesnya sesuai yang dikenal di database RDP – MiCA3. Database yang ada masih terbatas, yang hal ini merupakan keterbatasan analisa T-RFLP dalam mengungkap keragaman mikrobiota pada penelitian ini.
Selain itu, beberapa filotipe (17%) diidentifikasi sebagai bakteri yang belum dapat dikulturkan (unculturable). Dalam identifikasi filotipe, satu puncak T-RF kadang-kadang dapat ditentukan sebagai lebih dari satu spesies/ filotipe, seperti T-RF 244 bp bisa diidentifikasi sebagai L. amylovorus atau L. helveticus. Hal yang serupa juga terhadap T-RF 277 bp diketahui sebagai L. salivarius atau
L. delbrueckii. Spesies-spesies yang dihasilkan dari satu T-RF ini diharapkan mempunyai kekerabatan yang dekat dalam taksonomi. Dengan penggunaan beberapa enzim restriksi dapat memperjelas identifikasi T-RF dalam analisis fragmen bakteri pada saluran pencernaan.
Profil komunitas bakteri asam laktat saluran pencernaan ayam Cemani Perbedaan dalam komunitas bakteri dalam saluran pencernaan dapat diprediksi dengan membandingkan secara visual dari pola electropherogram
masing masing relung/komunitas (Gambar 3). Beberapa perubahan dalam komposisi komunitas BAL dapat diamati dalam penelitian ini. Persentase
35
kelimpahan relatif dari seluruh filotipe (Gambar 4) menunjukkan perbedaan dan dinamika populasi antara mikroba pada tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum. Filotipe dari 63 dan 163 bp selalu muncul dalam setiap relung. Di tembolok, filotipe 63 bp terdeteksi lebih tinggi kelimpahannya dibandingkan dengan relung lainnya, akan tetapi terjadi pengurangan kelimpahan filotipe relatif secara bertahap dari daerah atas (upper part) ke yang lebih rendah (lower part) dari saluran pencernaan ayam Cemani. Hal yang berbeda terjadi pada filotipe 163 bp yang lebih banyak ditemukan di sekum dibandingkan komunitas lainnya di saluran pencernaan.
Tabel 3 Identifikasi filotipe berdasarkan pada database MiCA3 secara online
Bakteri asam laktat T-RFs length (bp)
HaeIII MspI Lactobacillus L. salivarius 277 572 L. amylovorus 244 180 L. helveticus 244 180 L. crispatus 256 187 L. gasseri 322 189 L. rhamnosus 289 572 L. intermedius 323 NA* L. delbruckii 277 180 L. curvatus 331 NA L. acidophilus 244 180 L. lactis 331 572 L. brevis NA 572 L. casei NA 572 L. paracasei NA 572 L. pentosus NA 572 L. nantesis NA 572 L. rennanqify NA 572 Pediococcus P. pentosaceus NA 584 P. cellicola NA 584 Weissella Weissella cibaria 338 584 W. halotolerans NA 584 W. confusa 338 NA W. kandleri 338 NA W. minor 338 NA W. viridescens 338 NA
Gambar 3 Profil T-RF BAL dalam saluran pencernaan ayam Cemani yang teridentifikasi berdasar database MiCA3 dan isolat kandidat probiotik L. salivarius CSP004 yang diisolasi dari sekum salah satu ayam Cemani.
37
Di komunitas tembolok, filotipe 63 dan 244 bp ditemukan relatif tinggi dibandingkan dengan komunitas lain (Gambar 4). Filotipe ini mungkin bertanggung jawab terhadap pencernaan awal makanan memasuki saluran pencernaan. Filotipe 244 bp diidentifikasi sebagai Lactobacilus amylovorus atau
L. helveticus yang keberadaannya secara bertahap berkurang dari bagian atas ke bawah saluran pencernaan dan akhirnya tidak terdapat di bagian sekum. Hal ini kemungkinan berhubungan dengan faktor lingkungan di saluran pencernaan yang makin ke bawah makin berkurang ketersediaan oksigennya. L. amylovorus
dilaporkan sebagai bakteri fakultatif anaerob, memproduksi enzim amilolitik ekstraselular, awalnya ditemukan dari fermentasi limbah jagung (Nakamura 1981). L. helveticus diidentifikasi dalam T-RF yang sama merupakan bakteri spesifik dalam produk susu dan banyak digunakan sebagai probiotik (Traverniti dan Guglielmetti 2012 ) yang toleran terhadap kondisi mikroaerofilik.
Dalam penelitian ini, isolat Lactobacillus salivarius CSP004, kandidat probiotik yang diisolasi dari sekum salah satu ayam Cemani digunakan sebagai marker mewakili BAL yang berasal dari saluran pencernaan. Dari profil T-RF dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII L. salivarius teridentifikasi pada 277 bp dan dengan menggunakan enzim MspI terdapat pada 572 bp. Dari profil T-RF dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII, filotipe 277 bp terdeteksi dalam ventrikulus, ileum, dan sekum, tetapi tidak terdeteksi peak yang signifikan yang menunjukkan filotipe 277 bp di tembolok (Gambar 3).
Tidak terdeteksinya L. salivarius dalam tembolok ayam Cemani menunjukkan penelitian yang berbeda dari sebelumnya yang dilakukan Hilmi et al. (2007) dimana spesies ini tercatat melimpah dalam tembolok ayam broiler. Fenomena ini memperlihatkan eksistensi mikrobia yang dimodulasi inang. Penelitian dengan pyrosequencing menunjukkan bahwa nutrisi dan energi yang diperoleh dari pakan akan mempengaruhi populasi mikrobia dalam usus ayam (Stanley et al. 2013). Perbedaan dalam sistem peternakan intensif dan sistem umbaran mempengaruhi komunitas mikrobiota dalam saluran pencernaan ayam. Secara keseluruhan distribusi kelimpahan relatif semua isolat BAL tersaji dalam Gambar 4.
Gambar 4 Distribusi kelimpahan relatif masing-masing filotipe BAL yang terdapat pada setiap relung saluran pencernaan ayam Cemani.
Kelimpahan relatif filotipe BAL dalam saluran pencernaan ayam dapat dipelajari dari keberadaan filotipe BAL di sekum (Gambar 5). Sebagai contoh filotipe 63, 163 dan 277 bp terdeteksi dalam sekum dengan tren yang berbeda. Filotipe 92, 244 dan 334 bp dapat diamati pada tembolok, ventrikulus dan ileum, sedang di sekum tidak ditemukan. Selain itu juga terdeteksi filotipe spesifik dengan ukuran T-RF yang hanya ditemukan di satu komunitas saja (Gambar 4). Terdapat 4 filotipe (54, 78, 116, dan 256 bp) pada komunitas tembolok, satu filotipe (289 bp) pada ileum, dan tiga filotipe (158, 212, dan 290 bp) spesifik pada sekum. Namun demikian, filotipe spesifik dari setiap komunitas memiliki kelimpahan relatif yang rendah. Filotipe yang dominan terdeteksi di setiap komunitas di mana filotipe dominan dalam tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum masing-masing adalah filotipe 244, 163, 334 dan 163.
L. crispatus (256 bp) termasuk sebagai filotipe spesifik di tembolok dan tidak terdeteksi di komunitas lain. Kemungkinan spesies ini tidak melekat kuat di bagian bawah saluran pencernaan sehingga tercuci keluar dari saluran pencernaan. Hal ini sesuai dengan studi sebelumnya tentang kelimpahan L. crispatus dalam
39
tembolok yang menempel di non-secreting stratified squamous epithelium (Hilmi
et al. 2007 Edelman et al. 2002) dan jumlahnya melimpah di tembolok ayam (Ojala et al. 2010).
Dalam analisa T-RFLP hanya populasi yang dominan yang terdeteksi dengan metode berbasis PCR (Blackwood et al. 2007). Filotipe yang berhasil terdeteksi PCR dan dominan berdasar analisis T-RFLP analysis yaitu jika lebih dari 1% kelimpahannya. Oleh karena itu, spesies langka sangat sulit terdeteksi.
Gambar 5 Persentase kelimpahan relatif T-RF yang signifikan dari filotipe BAL dalam sekum ayam Cemani.
Analisis keragaman bakteri dalam saluran pencernaan ayam Cemani
Indeks keanekaragaman dapat digunakan untuk menyatakan hubungan kelimpahan filotipe dalam suatu komunitas. Dalam hal ini keragaman dilihat dari
jumlah filotipe, kelimpahan dan kemiripan komunitas dengan menggunakan data profil HaeIII dan MspI. Jumlah filotipe (S) BAL di ileum (9.5) lebih tinggi daripada di komunitas lain dan jumlah terendahnya adalah di sekum (6.5) (Gambar 6, Lampiran 1, 2). Jumlah filotipe yang terdeteksi akan berbeda dengan menggunakan enzim restriksi berbeda. Sebagian besar data yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah filotipe dalam suatu komunitas dengan enzim restriksi HaeIII menghasilkan lebih banyak jumlah filotipe dibandingkan dengan menggunakan MspI. Sebagai perbandingan, dalam komunitas tembolok, dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII ditemukan 10 filotipe, sedangkan dengan
MspI hanya 4 jumlah filotipe. Adanya perbedaan tersebut, maka dalam penelitian ini digunakan rata-rata data yang diperoleh dari dua enzim restriksi. Indeks keragaman Shannon-Wienner menunjukkan keragaman BAL antara empat relung di saluran pencernaan ayam Cemani. Indeks keragaman bervariasi dengan nilai tertinggi ditentukan di ileum (2.13), sedangkan yang terendah di sekum (1.08) (Gambar 6). Artinya komunitas BAL dalam ileum lebih beragam dari komunitas lainnya di saluran pencernaan ayam Cemani.
Gambar 6 Jumlah filotipe / spesies dan indeks keragaman Shannon-Wiener komunitas BAL pada saluran pencernaan ayam Cemani.
41
Indeks kesamaan pasangan (pairwise similarity) Sorensen adalah nilai yang menunjukkan adanya kesamaan filotipe di dua komunitas. Nilai 0 menunjukkan bahwa 2 komunitas benar-benar berbeda, sedang nilai 1 berarti bahwa 2 komunitas tersebut identik. Dalam studi ini, indeks kesamaan komunitas tertinggi (0.70) adalah antara komunitas ventrikulus dan ileum artinya kesamaan komposisi BAL tertinggi pada saluran gastrointestinal di ayam Cemani adalah antara komunitas ventrikulus dan ileum. Kesamaan yang tinggi ini membuktikan viabilitas BAL yang tinggi terhadap barrier di saluran pencernaan bagian atas, seperti adanya enzim dan lingkungan asam pada ventrikulus, serta garam empedu di usus dan kemampuannya menempel pada usus yang mempunyai gerakan peristaltik yang kuat, sehingga dapat bertahan di ileum.
Nilai indeks kesamaan komunitas yang terendah adalah antara komunitas ileum dan sekum (0.30) (Tabel 4). Penelitian yang sama dilakukan oleh Gong et al. (2002) dan Bjerrum et al. 2006 yang menggunakan analisis T-RFLP dan sekuen 16S rRNA pada ayam broiler dan melaporkan adanya perbedaan yang signifikan dalam populasi bakteri antara ileum dan sekum. Berdasarkan analisis gen 16S rRNA, lebih dari 70 % klon yang berasal dari ileum ayam berhubungan dengan lactobacilli dan spesies Enterococcus cecorum, sedangkan
Faecalibacterium prausnitzii, bakteri penghasil butirat unidentified dan
unculturable dan Clostridium merupakan kelompok bakteri yang dominan dalam sekum broiler yang diberi perlakuan pakan konvensional.
Tabel 4 Indeks kesamaan pasangan Sorensen (Cs) komunitas BAL dalam saluran pencernaan ayam Cemani
Enzim Tembolok-Ventrikulus Tembolok- Ileum Tembolok- Sekum Ventrikulus- Ileum Ventrikulus- Sekum Ileum-Sekum HaeIII 0.63 0.60 0.24 0.95 0.50 0.47 MspI 0.46 0.31 0.4 0.44 0.40 0.13 Rerata 0.55 0.45 0.32 0.74 0.45 0.30
Dalam sampel komposit 7 ayam Cemani, ditemukan ada 17 filotipe di semua komunitas. Akan tetapi secara individual ayam, ada perbedaan dalam