Bab 2. Tinjauan Pustaka
2.3 Evaluasi Mikrobiologis
2.3.1 Reverse Transcryptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Polymerase Chain Reaction atau PCR merupakan suatu metode in vitro untuk memperbanyak DNA secara enzimatik dengan menggunakan enzim DNA polymerase dan primer nukleotida yang melakukan hibridisasi bagian DNA dari dua arah yang berlawanan. Cara kerjanya sangat sederhana yaitu dengan mencampurkan DNA template (pencetak), enzim DNA polimerase, sepasang oligonukleotida (primer), bahan DNA (dNTP), dan menempatkan campuran tersebut pada tiga suhu tertentu secara berulang-ulang sehingga DNA pencetak akan memperbanyak diri secara spontan. Setiap satu kali siklus dilakukan tiga kali perubahan suhu agar terjadiproses denaturasi, annealing, extensi, sehingga DNA sasaran memperbanyak diri sebanyak dua kali lipat. Dengan demikian, perlakuan pada n buah siklus PCR akan menjadi 2n kali lipat banyaknya.57
Polymerase Chain Reaction merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatis melalui mekanisme perubahan suhu. Secara ringkas, prinsip PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 94-950C, DNA mengalami denaturasi (pembelahan unit ganda menjadi unit tunggal). Waktu yang diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 950C atau 15 detik pada suhu 970C. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu
lama dapat mempengaruhi enzim polimerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai seringkali dilakukan pre-denaturasi selama 3-5 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi.57
Apabila suhu diturunkan antara 36-720 C terjadi proses penempelan primer (annealing) yang merupakan penempelan primer pada DNA yang telah terbelah pada tempat yang spesifik. Primer sebaiknya berukuran 18-25 basa, mengandung 50-60% G + C, dan Tm (0C) terhitung untuk kedua primer sebaiknya sama. Formula penghitungan adalah, Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Semakin panjang primernya semakin tinggi temperatur annealing.57
Apabila suhu dinaikkan sampai 720 C, maka primer dengan bantuan enzim DNA polymerase akan membentuk untaian DNA sesuai dengan runutan DNA yang terbelah, proses ini disebut elongasi (extension). Kecepatan penyusunan nukleotida diperkirakan antara 35-100 nukleotida per detik, tergantung buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Umumnya setelah proses siklus PCR selesai, ditambah post elongasi selama 5-10 menit pada temperatur 720 C agar semua hasil PCR berbentuk untai ganda.57
Ketiga tahapan tersebut merupakan satu siklus termal. Jumlah fragmen DNA yang digandakan adalah 2n dimana n adalah banyaknya siklus termal. Rumus tersebut berasal dari penambahan jumlah keping (copy) DNA secara eksponensial, dimana keping DNA yang terbentuk menjadi cetakan bagi reaksi selanjutnya. Banyaknya siklus yang dilakukan tergantung pada banyaknya produk PCR yang diinginkan.57
Metode PCR ini sangat cocok untuk memperbanyak DNA untuk prosedur pemeriksaan klinis atau forensik, karena hanya diperlukan sampel DNA yang sangat sedikit sebagai bahan awal. Asam deoksiribonuklease dapat diperbanyak oleh reaksi berantai polimerase dari sehelai rambut atau setetes darah atau semen. Polymerize Chain Reaction adalah suatu molekul perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis penelitian. Asam deoksiribonuklease yang jumlahnya sangat sedikit juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas
pada kedokteran forensik, diagnosis genetika, hingga teknik ini banyak digunakan karena cukup spesifik, efisien, dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi.58
Istilah “reaksi berantai“ digunakan karena perpanjangan rantai DNA dilakukan dalam siklus yang berulang-ulang. Yang diperlukan pada reaksi PCR adalah suatu DNA sasaran yang akan diamplifikasi, sepasang oligonukleotida primer yang masing-masing komplementer dengan ujung 3‟ dari salah satu untai DNA sasaran, deoksinukleotida triposfat (d ATP, d CTP, d GTP, dan dTTP) dan suatu enzim DNA polimerase yang tahan terhadap pemanasan tinggi (dikenal sebagai tag polymerase). Tag polymerase berasal dari bakteri Thermus aquaticus, yang dapat tumbuh dalam sumber air panas bersuhu 100 o C atau lebih.58
Dalam polimerisasi DNA dengan teknik PCR, biasanya digunakan molekul DNA sebagai primer. Fungsi primer adalah menyediakan ujung 3‟- OH yang akan digunakan untuk menempelkan molekul DNA pertama dalam proses polimerisasi.58
Mula-mula harus dilakukan isolasi terhadap sampel DNA yang mengandung segmen yang akan diampllifikasi. Ditambahkan primer, keempat deoksiribonukleosida triposfat, dan DNA polimerase tahan panas dalam jumlah besar kedalam larutan dimana DNA dipanaskan untuk memisahkan untai-untai. Primer adalah dua oligonukleotida sintetik. Setiap oligonukleotida bersifat komplementer terhadap urutan yang pendek pada satu untai DNA untuk diamplifikasi. Sewaktu larutan mendingin, oligonukleotida membentuk pasangan basa dengan DNA dan berfungsi sebagai primer untuk sintesis untai DNA yang dikatalisis oleh DNA polimerase tahan panas. Keempat deoksiribonukleosida triposfat berfungsi sebagai prekursor untuk sintesis untai DNA baru. Proses pemanasan, pendinginan, dan sintesis DNA baru diulang berkali-kali sampai diperoleh salinan DNA dalam jumlah besar. Proses dapat diautomasikan sehingga setiap putaran replikasi hanya memerlukan waktu beberapa menit. Dalam 20 daur pemanasan dan pendinginan, DNA mengalami amplifikasi lebih dari sejuta kali Real-Time PCR dapat mendeteksi produk amplifikasi pada tiap siklus pada proses penggandaan DNA. Pada sistem Real-Time PCR ini terdapat enzim DNA polimerase yang memiliki aktivitas pada DNA yang memiliki fungsi exonuclease pada rantai DNA 5‟ menuju 3‟. Polimerase DNA ini dapat menguraikan molekul
probs yang terikat pada untaian tunggal DNA sehingga dapat digunakan untuk deteksi amplikon pada target DNA yang spesifik. Molekul probs ini mengikat oligonukleotida dan akan mengikat sekuen DNA target. Probs ini terikat pada ujung 5‟P dan pada ujung 3‟.58
Molekul probs ini memiliki bagian reporter dye pada ujung 5‟ yang dapat mengeluarkan floresensi sedangkan pada ujung 3‟ terdapat quencher yang dapat meredam floresensi pada reporter dye. Sehingga sebelum reaksi emisi dari reporter dye tidak dapat terbaca pada detektor.58
Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada Real-Time sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probs yang dapat diukur pada tiap siklus reaksinya. Pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses elektroforesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut.59