BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
D. Kultur jaringan
4. Faktor penentu kultur jaringan
Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan. Berhasil tidaknya pengkulturan eksplan tergantung pada faktor yang dimiliki oleh eksplan itu sendiri. Faktor-faktor itu meliputi:
a.Ukuran eksplan
Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian tanaman yang dikerat masih mengandung suplai makanan serta hormon untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Ukuran eksplan yang paling baik adalah 0,5 sampai 1,0 cm, namun ukuran ini dapat bervariasi, tergantung pada material tanaman yang dipakai serta jenis tanaman ( Katuuk, 1989).
b.Umur eksplan
Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis. Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada bagian meristematik. Dari semua jenis tanaman bagian inilah yang paling banyak berhasil. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan
juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk beregenerasi tetap ada, sedangkan sel-sel tua, kesanggupan untuk beregenarasi sudah berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik
yang berkurang, jaringan yang sudah tua ada kemungkinan sudah mengandung banyak patogen ( Katuuk, 1989 ).
c.Sumber eksplan
Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman yang sehat, yang bertumbuh baik / normal. Pengaruh perubahan suhu, cahaya, musim serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk berkecukupan zat hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon tumbuh. Pendek kata pertumbuhannya harus optimum ( Katuuk, 1989 ). d.Genotip eksplan.
Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro
(Katuuk, 1989 ). 4.2 Media
Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman
yang dikulturkan (Yusnita, 2003). Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Gamborg. Komposisi media Gamborg mirip dengan media MS. Perbedaannya, jumlah nitrogen dalam bentuk ion ammonium yang terdapat dalam media Gamborg jauh lebih sedikit dibanding yang terdapat dalam media MS (Santoso dan Nursandi, 2002).
Nitrogen pada umumnya tersedia dalam bentuk campuran ion nitrat (dari KNO3) dan ion ammonium (dari NH4NO3). Secara teoritis, ada keuntungan dalam penyediaan nitrogen dalam bentuk ion ammonium, nitrogen harus dalam bentuk tereduksi supaya dapat menyerap ke dalam makromolekul. Oleh karena itu, ion nitrat juga harus direduksi terlebih dahulu. Perlu diketahui, pada konsentrasi tinggi, ion ammonium dapat menyebabkan toksik pada kultur sel tanaman dan adanya ion ammonium dari dalam media menyebabkan asidifikasi pada medium. Konsentrasi tinggi ion ammonium juga dapat menyebabkan masalah pada kultur dengan meningkatkan frekuensi vitrifikasi (kultur menjadi pucat dan mudah hancur dan biasanya tidak layak untuk kultur lebih lanjut). Penggunaan campuran ion ammonium dan ion nitrat mempunyai keuntungan yaitu proses buffer yang tidak perlu terlalu kuat karena adanya ion nitrat menyebabkan ion OH- dilepaskan (Ramage dan Williams, 2002).
Komponen media kultur yang digunakan dalam kultur jaringan adalah sebagai berikut :
a. Air
Air memegang peranan penting dalam proses kultur jaringan karena 95% dari media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan dalam media serta dalam seluruh
proses kultur jaringan adalah air suling. Hal ini karena di dalam air ledeng atau air sumur terlarut sejumlah kontaminan yang dapat merusak proses perkembangan kultur eksplan. Kontaminan yang dimaksud adalah substansi atau mikroorganisme yang mengganggu kultur. Air suling disimpan dalam kondisi steril dengan tidak memberi peluang pada bakteri untuk hidup dan berkembang (Katuuk, 1991). b. Garam anorganik
Unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar yang disebut unsur makro, sedangkan unsur yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit disebut unsur mikro. Beberapa jenis unsur yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N), fosfor (P), dan kalium (K) adalah unsur yang mutlak dibutuhkan oleh tanaman, yang berarti harus selalu tersedia. Unsur sulfur (S), kalsium (Ca), dan magnesium (Mg) boleh ada serta boleh tidak ada, tetapi karena fungsinya sangat mendukung pertumbuhan jaringan maka akan lebih baik apabila unsur-unsur tersebut juga selalu disediakan (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Unsur mikro dalam media dapat menyebabkan kelainan pertumbuhan. Unsur mikro yang dibutuhkan dalam tanaman yaitu: unsur besi (Fe), unsur boron (B), unsur seng (Zn), unsur kobalt (Co), unsur tembaga (Cu), unsur molybdenum (Mo), dan unsur yodium (I) (George dan Sherrington, 1984).
c. Sumber karbon dan energi
Media kultur jaringan memerlukan bahan sebagai sumber tenaga. Biasanya yang merupakan sumber tenaga adalah bahan kimia organik yang mengandung karbon. Karbohidrat adalah kimia karbon yang meliputi gula, pati, dan selulosa. Karbohidrat memiliki 2 fungsi utama yaitu sebagai sumber energi untuk jaringan
dan untuk menjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial minimum dalam media. Ada banyak jenis karbohidrat yang dipakai dalam kultur jaringan namun yang paling banyak digunakan adalah sukrosa atau D-glukosa ( Katuuk, 1989). d. Myo-inositol, vitamin, dan asam amino
Penambahan myo-inositol pada media bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myo-inositol diberikan bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus ( Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan antara lain adalah Tiamin (vitamin B1), Piridoksin (vitamin B6), dan asam nikotinat. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat. Asam nikotinat juga penting dalam reaksi-reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Sedangkan fungsi dari vitamin B6 adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia dalam proses metabolisme (Katuuk, 1989).
Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-beda. Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena dapat
menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-asam amino baru dalam jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
e. Hormon dan zat pengatur tumbuh
Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur jaringan adalah mutlak karena budidaya kultur jaringan adalah budidaya terkendali. Proses tumbuh dan berkembangnya eksplan dapat disesuaikan dengan harapan, menjadi kalus saja, organogenesis ataupun embriogenesis. Pengaturan ini dapat dilakukan dengan mengatur macam dan konsentrasi zat pengatur tumbuh sehingga menghasilkan kombinasi yang tepat sesuai dengan harapan. Macam hormon dan zat pengatur tumbuh yang sudah dikenal hingga saat ini adalah sebagai berikut :
1. Auksin
Auksin pertama kali ditemukan oleh Went, dan diketahui sebagai asam indolasetat (IAA). Selanjutnya, nama auksin digunakan untuk nama kelompok hormon dan zat pengatur tumbuh yang menimbulkan respons khas IAA. Tumbuhan mengandung tiga senyawa lain yang mirip dengan IAA baik struktur maupun respon yang diakibatkannya, yaitu : asam 4-kloroindolasetat (4kloroIAA), asam fenilasetat (PAA), dan asam indolbutirat (IBA) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
Hormon sintetik atau zat pengatur tumbuh yang digolongkan sebagai auksin yaitu : asam a-naftalenasetat (NAA), asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D), asam 2-metil 4-klorofenoksiasetat (MCPA), asam 2-naftalosiasetat (4-CPA), asam p-klorofenoksiasetat (PCPA), asam 2,4,5-triklorofenoksiasetat (2,4,5-T),
asam 3,6-dikloroanisik (dikamba), asam 4-amino 3,5,6-trikloropikolinik (pikloram) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
Dalam aktivitas kultur jaringan, auksin berperan menginduksi terjadinya kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau tunas, mendorong proses embryogenesis, dan mempengaruhi kestabilan genetis tanaman ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
2. Sitokinin
Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuhan yang sangat penting sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan. Seperti auksin, selain sitokinin alami juga terdapat sintesisnya yang tergolong dalam zat pengatur tumbuh. Sitokinin sintetik yang umum digunakan dalam
kegiatan kultur jaringan adalah FAP (6-furfurilaminopurin), BAP
(Benzylaminopurin), Thidiazuron (N-phenil-N-1,2,3-thiadiazol-5-penylurea) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
Dalam kegiatan kultur jaringan sitokinin berperan di dalam menstimulasi terjadinya pembelahan sel, proliferasi kalus, pembentukan tunas, menghambat pembentukan akar, mendorong pembentukan klorofil pada kalus ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
3. Gibberilin (GA)
Gibberilin merupakan kelompok lain dari ZPT atau hormon yang dapat mempengaruhi pemanjangan batang atau ruas batang, mendorong pembungaan, induksi buah, dan tumbuhnya mata tunas yang dorman. Secara
umum dalam kegiatan kultur jaringan tanaman tanpa penambahan GA, sesungguhnya kegiatan telah dapat berjalan dan proses induksi serta diferensiasi dapat dilakukan, meski demikian tidak menutup kemungkinan bahwa GA endogen dalam eksplan walaupun dalam kadar yang relatif kecil diduga tetap merupakan komponen yang essensial, contoh GA sintetik adalah gibberillic acid (Santoso dan Nursandi, 2001).
4. ABA (Abcisic acid)
ABA merupakan hormon tanaman yang secara alamiah disintesis tanaman bila tanaman berada dalam keadaan stress. ABA tergolong dalam zat penghambat tanaman atau inhibitor karena kerjanya berlawanan dengan hormon pendorong seperti auksin, sitokinin, dan giberelin. Dalam kultur jaringan, ABA dapat menghambat proses inisiasi dan pertumbuhan sel (Santoso dan Nursandi, 2001).
f. Bahan pemadat media
Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran komponen-komponen zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media cair tersebut dengan ditambah zat pemadat ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).
Zat pemadat yang digunakan untuk membuat media padat adalah berupa agar-agar. Agar adalah campuran berbagai polisakarida dari galaktosa yang diekstrak dari ganggang laut, terutama Gellidium amansii dan ganggang lain dari golongan Rhodophyta. Umumnya agar dapat membentuk gel pada suhu 40-45°C dengan
titik cair 80-90°C. Kemampuan agar dalam memadatkan media tergantung pada cara pengekstrakannya dari ganggang dan pH larutan media sebelum diautoklaf. Dalam larutan media dengan pH rendah (kurang dari 4,5), gel yang terbentuk oleh agar sangat encer, sedangkan larutan dengan pH tinggi (lebih dari atau sama dengan 5,5) akan berbentuk padat ( Yusnita, 2003 ).
4.3 Lingkungan
Faktor lingkungan utama yang harus dipenuhi adalah : a. Cahaya
Cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut fotomorfogenenesis. Jenis cahaya yang paling sering digunakan dalam kultur jaringan adalah cahaya dari lampu neon. Hal ini disebabkan oleh kemampuannya yang dapat menyebarkan cahaya yang lebih luas dan merata, serta lebih hemat pemakaian listrik (Katuuk, 1989)
b. Suhu
Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-30°C. Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada setiap spesies, serta jenis eksperimen (Katuuk, 1989).
c. pH
Pada umumnya nilai pH yang paling disukai untuk pertumbuhan sel antara 5-6. Walaupun pH media akan berubah selama pengkulturan, pH harus diatur lebih dulu sebelum diautoklaf, yaitu apabila semua komponen media sudah dicampurkan. Manfaat pH dalam media adalah untuk menjaga kestabilan membran sel, mengatur garam-garam agar tetap dalam bentuk
terlarut, membantu penyerapan hara dan mengatur sifat gel agar (dalam media padat) (Katuuk,1989).
d. Kelembaban
Faktor kelembaban relative humidity (RH) tidak banyak dibahas dalam kultur jaringan. Hal ini disebabkan oleh kondisi dalam botol kultur yang selalu lembab karena media. Namun demikian kelembaban di luar botol kultur juga perlu diperhatikan. Kondisi iklim dalam hal ini sangat berpengaruh terhadap kelembaban kultur. Untuk itu disarankan agar RH dalam ruang kultur berkisar 70% ( Katuuk,1989 ).
e. Wadah / botol kultur
Ukuran wadah kultur biasanya juga mempengaruhi pertumbuhan serta
morfogenesis in vitro. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan
konsentrasi CO2 yang tersedia, etilen serta gas lain yang berada dalam ruang wadah. Besar kecilnya wadah tergantung pada jenis serta ukuran eksplan yang digunakan, dan fase perkembangan eksplan sehingga pemindahan eksplan ke botol yang lebih besar sangat diperlukan. Biasanya untuk eksplan yang berukuran kecil, pada permulaan pengkulturan dapat menggunakan tabung kultur yang berdiameter 1,5 cm, kemudian untuk pertumbuhan akar maka diameter tabung kultur dapat diganti menjadi 2,5 cm. Wadah kultur jaringan tidak hanya tergantung pada botol kultur buatan pabrik. Banyak macam wadah yang boleh dijadikan tempat kultur, antara lain: botol-botol bekas obat-obatan, jam, atau bekas bahan makanan lainnya. Biasanya
wadah terbuat dari gelas adalah yang paling baik, karena dapat dengan mudah dicuci untuk digunakan lagi.