BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
B. Pembuatan media, pemilihan eksplan, sterilisasi, dan penanaman….…
Media yang digunakan adalah media Gamborg. Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air, sesuai dengan konsentrasinya. Modifikasi komponen media baku juga biasa dilakukan untuk mendapatkan pertumbuhan kultur yang lebih sesuai yang diinginkan.
Media Gamborg dibuat dengan cara melarutkan bahan-bahan yang ada ke dalam Beaker glass secara berurutan, bahan organik makro dan mikro, vitamin, myoinositol, sukrosa dan agar, serta hormon pengatur tumbuh. Unsur mikro perlu dibuat dalam larutan stok untuk memudahkan dalam pembuatan media karena jumlahnya yang cukup kecil (kurang dari 100 mg/L), sedangkan unsur makro tidak perlu. Begitu juga dengan vitamin, Fe(Na)EDTA, dan Myoinositol perlu dibuat dalam larutan stok. Selanjutnya ditambahkan campuran sukrosa dan agar yang sebelumnya sudah digerus halus. Penambahan dilakukan sedikit demi sedikit
sambil dipanaskan agar campuran sukrosa dan agar tidak menggumpal dan sekaligus memudahkan pelarutan. Campuran bahan kemudian dididihkan. Selanjutnya ditambahkan hormon pengatur tumbuh 2,4-D dan FAP dan diatur PH 5,2-5,6. Jika terlalu asam media akan sukar memadat sehingga perlu ditambah KOH (basa) encer. Jika terlalu basa media akan cepat memadat sehingga akan sulit dituang ke dalam botol-botol media, diatasi dengan penambahan HCl (asam) encer. Selanjutnya media dipindahkan ke dalam botol-botol kultur dan ditutup dengan alumunium foil untuk kemudian disterilisasi dengan autoklaf 121˚C selama 15 menit. Media yang sudah disterilisasi kemudian disimpan dalam inkubator selama 1 minggu dan siap untuk ditanami jika tidak terjadi kontaminasi seperti jamur dan bakteri.
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun tanaman
Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. yang terletak nomor 3-5 dari ujung batang atau cabang karena pada bagian tersebut masih banyak dijumpai jaringan meristem dan parenkim muda yang mempunyai sifat totipotensi sehingga dapat tumbuh dan berkembang menjadi kalus. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk beregenerasi tetap ada. Daun yang terletak di bagian ujung batang atau cabang memiliki jaringan yang sudah tua sehingga kesanggupan untuk beregenerasi sudah berkurang, selain itu jaringan yang sudah tua mengandung banyak bakteri endofit sehingga harus dihindari. Pemilihan daun sebagai eksplan, selain mudah didapat daun juga memiliki kemampuan tumbuh lebih cepat dibandingkan eksplan bagian lain seperti batang utama, cabang batang, atau tangkai bunga. Proses sterilisasi
yang diperlukan juga mudah dan lebih cepat. Menurut Santoso dan Nursandi (2002), munculnya kalus rata-rata terjadi pada hari 12,2 HSI (Hari Setelah Inokulasi) dengan perlakuan asam 2,4-D. Daun yang diinokulasikan akan mengalami dediferensiasi (kebalikan diferensiasi) yaitu berubahnya sel-sel eksplan yang tadinya sudah terspesialisasi menjadi tidak terspesialisasi dan kembali ke kondisi meristematik. Proses ini terjadi pada sel-sel eksplan yang sebelumnya sudah terdeferensiasi). Ukuran eksplan yang akan ditanam berdasarkan orientasi adalah 0,5 – 1,0 cm. Ukuran eksplan tidak begitu menentukan, namun hendaklah diketahui bahwa pembelahan sel akan seringkali gagal apabila eksplan terlalu kecil. Namun eksplan yang terlalu besar juga memiliki resiko kontaminasi yang lebih besar dan penyerapan nutrisi yang kurang sempurna karena tidak semua bagian eksplan menempel pada media sehingga kalus yang terbentuk hanya pada sebagian eksplan saja selebihnya eksplan mulai menguning, menjadi coklat dan akhirnya mati. Peneliti sudah mencoba dengan ukuran eksplan yang besar dan yang kecil. Hasilnya, eksplan yang kecil membentuk kalus lebih sempurna karena nutrisi yang diserap juga lebih banyak karena permukaan eksplan menempel seluruhnya pada media.
Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena pada penelitian yang dilakukan oleh Nakamura dkk. (2000) dilaporkan bahwa ekstrak dari daun tanaman Adenium obesum mengandung glikosida jantung yang memiliki efek mengatasi sitotoksik sehingga berpotensi sebagai antikanker. Oleh karena itu, diharapkan dengan metode kultur jaringan ini dihasilkan kalus dari
daun kamboja jepang yang mengandung glikosida jantung yang sama dengan tanaman asalnya.
Media tumbuh yang digunakan dalam kultur jaringan juga merupakan tempat tumbuh yang menguntungkan bagi pertumbuhan jamur dan bakteri, untuk itu perlu dilakukan sterilisasi guna mencegah kontaminasi. Sterilisasi dilakukan pada peralatan, media, eksplan, maupun ruang transfer. Sterilisasi pada peralatan dan media menggunakan metode uap panas bertekanan yaitu menggunakan autoklaf denga suhu 121 °C selama 15 menit. Ruang transfer disterilisasi dengan disemprot alkohol 70% dan radiasi sinar UV selama ± 2 jam. Sinar UV ini memiliki panjang gelombang yang pendek (10-8 – 10-6 nm) sehingga energi yang dimiliki sinar UV sangat besar karena panjang gelombang berbanding terbalik dengan energi yang dipancarkan sehingga energi radiasi dari sinar UV ini dapat digunakan untuk mensterilisasi ruang transfer. Sinar UV ini beda dengan yang digunakan untuk menyinari uang karena memiliki watt yang lebih besar (2 x 30 watt) sehingga radiasi yang ditimbulkan juga cukup besar untuk mematikan mikroorganisme di dalam ruang transfer. Sterilisasi eksplan terdiri dari 3 tahap, yaitu pencucian, sterilisasi di luar dan sterilisasi di dalam ruang transfer. Pencucian dilakukan dengan tujuan menghilangkan kotoran (kontaminan) dari permukaan daun dengan menggunakan detergen dan dibilas dengan akuades, biasa disebut disinfeksi. Sterilisasi di luar dan di dalam ruang transfer dilakukan secara kimiawi yaitu dengan campuran hipoklorit 10% dan Tween 80 dan dibilas menggunakan akuades steril. Tween 80 digunakan sebagai agen pembasah untuk meningkatkan efektivitas serilisasi karena lapisan terluar daun biasanya
berlapiskan lilin, sehingga akan mencegah terbentuknya gelembung-gelembung udara yang dapat menutupi permukaan jaringan yang dapat menghambat penyerapan nutrisi media.
Eksplan ditanam dalam bentuk irisan melintang daun. Melalui bentuk irisan ini diharapkan permukaan eksplan yang dapat kontak dengan media semakin luas sehingga nutrisi dapat diserap dengan lebih baik oleh eksplan. Pada saat pengirisan dan pemindahan eksplan ke dalam botol kultur, digunakan pisau dan pinset yang telah disterilkan dan didinginkan untuk meminimalkan resiko kematian eksplan karena panas.
Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun