BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman Adenium obesum dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan menggunakan jurnal acuan (Anonim, 2006).
2. Pembuatan stok
a. Pembuatan larutan stok hara mikro
Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades 300 ml. Mangan (II) sulfat tetrahidrat sebanyak 1,00 g, seng sulfat heptahidrat sebanyak 0,2 g, asam borat sebanyak 0,3 g, kalium iodida sebanyak 0,075 g, natrium molibdat dihidrat sebanyak 0,025 g, tembaga (II) sulfat pentahidrat 0,0025 g, kobalt (II) klorida heksahidrat sebanyak 0,0025 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa tiap 1 liter media membutuhkan 1 ml stok hara mikro.
b. Pembuatan larutan stok besi
Stok untuk bahan ini terpisah dari unsur hara mikro lainnya, karena komponen natrium etilen diamin tetra asetat dan besi (II) sulfat heptahidrat sukar larut dalam akuades, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl, kemudian dipanaskan. Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades 300 ml. Besi (II) sulfat heptahidrat sebanyak 0,278 g dan natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat sebanyak 0,373 g dimasukkan ke dalam gelas piala tersebut, lalu ditambahkan beberapa tetes HCl sambil diaduk dengan menggunakan magnetis stirer hingga larut dan agar cepat larut dibantu dengan pemanasan. Kemudian ditambahkan akuades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok besi. c. Pembuatan larutan stok vitamin
Dua ratus milliliter aquades dimasukkan ke dalam gelas piala dengan volume 500 ml, kemudian asam nikotinat sebanyak 0,1 g, piridoksin hidroklorida sebanyak 0, 1 g, tiamin hidroklorida sebanyak 0,01 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok vitamin dan asam amino.
d. Pembuatan larutan stok myoinositol
Untuk membuat larutan myoinositol, diperlukan 10 g myoinositol yang dilarutkan dalam 500 ml aquades dalam gelas piala sampai larut kemudian akuades ditambahkan sampai volume 1 liter. Dalam membuat satu liter media dibutuhkan larutan stok myoinositol sebanyak 10 ml.
e. Pembuatan larutan stok ZPT
ZPT yang digunakan adalah asam 2,4-Diklorofenoksiasetat. Untuk membuat larutan stok 2,4-D (4 ppm), larutkan 2,4-D sebanyak 100 mg ke dalam 2-5 ml etanol, panaskan sebentar lalu tambahkan 100 ml akuades. Dalam membuat satu liter media dengan konsentrasi 2,4D sebesar 4 ppm dibutuhkan larutan stok sebanyak 4 ml.
3. Pembuatan media
Media yang digunakan adalah media Gamborg. Pembuatannya adalah sebagai berikut : mula-mula 500 ml akuades dipanaskan di dalam gelas piala 1000 ml. Sambil terus diaduk, dimasukkan bahan-bahan anorganik makro sesuai dengan komposisi yang ada (daftar terlampir). Setelah semua hara
makro larut, dimasukkan berturut-turut 1 ml larutan stok hara mikro, 5 ml larutan stok besi-EDTA, 1 ml stok vitamin dan 10 ml stok myoinositol. Sedikit demi sedikit dimasukkan campuran sukrosa 27 g dan agar 10 g sambil diaduk hingga larut. Sementara itu, ditambahkan juga akuades sedikit demi sedikit untuk membantu kelarutan hingga volume mencapai 1000 ml. Campuran tersebut dipanaskan hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah jernih, suhu pemanas diturunkan dan stok zat pengatur tumbuh dimasukkan sesuai konsentrasi yang diinginkan. Setelah itu, dilakukan pengaturan pH media 5,2 – 5,6. jika terlalu basa ditambahkan HCl encer dan jika terlalu asam ditambahkan larutan KOH encer. Penyusutan air karena pemanasan diatasi dengan penambahan akuades hingga 1000 ml kemudian media dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan kurang lebih 1 cm. Botol yang berisi media kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan disterilisasi
dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Media yang aman
digunakan adalah media yang telah disimpan dalam inkubator selama kurang lebih 1 minggu dan tidak tampak adanya pertumbuhan mikroorganisme kontaminan seperti : jamur dan bakteri.
4. Sterilisasi alat dan ruangan
a. Sterilisasi alat
Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan alumunium foil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan pada temperatur 121 °C selama 20 menit.
b. Sterilisasi ruangan
Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow (LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% atau spiritus. Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF dinyalakan selama ± 2 jam.
5. Sterilisasi dan penanaman eksplan
a. Sterilisasi eksplan
Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir dengan diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat di permukaan terluar eksplan Eksplan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit 5 – 10 menit kemudian dibilas dengan akuades sebanyak 3 kali. Di dalam LAF eksplan juga disterilkan dengan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit dengan ditambah Tween-80 sebanyak 2-3 tetes selama 5 menit. Eksplan dibilas 3 kali dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf). Eksplan yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam. b. Penanaman eksplan
Potongan eksplan yang akan ditanam yang sudah disterilkan sebelumnya dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan untuk memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur. Media yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 18 °C serta disinari dengan lampu TL 20 watt dengan ketinggian 40 cm.
6. Pengamatan waktu inisiasi kalus
Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada bagian pelukaan eksplan.
7. Subkultur
Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman di mana tanaman telah menampakkan gejala kurang nutrisi (berwarna kecoklatan) atau bobotnya tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi bagian yang lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses subkultur ini dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset, skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan botol-botol yang berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air flow dan disterilkan selama ± 2 jam dengan lampu UV.
Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70% kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong dengan menggunakan skapel dan pinset dengan ukuran kalus 3 – 5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis. Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 180C serta disinari dengan lampu TL 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur
ini dibuat sebanyak 42 botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus.
8. Pemanenan
Setelah dilakukan subkultur, tiap 6 (enam) hari sekali dilakukan pemanenan sebanyak 3 (tiga) buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan dari sisa-sisa agar yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang telah dipanen kemudian dikeringkan pada suhu 40-500C hingga didapatkan perbedaan bobot tidak lebih dari 0,5 mg bobot kalus dari 2 penimbangan berurutan berselang 1 jam (MMI jilid IV) atau dengan kata lain setelah didapatkan berat kalus kering yang konstan. Catat bobot kering kalus hasil setiap pemanenan. Kalus kering yang diperoleh kemudian digerus dengan menggunakan mortir dan stamper. Selanjutnya serbuk kalus yang diperoleh, disimpan di dalam flakon dan dikumpulkan sebanyak ± 2 gram untuk dibuat ekstrak sehingga dapat diketahui metabolit sekunder dalam kalus.
9. Analisis pertumbuhan kalus
Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan dua cara, yaitu :
a. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus.
Perhitungan bobot kalus basah tiap-tiap waktu tertentu yakni setiap 6 (enam) hari sekali. Pertambahan bobot kalus basah pada tiap-tiap waktu
pemanenan didapatkan dari penjumlahan dari tiap-tiap botol yang dipanen pada hari yang sama. Analisis pertumbuhan kalus dilakukan dengan menggunakan kurva sigmoid yang menyatakan hubungan antara umur kalus dengan pertambahan bobot kalus basah (pertumbuhan kalus) sehingga diperoleh gambaran fase-fase pertumbuhan kalus.
b. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik pola pertumbuhan kalus, dengan menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus.
10.Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang
Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-500C. Kemudian daun yang telah dikeringkan tersebut, digerus dengan menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di dalam flakon.
11.Pembuatan ekstrak kalus
Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan Wulandari, 2005). Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 30-50μl (Wagner, et al., 1984).
12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang
Satu gram serbuk kering daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan Wulandari, 2005). Sebelumnya perlu dilakukan uji tabung untuk memastikan ada tidaknya aglikon kardenolida sebagai salah satu cincin lakton yang menyerang C17 pada glikosida steroid. Uji dengan pereaksi Baljet, ambil sari kloroform secukupnya, encerkan dengan metanol 3-5 kali lipat volume asal, tambahkan pereaksi Baljet. Terbentuknya warna jingga menunjukkan adanya aglikon kardenolida. Uji dengan pereaksi Raymond, dengan cara kerja yang sama maka terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya aglikon kardenolida. Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 30-50μl (Wagner, et al., 1984)
13. Pembuatan standar digitoksin
Sepuluh mg serbuk digitoksin dilarutkan dalam sepuluh ml metanol P (Anonim, 1995).
14. Uji KLT ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan standar digitoksin
Ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan standar digitoksin ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak berupa etil asetat – metanol - air (81 : 11 : 8 v/v) dengan jarak pengembangan 8 cm. Deteksinya menggunakan sinar UV 254 dan 365
nm, serta disemprot dengan dua macam pereaksi yaitu Kedde (bercak diamati di bawah sinar tampak) dan Vanilin Asam Fosfat (lempeng dipanaskan pada suhu 1000C selama 10 menit, amati bercak di bawah sinar tampak) (Wagner,
et al., 1984).