3. FORMULASI BERAS ANALOG
3.2 Bahan dan Metode
3.2.5 Formulasi Beras Analog
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mendapatkan formula standar yang akan digunakan pada penelitian utama nanti. Bahan-bahan kering ditimbang sesuai dengan formula (tepung dan GMS) dan dicampur hingga homogen dengan
mixer selama 10 menit. Setelah itu dilakukan penambahan air sebanyak 50% dari total adonan (Budijantodan Yulianti 2012).Air ditambahkan sedikit demi sedikit hingga adonan tercampur rata. Adonan kemudian diekstrusi dengan menggunakantwin screw extruder. Hasil produk ekstrusi dikeringkan dalam oven pada suhu 60°C selama 4 jam untuk mencapai kadar air 4-15 % (Budijanto dan Yulianti 2012). Diagram pembuatan beras analog dapat dilihat pada Gambar 3.2.
Formulasi optimum didapatkan dengan menggunakan progam Mixture Design
(DX7).Faktor yang dipakai sebagai variabel adalah tepung jagung, tepung kedelai, dan bekatul.Respon yang dipakai adalah aktivitas antioksidan dan tingkat kecerahan.Hasil analisis respon dengan menggunakan progam Mixture Design
DX7dengan tiga variabel akan menghasilkan 16 formula beras analog.
Kedelai Steaming150°C, 1 menit Pengeringan suhu 70°C, 6 jam Penggilingan Pengayakan 60 mesh Analisis proksimat Tepung
Gambar 3.2 Proses pembuatan beras analog
Formula optimum yang telah didapatkan akan divalidasi sebanyak 5 kali ulangan berdasarkan rekomendasi progam Mixture DesignDX7 tersebut. Validasi dilakukan terhadap respon aktivitas antioksidan dan tingkat kecerahan.Analisis terhadap formula beras analog optimum dilakukan setelah diketahui hasil validasi memenuhi model dari progam. Analisis yang dilakukan antara lain uji proksimat (kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat), derajat gelatinisasi, amilosa, uji serat pangan, analisis tokoferol, analisis ϒ-oryzanol, total fenol, aktivitas antioksidan, indeks glikemik, sertaanalisissensori t-test terhadap beras analog dan
GMS Tepung jagung, tepung
kedelai, dan bekatul
Pencampuran 10 menit Suhu Feed (T1) : 95oC Compressing (T2) : 95oC Metering (T3) : 95oC Kecepatan Auger : 18 Hz Screw : 15Hz Cutter : 50Hz Penimbangan sesuai formulasi Air Pencampuran bahan kering 10 menit Ekstrusi
Pengeringan dengan oven 60oC , 4 jam
Beras analog hasil formulasi Mixture Design
DX7
Analisis tingkat kecerahan dan aktivitas antioksidan
Analisis proksimat, amilosa, derajat gelatinisasi, serat pangan,
tokoferol, oryzanol, total fenol aktivitas antioksidan, indeks glikemik, dan analisis sensori Beras analog
nasi dari beras analog (kecerahan, tekstur, rasa, aroma, dan penampakan keseluruhan).
3. 2.6 Metode analisis
Analisis α-Tokoferol (AOAC 971.30)
Persiapan sampel
Beras analogbubukdiekstrak menggunakan heksanauntuk mendapatkan minyak beras analog yang akan digunakan dalam analisis selanjutnya. Beras analog direndam dalam pelarut heksana dengan perbandingan beras:heksana sebesar 1:3 selama 24 jam sambil digoyang kemudian dilanjutkan dengan penyaringan. Minyak yang masih bercampur heksana selanjutnya diuapkan menggunakan rotavapor vakum dengan suhu penguapan berkisar antara 54-60°C (Damayanthiet al. 2010).
Sebanyak 1 g minyak beras analog ditimbang ke dalam tabung reaksi 50 ml kemudian ditambah 0.3 g asam askorbat dan 4 ml etanol. Selanjutnya ditambahkan 1 ml KOH 70%.Gas N2 dihembuskan untuk menghindari oksidasi
udara. Larutan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80°C selama 15 menit dan didinginkan cepat dengan air mengalir. Larutan diletakkan dalam labu pemisah dan ditambahkan air 20 ml. Larutan diekstrak dengan penambahan heksana 25 ml sebanyak tiga kali.Penambahan NaCl jenuh dilakukan jika terbentuk emulsi.Ekstrak heksana disatukan dan dicuci dengan akuades hingga netral (gunakan indikator PP).Ekstrak dilewatkan dalam natrium sulfat anhidrous untuk mengikat air yang tersisa. Ekstrak heksana kemudian diuapkan dengan gas N2. Sampel dilarutkan kembali dengan fase gerak dalam labu takar 5 ml dan
ditepatkan volumenya hingga tera. Sampel disaring dengan kertas Whatman 0.45µm dan dihilangkan gelembung udaranya.Injeksi sebanyak 20µ dilakukan untuk pengujian dengan HPLC.Analisis dilakukan dua kali ulangan. Analit akan terukur pada panjang gelombang 280 nm.
Kolom : RP-HPLC dengan kolom C-18 (25 cm × 4.6 mm)
Detektor : UV Vis
Fase Gerak : Metanol : Isopropanol (98 2) Laju Alir : 1.0 ml/menit
Persiapan baku
Larutan baku standar dibuat dengan menimbang 25 mg standar D-αtokoferol yang selalu dibuat segar. Standar baku di tempatkan pada labu takar 50 ml dan ditambahkan fase gerak hingga tera. Setelah itu dibuat deret standar baku hingga 50 ppm. Sebanyak 20µl larutan standar baku disuntikkan dalam kolom HPLC. Konsentrasi tokoferol didapatkan dengan perhitungan sebagai berikut :
Konsentrasi ሺppmሻ Asp x Cst x sp sp
Keterangan :
Asp : area contoh
Cst : konsentrasi standar (µg/ml) Vsp : volume pelarutan sampel (ml) Wsp : bobot contoh (g)
Analisis ϒ-oryzanol (Xu dan Godber 2000)
Persiapan sampel
Sebanyak 1 gram beras analog bubukdilarutkan dengan 5 ml akuades di dalam tabung reaksi 25 ml.Asam askorbat sebanyak 0.2 g kemudian ditambahkan dalam tabung.Larutan tersebut divorteks dan diinkubasi di penangas pada suhu 60°C selama 30 menit. Sebanyak 5 ml pelarut isopropanol:heksana (50:50) ditambahkan dalam tabung dan divorteks selama 30 detik. Setelah homogen, larutan disentrifugasi 3000 rpm pada suhu ruang selama 15 menit.Lapisan organik dikumpulkan dalam tabung reaksi. Residu yang tersisa dicampurkan dengan 5 ml pelarut isopropanol:heksana dan disentifugasi lagi. Lapisan organik yang didapat dikumpulkan bersama dengan lapisan organik yang didapat sebelumnya.
Air akuades 5 ml ditambahkan dalam tabung reaksi untuk mencuci lapisan organik.Tabung reaksi didiamkan selama 10 menit lalu diambil larutan organiknya. Proses pencucian diulangi hingga dua kali. Setelah itu, lapisan organik dihembuskan gas N2 untuk menguapkan pelarut organik.
Minyak beras analog hasil ekstraksi dilarutkan dengan fase gerak.Setelah itu larutan sampel disaring dengan menggunakan membran PTFE 0.45 µ m dan dihilangkan gelembung udaranya terlebih dahulu sebelum diinjeksikan ke dalam kolom HPLC.Sebanyak 20µl larutan sampel disuntikkan dalam kolom HPLC. Analit akan terbaca pada panjang gelombang 330 nm.
Persiapan Baku
Kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan larutan baku standar γ-oryzanol. Larutan baku standar γ-oryzanol dibuat dengan menimbang 25.0 mg baku γ- oryzanol dalam labu 50.0 ml. Deret standar dibuat 5 seri yaitu 0 ppm-250 ppm yang dilarutkan dengan fase gerak. Setelah itu larutan standar baku disaring dengan menggunakan membran PTFE 0.45 mm dan dihilangkan gelembung udaranya terlebih dahulu. Sebanyak 20µl larutan standar baku disuntikkan dalam kolom HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan adalah:
Kolom : RP-HPLC dengan kolom C-18 (25 cm × 4.6 mm)
Detektor : UV Vis
Fase Gerak : metanol, asetonitril, diklorometan, dan asam asetat (50:44:3:3by vol)
Laju Alir : 1.0 ml/menit
Kadar Amilosa (IRRI 1978)
Pembuatan Larutan
Larutan NaOH 1 N dibuat dengan melarutkan 40 g NaOH kristal dengan gelas piala 500 ml. Larutan tersebut dituang ke dalam labu takar 1000 ml dan di tepatkan dengan akuades hingga tanda tera. Larutan asam asetat 1 N dibuat dengan melarutkan sebanyak 5ml asam asetat glasial dengan air akuades 80 ml dan diaduk hingga homogen.
Larutan iod dibuat dengan melarutkan 20 g kalium iodida ke dalam 500 ml akuades dan ditambahkan 2 g iod. Larutan dipindahkan ke dalam labu takar 1000
ml dan ditambahkan akuades hingga tanda tera serta dikocok hingga tercampur rata.
Pembuatan Kurva Standar
Amilosa murni ditimbang sebanyak 40 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.Amilosa kemudian ditambahkan 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1 N.Larutan standar dipanaskan di atas waterbath suhu 95°C selama 10 menit dan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades. Selanjutnya larutan tersebut dipipet masing-masing sebanyak 1, 2, 3, 4, dan 5 ml dalam labu takar 100 ml. Ke dalam masing-masing labu takar tersebut ditambahkan asam asetat 1 N sebanyak masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 ml. Larutan iod ditambahkan sebanyak 2 ml. Setelah itu, larutan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades dan dikocok. Larutan didiamkan selama 20 menit kemudian diukur intensitas warna yang terbentuk.Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm.
Penetapan Sampel
Sejumlah 100 mg sampel tanpa lemak dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Sampel ditambahkan 1 ml etanol serta 9 ml NaOH 1 N. Setelah itu, larutan sampel dipanaskan di atas waterbath suhu 95°C selama 10 menit dan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades. Larutan kemudian dipipet sebanyak 5 ml, dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Sebanyak 1 ml asetat 1 N dan 2 ml larutan iod ditambahkan.Larutan selanjutnya ditambah akuades sampai tanda tera, dikocok, dan didiamkan selama 20 menit. Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm.Kadar amilosa dihitung dengan rumus:
Kadar Amilosa ( ASx P
Keterangan:
A : absorbansi sampel pada panjang gelombang 625 nm S : slope kemiringan pada kurva standar
FP : faktor pengenceran W : berat sampel (g)
Derajat Gelatinisasi (Wooton et al. 1971)
Sebanyak 1 gram sampel halus 60 mesh dilarutkan dalam 100 ml air selama 1 menit dengan waring blender.Larutan disentrifuse pada suhu ruang selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan diambil 0.5 ml secara duplo dan ditambahkan 0.5 ml HCl 0.5 M.Larutan ditambahkan akuades hingga volume menjadi 10 ml.Pada salah satu tabung duplo ditambahkan 0.1 ml larutan iodium. Larutan lain disiapkan dengan cara melarutkan 1 gram sampel dengan 95 ml air dan ditambahkan 5 ml NaOH 10 M. Larutan dikocok selama 5 menit kemudian disentrifus selama 15 menit pada suhu ruang dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan diambil 0.5 ml secara duplo kemudian ditambah 0.5 ml HCl 0.5 M. Larutan ditambahkan akuades hingga volume menjadi 10 ml.Pada salah satu tabung duplo ditambahkan 0.1 ml larutan iodium.Larutan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
Pengamatan dilakukan dengan urutan sebagai berikut: (1) larutan yang ditambahkan HCl digunakan sebagai standar (blanko) pati tergelatinisasi; (2) larutan bahan yang ditambahkan HCl dan larutan iodium digunakan sebagai larutan pati tergelatinisasi; (3) larutan bahan yang ditambah NaOH dan HCl sebagai larutan standar (blanko) total pati; (4) larutan bahan yang ditambah NaOH, HCl, dan larutan iodium sebagai larutan total pati. Derajat gelatinisasi dihitung dengan rumus :
Derajat gelatinisasiሺ ሻ nilai absorbansi pati tergelatinisasinilai absorbansi total pati x 100 Uji Total Serat Pangan Metode Enzimatis (AOAC 985.29)
Persiapan sampel
Sampel kering digiling hingga berukuran 40-50 mesh. Sampel yang mengandung lemak lebih dari 10% harus dihilangkan lemaknya dengan cara dicampurkan dalam 25 ml petroleum eter/g sampel selama satu jam sebanyak tiga kali ulangan, selanjutnya diblender kering. Sampel kemudian dikeringkan selama 12 jam dengan oven biasa pada suhu 105 oC hingga kadar airsampel kurang dari 5%. Kehilangan bobot akibat penghilangan air dan/atau lemak dicatat dan dibuat faktor koreksi yang tepat untuk menghitung % TDF. Prosedur analisis dilakukan terhadap blanko untuk melihat kandungan endapan non serat yang berasal dari reagen atau enzim yang terdapat dalam residu dan dapat terhitung sebagai serat pangan.
Sampel kering ditimbang sebanyak 1 g dalam gelas piala 400 ml.Perbedaan bobot antar sampel diusahakan tidak lebih dari 20 mg.Sebanyak 50 ml buffer fosfat pH 6.0 ditambahkan hingga pH 6.0 ± 0.2.Sebanyak 0.1 ml larutan termamyl
ditambahkan. Gelas piala ditutup menggunakan kertas aluminiumdan diletakkan dalam air mendidih selama 15 menit. Larutan sampel digoyangkan secara perlahan tiap 5 menit.Waktu pemanasan dapat ditambahkan jika jumlah sampel yang ditempatkan di dalam waterbath belum mencapai suhu internal antara 95- 100oC.Termometer digunakan untuk memastikan tercapainya suhu 95-100oC selama 15 menit.Prosedur ini dapat dilakukan selama 30 menit.Selanjutnya larutan tersebut didinginkan pada suhu ruang. Nilai pH ditepatkan hingga 7.5 ± 0.2 dengan penambahan 10 ml NaOH 0.275 N.
Sebanyak 5 mg protease dimasukkan ke dalam sampel dengan cara dilengketkan pada ujung spatula. Protease dapat pula digunakan dalam bentuk larutan (50 mg dalam 1 ml buffer fosfat) yang dipipet sebanyak 0.1 ml dan dimasukkan ke dalam sampel sesaat sebelum digunakan. Setelah itu sampel ditutup kembali dengan kertas alufo dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60oC dengan agitasi kontinyu.Sampel didinginkan dan ditambahkan 10 ml HCl 0.325 M. Nilai pH diukur hingga berkisar antara 4.0-4.6.
Enzim amiloglukosidase ditambahkan ke dalam sampel dan ditutup kembali dengan kertas alufo. Selanjutnya diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60oC dengan agitasi kontinyu.Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 280 ml etanol 95% yang sebelumnya telah dipanaskan hingga suhunya 60oC (volume diukur setelah pemanasan).Sampel dibiarkan pada suhu kamar selama 60 menit agar
terbentuk endapan.Secara kuantitatif endapan disaring melalui
crucible.Sebelumnya, crucible yang mengandung celite ditimbang.
Residu dari hasil penyaringan dicuci dengan 3 x 20 ml etil alkohol 78%, 2 x 10 ml etil alkohol 95%, dan 2 x 10 ml aseton secara berturut-turut. Filtrasi dapat dibantu dengan pengadukan menggunakan spatula.Waktu yang dibutuhkan untuk pencucian dan penyaringan bervariasi antara 0.1 sampai 6 jam, rata-rata waktu yang dibutuhkan ialah 0.5 jam per sampel. Lamanya waktu filtrasi dapat dikurangi dengan penghisapan vakum secara hati-hati setiap lima menit selama filtrasi.
Crucible yang mengandung residu dikeringkan selama satu malam di dalam oven pada suhu 105oC dan didinginkan dalam desikator baru kemudian ditimbang. Bobot residu didapatkan dari hasil pengurangan bobot crucible dan celite.
Analisis residu dari satu sampel ulangan digunakan untuk analisis protein menggunakan metode Kjeldahl, faktor konversi yang digunakan ialah N x 6.25. Sampel ulangan lainnya diabukan selama 5 jam pada suhu 525oC. Cawan dan abu kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang untuk mendapatkan bobot abu.
Penentuan blanko (B) :
B (mg) = bobot residu – PB – AB
Bobot residu (mg) = rata-rata bobot residu (mg) untuk dua ulangan blanko PB dan AB (mg) = bobot protein dan abu dari kedua ulangan blanko. Perhitungan total serat pangan (TDF):
TDF (%) = [(bobot residu – P – A – B) / bobot sampel] x 100 P dan A (mg) = bobot protein dan abu dari kedua ulangan sampel Bobot sampel (mg)= rata-rata bobot sampel.
Uji Antioksidan metode DPPH (Kubo et al. 2002)
Sampel sejumlah 5 g dilarutkan dalam methanol PA dengan perbandingan 1:4. Campuran diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C. Selanjutnya campuran disaring dengan bantuan kertas saring untuk mendapatkan larutan sampel.
Sebanyak 2.8 ml metanol PA, 1 ml buffer asetat (pH 5.5), dan 250µl larutan DPPH dimasukkan dalam tabung reaksi dan dikocok kuat (vorteks). Setelah itu, 45µl larutan sampel ditambahkan dalam tabung reaksi dan divorteks. Tabung reaksi diinkubasikan dalam ruang gelap selama 20 menit.Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 517 nm.Aktivitas antioksidan diperoleh dari hasil pengukuran absorbansi sampel dibandingkan dengan kurva standar kapasitas antioksidan vitamin C (asam askorbat).Satuannya µg vitamin C equivalen/mg sampel (CEQ/mg sampel).
Uji Total Fenol (Slinkard dan Singelton 1977)
Sebanyak 3.9 ml akuades dan 0.5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu (FC) (1:10 dalam akuades) ditambahkan ke dalam 0.1mL minyak beras analog. Larutan tersebut didiamkan selama 3 menit kemudian ditambahkan 2ml Na2CO3 20% dan
dalam ekstrak etanol dinyatakan sebagai miligram ekuivalen asam galat/gram sampel (mg EAG/g sampel).
Uji Tingkat Kecerahan (nilai L)
Pengukuran warna dilakukan dengan Chromameter CR 300 Minolta. Sistem notasi warna yang terdapat dalam chromameter digunakan sebagai cara sistematik dan objektif untuk mendeskripsikan suatu jenis warna. Pengukuran ditampilkan dalam skala L a b. L menunjukkan kecerahan dengan nilai 0 (gelap/hitam), 100 (terang/putih).
Analisis Sensori dengan Uji t-test(Meilgaardet al. 1999)
Analisis sensori merupakan analisis yang menggunakan indera manusia sebagai instrumennya.Analisis sensori yang dilakukan adalah uji t-tes hedonik beras formula optimum dengan beras analog yang telah beredar di pasaran (beras cerdas).Analisis yang dilakukan menyangkut penerimaan terhadap sifat atau kualitas sampel yang diujikan dan melibatkan panelis tidak terlatih sebanyak 72 orang. Panelis diminta mengungkapkan tanggapan pribadinya dengan nilai skala terhadap warna, tekstur, aroma, dan kesukaan secara keseluruhan untuk beras serta rasa, warna, tekstur (kelengketan), aroma dan kesukaan secara keseluruhan untuk sampel nasi dari beras analog. Uji hedonik menggunakan skala angka dari 1-7 (sangat tidak suka sampai sangat suka) dengan desain penyajian sampel menggunakan uji t-test. Data yang diperoleh akan ditabulasi dan dianalisis dengan analisis ragam (ANOVA).
Uji Indeks Glikemik (Miller et al. 1997)
Beras analog sebelumnya dimasak terlebih dahulu dengan perbandingan beras dan air 1:1 selama 8 menit.Setelah itu dilakukan analisis proksimat terhadap nasi dari beras analog untuk menentukan jumlah sampel yang harus dikonsumsi oleh relawan.Jumlah sampel ditentukan mengandung 50 g karbohidrat.
Penentuan indeks glikemik menggunakan subjek manusia. Relawan yang digunakan dalam pengujian ini diseleksi yang memiliki kadar gula darah puasa normal (70-120 mg/dl). Seleksi dilakukan saat pengujian sampel yang pertama dan terpilih 10 orang relawan.Sampel berikutnya dan pangan acuan diuji pada hari yang berlainan dengan interval minimal 3 hari.
Relawan diminta melakukan puasa selama 10 jam pada malam hari kecuali air putih. Pagi harinya sebanyak ±5 µl darah relawan diambil melalui ujung jari untuk diukur kadar glukosa darahnya dengan menggunakan GlucocardTM Test Strip. Relawan kemudian diminta memakan nasi dari beras analog yang telah disiapkan dan kadar gulanya darahnya kembali diukur pada menit 30, 60, dan 120 menit setelah makan. Pengukuran respon kadar glukosa darah untuk pangan standar (50 g glukosa murni) dilakukan pada hari berbeda dengan rentang minimal 3 hari.
Data yang diperoleh ditebar pada grafik dengan kadar glukosa darah pada sumbu y dan waktu (menit) pada sumbu x. Kurva lalu dibuat untuk masing- masing relawan dan dihitung luas area di bawah kurva.Nilai IG masing-masing
relawan dihitung dan dirata-rata. Perhitungan untuk nilai IG adalah sebagai berikut :
luas area di bawah respon glikemik standar glukosaluas area di bawah kurva respon glikemik sampel x 100
3.3 Hasil dan Pembahasan