BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.2. Fungi Simbion Avicennia sp
Kondisi ekosistem mangrove yang keras seperti salinitas tinggi, suhu tinggi, fluktuasi permukaan laut serta kondisi tanah anaerobik mendorong tanaman bakau seperti A. marina untuk beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang ekstrim. A. marina beradaptasi dengan menghasilkan berbagai senyawa fenolik yang unik. Senyawa tersebut biasanya dihasilkan dengan bantuan dari mikroorganisme seperti fungi simbion yang bersimbiosis dengan A. marina.
Fungi simbion merupakan organisme eukariotik yang siklus hidupnya berada di jaringan tanaman hidup, tanpa menghasilkan gejala atau efek merugikan pada inangnya (Powthong et al., 2018). Fungi simbion yang paling umum ditemukan termasuk dalam filum Ascomycota, sementara Bharathidasan & Panneerselvam (2011), menemukan bahwa Deuteromycota banyak ditemukan sebagai fungi simbion. Aspergillus dan Penicillium juga banyak ditemukan sebagai fungi simbion. Sedangkan simbion Basidiomycota jarang ditemukan di dalam pohon vaskular (Crozier et al., 2006). Khalil et al., (2020) menemukan fungi simbion dari berbagai sepesies Chaetomium sp. dan spesies lainnya yang bersimbiosis dengan A. marina.
Fungi simbion yang bersimbiosis dengan A. marina diduga memiliki peranan dalam adaptasi A. marina. Fungi simbion yang hidup di bawah jaringan epidermis, menyerap makanan dari inangnya, dapat meningkatkan pertumbuhan inang serta melindunginya dari patogen dengan cara menghambat pertumbuhan patogen dan membantu inang menjadi resisten terhadap patogen sebagai mekanisme pertahanan (Meena et al., 2017). Fungi simbion A. marina merupakan sumber menjanjikan untuk penemuan senyawa seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, fungi Chaetomium sp.
diisolsai oleh Khalil et al., (2020) dari A. marina dapat menghasilkan berbagai senyawa yang memiliki aktifitas Antimicrobial, Antifungal, Antidepressant, Antioxidant, Antiinflammatory, dan Antibacterial.
Tabel 1. Senyawa yang dihasilkan dari ethyl acetate extracts of endophytic fungus Chaetomium sp. (Khalil et al., 2020)
Name of compound Molecular
formula Activity*
5-Isopropyl-2-methylbicyclo [3.1.0] hex2-ene C10H16 Antimicrobial
3-Ethyl-3-methylheptane C10H22 Antifungal
Dodecane, 2,6,11-trimethyl C15H32 Nf
Propane, 1,1,3-triethoxy C9H20O3 Nf
2,6-Octadienal, 3,7-dimethyl-, (Z) C10H16O Antimicrobial
Dodecane, 4,6-dimethyl C14H3O Nf
2-Propenal, 3-phenyl C9H8O Antimicrobial
Caryophyllene C15H24 Antidepressant
Heneicosane C21H44 Antimicrobial
Hexadecane C16H34 Antimicrobial
1,2-Benzenedicarboxylic acid C22H34O4 Antibacterial
n-Hexadecanoic acid C16H32O2 Antioxidant
9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) C18H32O2 Antiinflammatory 1,2-Benzenedicarboxylic acid C22H34O4 Antibacterial Bis(2-ethylhexyl) phthalate C24H38O4 Antifungal
*Dr. Duke’s Ethnobotanical databases; Nf means not found 2.3. Bakteri MDR (Multi Drug Resistant)
Bakteri Multi Drug Resistant (MDR) merupakan bakteri yang telah mengalami resistensi terhadap beberapa jenis antibiotik. Pemakaian antibiotik yang tidak bijaksana menyebabkan bakteri yang semula sensitif terhadap antibiotik menjadi resisten (Lenny &
Zuhra, 2005). Resisstensi bakteri terjadi ketika tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh antibakteri. Rsistensi merupakan mekanisme alami untuk bertahan hidup yang dibagi menjadi resistensi genetik, resistens nongenetik, dan resistensi silang.
Mekanisme resistensi bakteri terhadap antibakteri antara lain: modifikasi reseptor tertentu yang menjadi target antibakteri; bakteri menurunkan permeabilitas membranya sehingga obat sulit masuk ke dalam sel; inaktivasi obat oleh enzim bakteri; mengeluarkan obat melalui efflux pumps; dan meningkatkan produksi enzim yang dihambat oleh antibakteri (Nafriadi & Ganiswara, 2007).
Pengunaan antibiotik yang berlebihan menyebabkan penyebaran resistensi karena kemampuan bakteri untuk merekayasa gen dan penekanan selektif bakteri, menyebabkan drug resistance equation (Dwiprahasto, 2005). Bakteri MDR dapat dibedakan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Kedua kelompok bakteri dibedakan berdasarkan dinding selnya (Wassenaar, 2012). Staphylococcus aureus mewakili Gram positif dan Escherichia coli mewakili Gram negatif merupakan beberapa bakteri yang resisten terhadap beberapa antibiotik (Lestari et al., 2007)
2.4. Uji Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri dilakukan untuk mengetahui kepekaan suatu bakteri patogen. Kepekaan bakteri diketahui dengan mengunakan beberapa metode, seperti metode dilusi, difusi, dan turbidimetri. Metode difusi adalah suatu metode untk mengetahui MIC (minimum inhibitory concentration) dan MBC (minimum bacteria
concentration). Prinsip metode dilusi adalah memberikan bahan antibakteri pada bakteri patogen dengan kadar yang bertahap mengunakan media tumbuh. Alat yang digunakan sebagai tempat media tumbuh biasanya tabung reaksi dan mikrodilution plate. MIC isolat ditentukan berdasarkan kejernihan media tumbuh yang menunjukan tidak terjadinya pertumbuhan bakteri. MBC isolat ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni bakteri (Dzen et al., 2003).
Metode turbidimetri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri. Semakin sedikit jumlah sel yang tumbuh semakin baik senyawa antibakteri dalam menghambat pertumbuhan sel bakteri. Jumlah sel bakteri dihitung dengan cara mengetahui kekeruhan (turbiditas) kultur. Semakin keruh suatu kultur, semakin banyak jumlah sel bakterinya.
Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya mengenai sel maka sebagian cahaya akan diserap dan sebagian cahaya diteruskan. Pengukuran jumlah cahaya mengunakan spektrofotometer. Jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan jumlah bakteri (Irianto, 2002).
Metode difusi merupakan metode yang paling sering digunakan biasanya mengunakan cawan petri dan kertas cakram. Cawan petri yang berisi media agar diinokulasi dengan kultur bakteri patogen. Isolat antibakteri diberikan pada kertas cakram yang kemudian ditempatkan pada permukaan agar. Selama inkubasi, isolat antibakteri mengalami difusi dari cakram menuju agar sehingga membentuk zona hambat.
Terbentuknya zona hambat dengan diameter yang proposional dipengaruhi olah jumlah isolat antibakteri pada cakram, kelarutan isolat, koefisien difusi, dan keefektifan isolat antibakteri (Mardigan et al., 2012).
2.5. Ekstraksi
Eksraksi merupakan proses pemisahan, yaitu suatu metode yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan bahan campuran atau senyawa tunggal yang terkandung dalam bahan alam mengunakan pelarut sehingga didapatkan crude extract (Voight et al., 1995). Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi dapat bersifat polar, semi polar, maupun polar. Menurut Amiarsih et al. (2006) pelarut yang bagus untuk digunakan memiliki beberapa syarat diantaranya tidak toksik, mampu melarutkan senyawa, mudah menguap atau dihilangkan dari ekstrak, murah, dan tidak bereaksi dengan senyawa yang diekstrak.
Senyawa polar yang terkandung dalam bahan alam akan mudah larut dalam pelarut polar. Pelaut polar juga dapat mearutkan atau menyerap senyawa dengan tingkat kepolaran yang lebih rendah. Air, metanol, etanol, dan asam asetat memiliki tingkat kepolaran yang tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pelarut polar. Aseton, etil asetat,
dan kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pelarut polar dan disebut sebagai pelarut semipolar. Pelarut semipolar dapat melarutkan senyawa yang bersifat semipolar dan senyawa nonpolar. Pelarut nonpolar seperti hexsana dan eter baik untuk mengekstrak berbagai jenis minyak (Gupta et al., 2012).
Ekstraksi atau pemisahan dapat menggunakan berbadai metode, diantaranya yaitu:
1. Infusion, pemisahan menggunakan pelarut air dengan memungkinkan bahan alam untuk tetap tersuspensi dalam pelarut dari waktu ke waktu. Proses infus dapat mengukan air dingin atau air mendidih. Untuk menghasilkan hasil infus (fresh infusion) dibutuhkan priode yang singkat sekitar 15 menit (Voight et al., 1995).
2. Dekok, pemisahan dengan air mendidih dalam waktu yang ditentukan kemudian rebusan disaring sehingga didapatkan ekstrak pekat (Voight et al., 1995).
3. Perkolasi, menambahkan pelarut secara kontinyu atau mengunakan pelarut mengalir yang selalu baru. Bahan alam diberi pelarut dan didiamkan selama 4 jam dalam wadah tertutup. Setelah itu, volume pelarut ditambah sehingga terbentuk lapisan dangkal di atas bahan alam dan dibiarkan selama 24 jam. Perkolator kemudian dibuka dan cairan yang terkandung di dalamnya akan menetes perlahan. Pelarut ditambahkan sebanyak ¾ dari volume yang dibutuhkan. Hal yang perlu diperhatikan adalah menghindari kehabisan pelarut yang ada dalam perkolator. Metode perkolasi akan menghasilkan setidaknya 95% jumlah bahan yang dapat diekstraksi (Handa et al., 2008).
4. Sokhletasi, metode ekstraks dengan mengunakan alat ekstraktor sokhlet dan disebut dengan ekstraksi panas kontinyu. Bahan alam ditempatkan pada kantung berpori (thimble) di dalam aparat sokhlet. Pelarut didalam flask dipanaskan sehingga uap mengembun pada kondensor. Ekstrak yang terkondensi akan menetes ke dalam thimble yang mengandung bahan alam yang akan diekstraksi. Ketika pelarut naik ke atas tabung siphon, pelarut akan tersedot ke dalam flask. Proses ini terjadi terus menerus sampai pelarut dalam shiphon menguap semua. Keuntungan dari metode ini adalah dapat menghemat pengunaan pelarut (Handa et al., 2008).
5. Maserasi, perendaman sampel dengan pelarut dalam suhu ruang. Bahan alam direndam ke dalam pelarut untuk mendapatkan filtrat yang mengandung senyawa bioaktif. Perendaman ditempatkan dalam wadah tertutup dibiarakan pada suhu kamar selama 1 hari hingga materi larut kemudian disaring (Handa et al., 2008). Proses perendaman menyebabkan pecahnya dinding sel sampel akibat berbedaan tekanan didalam sel dan diluar sel sehingga metabolit skunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik (Darwis, 2000).
2.6. Isolasi Senyawa Bioaktif
Kompleksitas kimia suatu senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh organisme dibutuhkan metode pemisahan organik untuk mendapatkan senyawa murni. Isolasi diterapkan pada bahan alam yang menghasilkan metabolit skunder untuk menghasilkan senyawa bioaktif. Isolasi senyawa bioaktif dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu ekstraksi, partisi, fraksinasi, dan analisis spektroskopi dari senyawa murni yang diperoleh dilanjutkan dengan uji aktivitas dari senyawa yang dipperoleh (Saleh et al., 2009).
2.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan teknik pemisahan senyawa berdasarkan dua fase yang berbeda mengunakan lapisan pelat tipis sebagai fase diam dan eulen (larutan pengembang) Sebagai fase gerak (Sherma, 2003). Pelat yang digunakan dapat berupa plastik, kaca, maupun alumunium. KLT banyak digunakan untuk tujuan analisis (kualitatif, kuantitatif, dan preparatif) (Gandjar & Rohman, 2007). KLT bisa digunakan untuk analisis ekstrak natural product, uji stabilitas ekstrak/produk, dan untuk kontrol kualitas sampel (Cimpoui, 2006).
Prinsip KLT yaitu eulen akan bergerak (bermigrasi) dengan diserap fase diam karena pengaruh kapilerisasi dengan cara naik (ascending) maupun turun (descending).
KLT mengunakan absorben berukuran kecl dengan diameter partikel 10-20 µm.
Absorben merupakan penyerap/fase diam yang digunakan dalam kromatografi sebagai sarana adsorbsi. Absorben dipilih berdasarkan sifat kepolarannya berikut adalah urutan polaritas absorben: alumina > silika gel > selulosa. Fase gerak yang digunakan merupakan pelarut organik dapat berupa satu pelarut atau campuran dari beberapa pelarut. Pemilihan pelarut menentukan pemisahan senyawa berdsarkan pada kepolaran fase gerak dan sifat senyawa. Senyawa polar akan mudah terelusi oleh eulen yang bersifat polar dan juga sebaliknya. Berikut merupakan urutan polaritas pelarut organik: air >
metanol > asetonitril > etanol > aseton > etil asetat > dietileter > kloroform > benzena >
n-heksana > peroleum eter > parafin cair (Gandjar & Rohman, 2007).
KLT dapat digunakan untuk identtifikasi pemisahan senyawa berdasarkan nilai Rf (retention factor) dan warna spot. Warna spot divisualisasi mengunakan reagen semprot untuk menentukan indikator golongan senyawa (Wettasinghe et al., 2001). Faktor yang mempengaruhi efisiensi pemisahan senyawa mengunakan KLT:
1. Fase diam sebagai absorben harus menunjukkan selektifitas maksimum terhadap senyawa yang akan dipisahkan, sehingga terdapat perbedaan kecepatan elusi.
2. Eulen harus menunjukkan selektifitas maksimum dalam menyerap/membawa senyawa yang dipisahkan.
3. Senyawa bersifat stabil sehingga mudah dipisahkan (Sherma, 2003).
2.6.2. OCC (Open Column Chromatography)
Open Column Chromatography atau kromatografi kolom terbuka adalah bentuk paling awal dari teknik kromatografi yang dahulu digunakan untuk pemisahan sampel dalam jumlah yang besar menggunakan kolom (Gandjar & Rochman, 2007). Prinsip kerja OCC adalah mengunakan kolom berbentuk seperti seperti buret dengan sampel diletakkan diatas fase diam yang telah dilarutkan dengan pelarut, kemudian sampel dialiri eulen (fase gerak) sehingga senyawa akan membentuk layer di fase diam. Berdasarkan kepolaran eulen, senyawa akan terdistribusi mengalir ke bawah sehingga fraksi sampel dapat ditampung mengunakan tabung reaksi secara berurutan. Fase gerak mengalir karena dipengaruhi oleh grafitasi dan tarikan antar molekul saat kolom dibuka dari bawah. Fraksi yang tidak tertahan olah fase diam akan keluar terlebih dahulu dan diikuti oleh fraksi lainnya. Senyawa yang dipisahkan dideteksi profilnya mengunakan KLT. Profil fraksi yang sama diduga merupakan senyawa yang sama sehingga dapat digabungkan.
2.6.3. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi didasarkan atas distribusi partisi sampel (komponen) diantara cairan fase gerak dan fase diam. Prinsip kerja HPLC adalah memisahkan komponen analit (sampel) berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen pada sampel (Gandjar & Rohman, 2007). Kepolaran analit yang lebih mirip dengan fase diam akan tertinggal di fase diam akan bergerak lebih lambat, sedangkan kepolaran yang lebih mirip dengan fase gerak akan terdistrbusi lebih jauh dan bergerak lebih capat. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara disuntikkan. Fase gerak cair dialirkan melalui melalui kolom detektor dengan bantuan pompa. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen karena perbedaan kekuatan interaksi antara komponen dengan fase diam. Komponen yang kurang kuat interaksinya akan keluar lebih lama. Setiap campuran komponen yang keluar dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
2.6.4. NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
NMR bertujuan untuk menentukan sifat fisik dan kimia dari atom atau molekul yang terkandung pada suatu senyawa dengan memanfaatkan sifat magnetik inti atom.
Informasi rinci tentang struktur, dinamika, keadaan reaksi, dan lingkungan kimia molekul diketahui berdasarkan fenomena resonansi magnetik nuklir (Soekamto, 2008).
NMR didasarkan pada penyerapan energi oleh partikel yang sedang berputar di dalam medan magnet yang kuat. Energi yang digunakan dalam pengukuran bergantung
pada jenis inti yang diukur, beberapa pengukuran mengunakan frekuensi 4-600 MHz.
Karakteristik inti atom yang dapat diukur dengan NMR yaitu: bentuk bulat; berputar;
bilangan kuantum spin = ½; jumlah proton dan neutron ganjil (contoh 1H, 19F, 31P, 11B, 13C).
Inti aktif NMR (misalnya 1H atau 13C) di dalam medan magnet terjadi penyerapan pada frekuensi tertentu yang menunjukkan karakteristik suatu isotop. Frekuensi resonansi, energi absorpsi, dan intensitas sinyal berbanding lurus dengan kekuatan medan magnet. Sebagai contoh pada medan magnet 21 telsa proton beresonansi pada 900 MHz. Nilai magnet 21 T dianggap setara dengan magnet 900 MHz meskipun inti yang berbeda beresonansi pada frekuensi yang berbeda.
Road Map Penelitian
Gambar 1. Roadmap Penelitian
Penelitian yang sudah dilakukan / sedang berlangsung
1. Efektivitas Ekstrak Daun Mangrove Avicenia Alba (Tomlinson, 1986) Dalam Mencegah Bakteri Vibrio Harveyi (Johnson & Shunk, 1936) Pada Udang Vaname (Litopenaus Vannamei)
2. Penggunaan Ekstrak Buah Avicennia Alba (Tomlinson, 1986) Sebagai Bahan
Antibakteri Alami Untuk Pengobatan Penyakit Yang Disebabkan Oleh Vibrio Parahaemolyticus (Fujino Et Al., 1951) Pada Udang Vaname (Litopenaeus Vannamei).
3. Kajian Mikroba Endo Simbion Mangrove Avicennia sp. Terhadap Infeksi Penyakit Vibriosis Pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)
Tahun I (2021) Investigasi Senyawa Bioaktif Fungi Simbion Mangrove Avicennia Sp. Terhadap Bakteri Multi Drug Resistant (MDR)
Kegiatan Luaran
1. Publikasi di Jurnal Nasional Sinta 4 (2018-2019)
1. Seminar nasional 2. Jurnal nasional
terakreditasi ( Sinta 4)
Tahun II (2022) Identifikasi dan karakterisasi senyawa bioaktif mikroba simbion mangrove Avivennia sp. sebagai antibakteri berspektrum luas
1. Prosiding terindeks scopus
2. Jurnal nasional ( Sinta 2) 3. Seminar nasional
Mikroba Simbion mangrove Avicennia sp. sebagaai: Antibakteri Vibriosis dan Multi Drug Resistant (MDR) Kandidat antibiotik baru imunostimulan pada udang
Potensi Obat Antibakteri baru:
Senyawa bioaktif fungi simbion mangrove sebagai kandidat antibiotik baru terhadap bakteri MDR.
2021 (Perairan Lampung dan Lab. Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Lampung)
BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1.Bagan Alir Penelitian (Fishbone Diagram)
KegiatanIndikator
Sampling mangrove Avicennia sp. perairan Lampung
Isolasi fungi simbion mangrove perairan Lampung
Uji antagonis fungi simbion terhadap bakteri Multi Drug Resistant (MDR)
Identifikasi Mangrove
Kultur dan fungi simbion mangrove
Uji aktivitas antibakteri ekstrak fungi simbion mangrove Avicennia sp.
Identifikasi biokimia simbion mangrove
Identifikasi morfologi fungi simbion mangrove
Identifikasi molekuler mikroba simbion mangrove
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji aktivitas antibakteri ekstrak mikroba simbion
Kromatografi Kolom Terbuka / Open Coloum Chromatography (OCC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Didapatkan isolat-isolat murni bakteri dan fungi simbion mangrove perairan Lampung
Didapatkan isolat bakteri dan fungi yang memiliki aktivitas terhadap bakteri MDR pada uji antagonis
Diketahui jenis spesies mangrove
Ekstrak mikroba simbion yang memiliki aktivitas
Terpilihnya satu ekstrak bakteri dan 1 ekstrak fungi simbon
Draf jurnal
Didapatkan data sifat-sifat biokimia bakteri simbion mangrove
Didapatan hasil identifikasi morfologi fungi dibawah mikroskop
Didapatkan hasil identifikasi molekuler, dan pohon filogenetik dari mikroba simbion mangrove
Didapatkan fraksi terbaik dari ekstrak mikroba simbion yang memiliki aktivitas antibakteri MDR
Submitted jurnal nasional terakreditasi
Gambar 2. Fishbone diagram Metode Penelitian
3.2. Pengambilan sampel
Sampel mangrove Avicennia sp. diambil dari perairan Lampung, dengan menggunakan Pisau/cutter. Sampel diambil dan dimasukkan ke dalam plastik kemudian disimpan sementara dalam cool box. Sampel selanjutnya dibersihkan untuk membersihkan bakteri perairan yang menempel pada permukaannya. Selanjutnya dilakukan isolasi fungi simbion mangrove Avicennia sp.
3.3. Isolasi dan purifikasi fungi simbion mangrove
Isolasi dan purifikasi fungi simbion mangrove dilakukan dengan menggunakan metode spread plate (Brock dan Madigan, 1991) dengan menggunakan media Malt Extract Agar (MEA). Media MEA yang merupakan media optimum penumbuh fungi (Radjasa et al., 2007; Fajarningsih et al., 2012).
3.4. Uji antagonis fungi simbion mangrove terhadap bakteri MDR
Uji antagonis antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode overlay (Terkina et al., 2006). Fungi diinokulasi pada cawan petri dan kemudian dilakukan overlay untuk pengujian antagonis terhadap bakteri MDR. Selanjutnya cawan petri dibungkus dengan plastik wrap dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 hari. Pada hari ke-2, bakteri uji yang telah ditanam dan ditumbuhkan selama 1x24 jam pada media cair ZoBell 2216E tawar sambil digoyang menggunakan shaker. Bakteri uji diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam 100 mL soft agar ZoBell 2216E tawar (1% dari total volume soft agar).
Selanjutnya soft agar yang telah berisi bakteri uji dituang ke media padat MEA laut yang telah ditumbuhi isolat fungi simbion mangrove, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1x24 jam. Isolat fungi simbion mangrove yang aktif terlihat dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang kemudian diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong.
3.5. Kultur mikroba endo-simbion
Kultur fungi simbion dilakukan secara bertahap dari volume kecil, sedang hingga volume besar. Kultur fungi simbion mangrove dimulai dengan membuat media cair MEB sebanyak 10 ml pada masing-masing tabung reaksi, dan 100 ml pada masing-masing erlenmeyer. Kemudian pindahkan kira-kira 1 cm miselium fungi yang telah dikultur pada media agar MEA ke dalam tabung reaksi yang berisi media cair MEB tersebut.
Selanjutnya inkubasi selama 2-3 hari. Setelah terbentuknya miselium baru dalam tabung reaksi, kemudian pindahkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 100 ml media cair MEB. Inkubasi selama 5-6 hari, miselium fungi siap dipanen. Kemudian disaring dan diambil miselium yang terbentuk untuk diekstrak dengan menggunakan pelarut organik.
3.6. Ekstraksi
Ekstraksi fungi simbion mangrove dilakukan dengan merendam tiap miselium fungi dengan larutan metanol selama 24 jam sebanyak 3 kali (Trianto et al., 2004). Pada fungi simbion yang diekstrak adalah miseliumnya. Kemudian larutan ekstrak mikroba simbion dievaporasi pada suhu 37 oC hingga pelarut menguap sempurna dan didapatkan crude extract dari mikroba endo-simbion tersebut (Fajarningsih, 2006).
Ekstrak kasar yang telah didapatkan, selanjutnya dikeringkan dengan gas Nitrogen untuk mendapatkan berat kering dari ekstrak. Kemudian ekstrak yang telah diketahui berat keringnya, dilakukan uji aktivitas antibakteri bakteri MDR.
3.7. Uji aktivitas antibakteri MDR
Proses selanjutnya yaitu uji aktivitas antibakteri MDR menggunakan metoda difusi agar (Ozdemir et al., 2004) dengan menyiapkan seri konsentrasi ekstrak fungi simbion masing-masing 15µg/disk, dan 150 µg/disk. Kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri MDR
Bakteri uji yang telah dikultur dalam media agar miring, selanjutnya dipindahkan dengan jarum ose ke dalam media Zobell 2216E cair steril. Kemudian diinkubasi dengan suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya bakteri bisa digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.
3.8. Isolasi dan purifikasi senyawa bioaktif 3.8.1. Separatory Funnel
Separatory funnel disebut juga corong pemisah, adalah alat berbentuk corong dari kaca dan terdapat keran di bagian bawahnya, digunakan dalam ekstraksi cair-cair untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut yang tidak bercampur. Pada penelitian ini digunakan untuk memisahkan ekstrak yang bercampur antara air dan pelarut etil asetat, dengan perbandingan (1:3).
3.8.2. OCC (open column chromatography)
Fraksi terbaik dilihat dengan zona hambat terbesar dan berat ekstrak terbanyak pada tahap separatory funnel dipilih untuk dipisahkan lagi dengan mengunakan metode OCC.
Prosedur OCC diawali dengan penentuan fase gerak dan fase diam. Fase gerak ditentukan dengan metode KLT (kromatografi lapis tipis). KLT mengunakan plat silika dipotong dengan ukuran 1 x 5,5 cm kemudian dibuat jarak 0,5 cm dari salah satu ujung plat sebagai garis awal. Fraksi terpilih di teteskan pada plat KLT kemudian plat dimasukkan pada chamber KLT tertutup yang berisi perbandingan pelarut sebanyak 2 ml. Perbandingan pelarut yang digunakan yaitu MeOH:EtOAc (1:1) dan EtOAc:Hex (7:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3,
1:4, dan 1:5). Pelarut yang menghasilkan pemisahan bercak paling baik digunakan sebagai patokan eulen pengembang pada OCC.
Fraksi yang dihasilkan diuji dengan KLT untuk menentukan kelompok fraksi. Fase gerak KLT adalah eulen yang telah ditentukan sebelumnya. Fraksi yang dihasilkan kemudian diujikan dengan metode antibacterial bioassay guided purification.
3.8.3. HPLC (high performance liquid chromatography)
Purifikasi senyawa terpilih menggunakan HPLC detektor UV dan detektor RI.
Column RP-18 sebagai kolom semi preparatif untuk purifikasi senyawa pemisahan dan analisis mengunakan fase terbalik. MeOH:Air (1:1) digunakan sebagai pelarut dengan flow rate sebesar 1 ml/min. Setiap peak yang terbentuk ditampung pada vial dikeringkan dengan gas nitrogen dan ditimbang beratnya. Hasil diuji dengan KLT untuk melihat kemurniannya. Fase gerak KLT adalah eulen yang telah ditentukan pada tahap OCC.
Visualisasi bercak KLT mengunakan vanilin asam sulfat. KLT yang telah dikering anginkan disemprot dengan vanilin asam sulfat, kemudian dipanaskan di atas hotplate.
Bercak yang terbentuk diamati untuk mengetahui kelompok senyawa. Fraksi yang dihasilkan kemudian diujikan dengan metode antibacterial bioassay guided purification.
3.8.4. Karakterisasi struktur senyawa bioaktif
Identifikasi senyawa antibakteri dilakukan dengan mengunakan NMR (nuclear magnetic resonance). Fraksi yang memiliki zona hambat terbesar dimurnikan dan dikarakterisasi untuk mendapatkan struktur kimia yang terkandung pada senyawa
Identifikasi senyawa antibakteri dilakukan dengan mengunakan NMR (nuclear magnetic resonance). Fraksi yang memiliki zona hambat terbesar dimurnikan dan dikarakterisasi untuk mendapatkan struktur kimia yang terkandung pada senyawa