LAPORAN PENELITIAN DASAR UNIVERSITAS LAMPUNG
INVESTIGASI SENYAWA BIOAKTIF FUNGI SIMBION MANGROVE Avicennia sp. TERHADAP BAKTERI MULTI DRUG
RESISTANT (MDR)
TIM PENGUSUL
Oktora Susanti S.Pi., M.Si NIDN: 0001108804 SINTA ID: 6647290 Eko Efendi, S.T., M.Si. NIDN: 0029037808 SINTA ID: 38278 dr. Nisa Karima, M.Sc. NIDN: 0021118808 SINTA ID: 6682617
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS LAMPUNG
2021
HALAMAN PENGESAHAN
PENELITIAN DASAR UNIVERSITAS LAMPUNG
Judul Penelitian : Investigasi Senyawa Bioaktif Fungi Simbion Mangrove Avicennia Sp. Terhadap Bakteri Multi Drug Resistant (MDR) Manfaat sosial ekonomi : Pengembangan Ilmu Pengeahuan dan Tekologi
Jenis penelitian : Penelitian Dasar Ketua Peneliti
a. Nama Lengkap b. NIDN
c. SINTA ID
d. Jabatan Fungsional e. Program Studi f. Nomor HP
g. Alamat surel (e-mail) : : : : : : :
Oktora Susanti S.Pi., M.Si 0001108804
6647290 Asisten Ahli Ilmu Kelautan 085643113958
[email protected] Anggota Peneliti (1)
a. Nama Lengkap b. NIDN
c. SINTA ID d. Program Studi
: : : :
Eko Efendi, S.T., M.Si.
0029037808 38278
Ilmu Kelautan Anggota Peneliti (2)
a. Nama Lengkap b. NIDN
c. SINTA ID d. Program Studi
: : : :
dr. Nisa Karima, M.Sc.
0021118808 6682617 Ilmu Kelautan Jumlah mhs yang terlibat : 1 orang Jmlh alumni yang terlibat :
Jumlah staf yang terlibat : 1 orang
Lokasi kegiatan : Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Lama kegiatan : 6 (enam bulan)
Biaya Penelitian : Rp. 20.000.000,- Sumber dana : DIPA BLU UNILA
Mengetahui,
Dekan Fakultas Pertanian
Prof. Dr. Ir. Irwan Sukri Banuwa, M.Si.
NIP. NIP. 19611020 198603 1 002
Bandar Lampung, 21 September 2021 Ketua Peneliti,
Oktora Susanti, S.Pi., M.Si.
NIP. 198810012019032014 Menyetujui,
Ketua LPPM Universitas Lampung,
Dr. Ir. Lusmeilia Afriani, D.E.A.
NIP. 196505101993032008
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL... i
HALAMAN PENGESAHAN ... ii
DAFTAR ISI... iii
RINGKASAN ... iv
BAB 1. PENDAHULUAN ... 1
1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Perumusan Masalah ... 2
1.3. Tujuan Khusus ... 3
1.4. Urgensi Penelitian ... 3
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ... 12
2.1. Landasan Ilmiah (State of the Art) ... 4
2.2. Fungi Simbion Avicennia sp. ... 5
2.3. Bakteri MDR (Multi Drug Resistant) ... 6
2.4. Uji Antibakteri ... 6
2.5. Ekstraksi ... 7
2.6. Isolasi Senyawa Bioaktif ... 9
2.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 9
2.6.2. OCC (Open Column Chromatography) ... 10
2.6.3. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ... 10
2.6.4. NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ... 10
BAB 3. METODE PENELITIAN ... 13
3.1. Bagan Alir Penelitian (Fishbone Diagram) ... 13
3.2. Pengambilan sampel ... 14
3.3. Isolasi dan purifikasi fungi simbion mangrove ... 14
3.4. Uji antagonis fungi simbion mangrove terhadap bakteri MDR ... 14
3.5. Kultur mikroba endo-simbion ... 14
3.6. Ekstraksi ... 15
3.7. Uji aktivitas antibakteri MDR ... 15
3.8. Isolasi dan purifikasi senyawa bioaktif ... 15
3.8.1. Separatory Funnel ... 15
3.8.2. OCC (open column chromatography) ... 15
3.8.3. HPLC (high performance liquid chromatography) ... 16
3.8.4. Karakterisasi struktur senyawa bioaktif ... 16
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 17
4.1. Hasil yang dicapai ... 17
4.2. Luaran yang dicapai ... 19
DAFTAR PUSTAKA ... 20
LAMPIRAN... 23
INVESTIGASI SENYAWA BIOAKTIF FUNGI SIMBION MANGROVE Avicennia sp. TERHADAP BAKTERI MULTI DRUG RESISTANT (MDR)
RINGKASAN
Mangrove merupakan salah satu bahan alami yang dapat digunakan sebagai alternatif dalam pencegahan penyakit, salah satu spesies mangrove yang memiliki senyawa antibakteri yaitu Avicennia sp. Bagian daun Avicennia sp. memiliki senyawa saponin, tannin dan steroid yang dapat menghambat fungsi membran sitoplasma dan metabolisme energi pada bakteri. Mangrove memiliki hubungan simbiosis dengan mikroba simbion yang melekat pada tubuhnya. Mikroba simbion adalah mikroorganisme yang hidup menetap pada inangnya, salah satu jenisnya adalah fungi simbion biasanya menghasilkan beberapa senyawa bioaktif yang sama seperti inangnya. Dalam menjaga kelestarian lingkungan, maka penting untuk dilakukan penelitian tentang potensi fungi simbion mangrove Avicennia sp.
Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui potensi fungi simbion mangrove Avicennia sp terhadap bakteri Multi Drug Resistant (MDR) yang menjadi permasalahan dibidang kedokteran saat ini. Tujuan khusus dari penelitian ini adalah mencari senyawa bioaktif dari ekstrak fungi simbion mangrove Avicennia sp. yang dapat menghambat dan membunuh pertumbuhan bakteri Multi Drug Resistant (MDR). Penelitian ini dilakukan dengan beberapa tahap yaitu isolasi fungi simbion mangrove Avicennia sp., uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri MDR, kultur dan identifikasi fungi simbion mangrove Avicennia sp., dan karakterisasi senyawa bioaktif yang terkandung pada ekstrak fungi simbion tersebut. Hasil yang didapatkan terdapat 16 isolat jamur yang berhasil diekstraksi. Berdasarkan bioasssay guided purification 3 ekstrak isolat jamur yang memiliki konsistensi dalam menghambat bakteri MDR, yaitu isolat 04-A, 10-D, dan 16-R. Isolat tersebut setelah di identifikasi secara molekuler, memiliki kemiripan terhadap spesies jamur Colletotrichum gloeosporioides (94.61%), Aspergillus terreus (98.78%), dan Scopulariopsis brevicaulis (93.88%). Penilitian ini masih berjalan untuk mengidentifikasi senyawa bioaktif yang terkandung pada isolat jamur tersebut.
Kata Kunci: Fungi simbion, Avicennia sp., Multi Drug Resistant, senyawa bioaktif
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Mangrove merupakan salah satu ekosistem istimewa dan langka di dunia, karena luasnya hanya menutupi 2% permukaan bumi. Ekosistem mangrove memiliki peran penting dalam bidang ekologi, sosial ekonomi, dan sosial budaya (Setyawan & Winarno, 2006). Mangrove Avicennia sp. merupakan salah satu tumbuhan yang terdapat pada ekosistem mangrove. Masyarakat pesisir menggunakan batang dan daun Avicennia sp.
sebagai sumber obat-obatan tradisional (Tarman et al., 2013). Penggunaan tanaman tersebut sebagai obat tradisional memungkinkan mangrove Avicennia sp. mengandung senyawa bioaktif dan merupakan sumber menjanjikan untuk penemuan senyawa baru (Khalil et al., 2020).
Mangrove Avicennia sp. diharapkan memiliki metabolit sekunder spesifik berupa senyawa bioaktif, dan merupakan inang untuk mikroorganisme (bakteri dan fungi) simbion yang dapat memproduksi metabolit sekunder. Beberapa studi tentang fungi simbion menunjukkan potensi yang menjanjikan terutama di bidang industri farmasi untuk menghasilkan senyawa bioaktif dan penyediaan bahan baku obat (Kumala & Fitri, 2008). Pemanfaatan fungi simbion sebagai sumber bahan baku obat dinilai lebih hemat secara ekonomi dibandingkan menggunakan tanaman obat (Sinaga et al., 2009).
Bakteri MDR menjadi penyebab utama meningkatnya kematian di negara berkembang (Wahyono, 2007). Sekitar 70 % bakteri menyebabkan infeksi telah resisten terhadap setidaknya salah satu obat yang paling umum digunakan untuk pengobatan (Prabha et al., 2010). Menurut Wibowo (2015) pengembangan kelas antibiotik baru untuk menghasilkan antibiotik dengan potensi yang tinggi dan spektrum yang lebih luas, namun seminimal mungkin menghasilkan bakteri resisten. Hal tersebut merupakan salah satu strategi untuk mengatasi resistensi bakteri patogen.
Potensi fungi simbion Avicennia sp. sangat tinggi untuk mengatasi permasalahan akibat serangan agen patogenik dengan strategi mengembangkan kelas antibiotik baru.
Avicennia sp. merupakan sumber menjanjikan untuk penemuan senyawa aktif. Fungi Chaetomium sp. diisolasai dari Avicennia sp. dapat menghasilkan berbagai senyawa yang memiliki aktifitas antimicrobial, antifungal, antidepressant, antioxidant, antiinflammatory, dan antibacterial (Khalil et al., 2020). Aktifitas antibacterial dari fungi yang bersimbion dengan Avicennia sp. memungkinkan fungi simbion dapat menghasilkan antibakteri untuk mengatasi bakteri MDR. Oleh karena hal tersebut, perlu dilakukan kajian mengenai potensi fungi simbion Avicennia sp. penghasil antibakteri terhadap bakteri MDR
1.2. Perumusan Masalah
Antibiotik digunakan sebagai obat infeksi bakteri pada berbagai macam penyakit.
Seiring dengan perkembangan jaman, keberadaan bakteri patogen mengalami perubahan menjadi multi resistant terhadap obat antibiotik yang sudah beredar di masyarakat.
Resistensi bakteri terhadap sejumlah agen antimikroba menjadi masalah kesehatan utama di seluruh dunia. Penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri MDR menjadi penyebab utama meningkatnya angka kematian di negara berkembang. Sekitar 70% bakteri yang menyebabkan infeksi telah resisten terhadap setidaknya salah satu obat yang paling umum digunakan untuk pengobatan (Prabha et al., 2010). Ketergantungan, meningkatnya penggunaan, penyalagunaan, dan penggunaan antibiotik yang kurang bijaksana menyebabkan bakteri memiliki daya tahan terhadap obat atau disebut MDR (Multi Drug Resistant) (Laport et al., 2009).
Menurut Wibowo (2015) terdapat beberapa strategi untuk mengatasi resistensi bakteri patogen. Strategi tersebut adalah sebagai berikut:
1. Membuat target berdasarkan mekanisme resistensinya untuk menonaktitkan enzim bakteri yang dapat menonaktifkan antibiotik. Cara tersebut menghasilkan clavulanate agen antibiotik yang tidak aktif apabila digunakan sendiri, namun meningkatkan aksi agen antibiotik dari kategori β-laktam khususnya amoxicillin pada bakteri resisten.
2. Pengembangan kelas antibiotik baru untuk menghasilkan antibiotik dengan potensi yang tinggi dan spektrum yang lebih luas, namun seminimal mungkin menghasilkan bakteri resisten. Hasil dari strategi ini adalah ditemukannya kelas antibiotik linezolid.
Linezolid diketahui memiliki mekanisme kerja menghambat sintesis protein melalui interaksi spesifik dengan 23S RNA ribosom.
3. Penggunaan teknik genomik untuk menentukan target baru. Dilakukan untuk mengetahui gen yang bertanggung jawab terhadap ekspresi protein yang berperan pada virulensi bakteri maupun pada daya survival bakteri, sehingga memperluas target kandidat agen antibiotik yang saat ini terbatas. Target-target baru tersebut berfungsi dalam skrining untuk menentukan senyawa penuntun yang dapat dikembangkan menjadi agen antibiotik tervalidasi. Contoh target baru tersebut adalah metallopeptidase yang merupakan protein yang esensial bagi bakteri dan terdapat pada hampir semua bakteri.
4. Mengembangkan strategi untuk memperlama siklus penggunaan antibiotik. Strategi ini dilakukan dengan mengoptimalkan penggunaan antibiotik yang telah tersedia.
Penelitian pemanfaatan biodiversitas laut seperti fungi simbion mangrove Avicennia sp. merupakan salah satu bioprospeksi senyawa bahan alam untuk mengatasi penyakit yang mematikan, seperti penyakit infeksi. Hal tersebut dapat dimanfaatkan untuk
melaksanakan strategi mengatasi resistensi bakteri patogen dengan mengembangkan kelas antibiotik baru. Penelitian senyawa bahan alam kelautan untuk tujuan tersebut difokuskan untuk menemukan kandidat obat baru yang dapat mengatasi mikroorganisme patogen yang telah mengalami resistensi terhadap agen antibiotik.
1.3. Tujuan Khusus
Tujuan dilakukan penelitian ini adalah skrining fungi simbion mangrove Avicennia sp. yang mempunyai potensi antibakteri terhadap bakteri MDR dan karakterisasi senyawa bioaktif dari fungi simbion terbaik yang memiliki aktivitas terhadap bakteri patogen MDR.
1.4. Urgensi Penelitian
Permasalahan yang dihadapi bidang teknologi kesehatan dan obat nasional salah satunya adalah pengembangan kandidat senyawa obat berbasis sumber daya alam khususnya dari biota laut masih belum banyak dilakukan. Sehingga diperlukan eksplorasi potensi sumber daya alam untuk menemukan dan mengembangkan kandidat senyawa obat baru yang dilakukan secara sistematis dan berkelanjutan. Kebaruan dari penelitian dibidang ini adalah terkoleksinya fungi simbion mangrove Avicennia sp. yang potensial dari perairan Lampung, dan melalui karakterisasi senyawa bioaktif, kemungkinan besar dapat ditemukannya senyawa baru yang memiliki potensi antibakteri MDR sebagai solusi pada bidang kesehatan.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Landasan Ilmiah (State of the Art)
Avicennia merupakan marga yang memiliki kemampuan toleransi terhadap kisaran salinitas yang luas dibandingkan dengan marga lainnya. Avicennia mampu tumbuh dengan baik pada salinitas yang mendekati tawar sampai dengan 90o/oo (MacNae, 1968).
Sebagian besar jenis-jenis mangrove tumbuh dengan baik pada tanah berlumpur, terutama di daerah dimana endapan lumpur terakumulasi (Chapman, 1977). Di Indonesia, substrat berlumpur ini sangat baik untuk tegakan Avicennia (Kint, 1934).
Noor et al. (2016) menjelaskan Avicennia marina (Forsk.) Vierh. atau dalam bahasa lokat disebut sebagai; api-api putih, api-api abang, sia-sia putih, sie-sie, pejapi, nyapi, hajusia, pai. Tumbuhan tersebut merupakan pionir pada lahan pantai yang terlindung, memiliki kemampuan menempati dan tumbuh pada berbagai habitat pasang-surut, bahkan di tempat asin sekalipun. Jenis ini merupakan salah satu jenis tumbuhan yang paling umum ditemukan di habitat pasang-surut. Akarnya sering dilaporkan membantu pengikatan sedimen dan mempercepat proses pembentukan tanah timbul. Jenis ini dapat juga bergerombol membentuk suatu kelompok pada habitat tertentu. Berbuah sepanjang tahun, kadang-kadang bersifat vivipar. Buah membuka pada saat telah matang, melalui lapisan dorsal. Buah dapat juga terbuka karena dimakan semut atau setelah terjadi penyerapan air. A. marina tumbuh di Afrika, Asia, Amerika Selatan, Australia, Polynesia dan Selandia Baru dan ditemukan di seluruh Indonesia.
Belukar atau pohon A. marina tumbuh tegak atau menyebar, dengan ketinggian pohon mencapai 30 meter. Memiliki sistem perakaran horizontal yang rumit dan berbentuk pensil (atau berbentuk asparagus), akar nafas tegak dengan sejumlah lentisel.
Kulit kayu halus dengan burik-burik hijau-abu dan terkelupas dalam bagian-bagian kecil.
Ranting muda dan tangkai daun berwarna kuning, tidak berbulu. Bagian atas permukaan daun ditutupi bintik-bintik kelenjar berbentuk cekung. Morfologi A. marina dapat dilihat pada lampiran 1. Bagian bawah daun putih- abu-abu muda. Unit sederhana, letak berlawanan dengan bentuk elips, bulat memanjang, bulat telur terbalik, ujung meruncing hingga membundar, dan ukuran: 9 x 4,5 cm. Bentuk bunga seperti trisula dengan bunga bergerombol muncul di ujung tandan, bau menyengat, nektar banyak. Bunga teretak di ujung atau ketiak tangkai/tandan bunga dengan bulir (2-12 bunga per tandan). Daun mahkota berjumlah 4, bewarna kuning pucat-jingga tua, dan berukuran 5-8 mm. Kelopak bunga berjumlah 5 sedangkan benang sari berjumlah 4. Buah berukuran sekitar 1,5 x 2,5 cm agak membulat, berwarna hijau agak keabu-abuan. Permukaan buah berambut halus (seperti ada tepungnya) dan ujung buah agak tajam seperti paruh.
2.2. Fungi Simbion Avicennia sp.
Kondisi ekosistem mangrove yang keras seperti salinitas tinggi, suhu tinggi, fluktuasi permukaan laut serta kondisi tanah anaerobik mendorong tanaman bakau seperti A. marina untuk beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang ekstrim. A. marina beradaptasi dengan menghasilkan berbagai senyawa fenolik yang unik. Senyawa tersebut biasanya dihasilkan dengan bantuan dari mikroorganisme seperti fungi simbion yang bersimbiosis dengan A. marina.
Fungi simbion merupakan organisme eukariotik yang siklus hidupnya berada di jaringan tanaman hidup, tanpa menghasilkan gejala atau efek merugikan pada inangnya (Powthong et al., 2018). Fungi simbion yang paling umum ditemukan termasuk dalam filum Ascomycota, sementara Bharathidasan & Panneerselvam (2011), menemukan bahwa Deuteromycota banyak ditemukan sebagai fungi simbion. Aspergillus dan Penicillium juga banyak ditemukan sebagai fungi simbion. Sedangkan simbion Basidiomycota jarang ditemukan di dalam pohon vaskular (Crozier et al., 2006). Khalil et al., (2020) menemukan fungi simbion dari berbagai sepesies Chaetomium sp. dan spesies lainnya yang bersimbiosis dengan A. marina.
Fungi simbion yang bersimbiosis dengan A. marina diduga memiliki peranan dalam adaptasi A. marina. Fungi simbion yang hidup di bawah jaringan epidermis, menyerap makanan dari inangnya, dapat meningkatkan pertumbuhan inang serta melindunginya dari patogen dengan cara menghambat pertumbuhan patogen dan membantu inang menjadi resisten terhadap patogen sebagai mekanisme pertahanan (Meena et al., 2017). Fungi simbion A. marina merupakan sumber menjanjikan untuk penemuan senyawa seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, fungi Chaetomium sp.
diisolsai oleh Khalil et al., (2020) dari A. marina dapat menghasilkan berbagai senyawa yang memiliki aktifitas Antimicrobial, Antifungal, Antidepressant, Antioxidant, Antiinflammatory, dan Antibacterial.
Tabel 1. Senyawa yang dihasilkan dari ethyl acetate extracts of endophytic fungus Chaetomium sp. (Khalil et al., 2020)
Name of compound Molecular
formula Activity*
5-Isopropyl-2-methylbicyclo [3.1.0] hex2-ene C10H16 Antimicrobial
3-Ethyl-3-methylheptane C10H22 Antifungal
Dodecane, 2,6,11-trimethyl C15H32 Nf
Propane, 1,1,3-triethoxy C9H20O3 Nf
2,6-Octadienal, 3,7-dimethyl-, (Z) C10H16O Antimicrobial
Dodecane, 4,6-dimethyl C14H3O Nf
2-Propenal, 3-phenyl C9H8O Antimicrobial
Caryophyllene C15H24 Antidepressant
Heneicosane C21H44 Antimicrobial
Hexadecane C16H34 Antimicrobial
1,2-Benzenedicarboxylic acid C22H34O4 Antibacterial
n-Hexadecanoic acid C16H32O2 Antioxidant
9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) C18H32O2 Antiinflammatory 1,2-Benzenedicarboxylic acid C22H34O4 Antibacterial Bis(2-ethylhexyl) phthalate C24H38O4 Antifungal
*Dr. Duke’s Ethnobotanical databases; Nf means not found 2.3. Bakteri MDR (Multi Drug Resistant)
Bakteri Multi Drug Resistant (MDR) merupakan bakteri yang telah mengalami resistensi terhadap beberapa jenis antibiotik. Pemakaian antibiotik yang tidak bijaksana menyebabkan bakteri yang semula sensitif terhadap antibiotik menjadi resisten (Lenny &
Zuhra, 2005). Resisstensi bakteri terjadi ketika tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh antibakteri. Rsistensi merupakan mekanisme alami untuk bertahan hidup yang dibagi menjadi resistensi genetik, resistens nongenetik, dan resistensi silang.
Mekanisme resistensi bakteri terhadap antibakteri antara lain: modifikasi reseptor tertentu yang menjadi target antibakteri; bakteri menurunkan permeabilitas membranya sehingga obat sulit masuk ke dalam sel; inaktivasi obat oleh enzim bakteri; mengeluarkan obat melalui efflux pumps; dan meningkatkan produksi enzim yang dihambat oleh antibakteri (Nafriadi & Ganiswara, 2007).
Pengunaan antibiotik yang berlebihan menyebabkan penyebaran resistensi karena kemampuan bakteri untuk merekayasa gen dan penekanan selektif bakteri, menyebabkan drug resistance equation (Dwiprahasto, 2005). Bakteri MDR dapat dibedakan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Kedua kelompok bakteri dibedakan berdasarkan dinding selnya (Wassenaar, 2012). Staphylococcus aureus mewakili Gram positif dan Escherichia coli mewakili Gram negatif merupakan beberapa bakteri yang resisten terhadap beberapa antibiotik (Lestari et al., 2007)
2.4. Uji Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri dilakukan untuk mengetahui kepekaan suatu bakteri patogen. Kepekaan bakteri diketahui dengan mengunakan beberapa metode, seperti metode dilusi, difusi, dan turbidimetri. Metode difusi adalah suatu metode untk mengetahui MIC (minimum inhibitory concentration) dan MBC (minimum bacteria
concentration). Prinsip metode dilusi adalah memberikan bahan antibakteri pada bakteri patogen dengan kadar yang bertahap mengunakan media tumbuh. Alat yang digunakan sebagai tempat media tumbuh biasanya tabung reaksi dan mikrodilution plate. MIC isolat ditentukan berdasarkan kejernihan media tumbuh yang menunjukan tidak terjadinya pertumbuhan bakteri. MBC isolat ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni bakteri (Dzen et al., 2003).
Metode turbidimetri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri. Semakin sedikit jumlah sel yang tumbuh semakin baik senyawa antibakteri dalam menghambat pertumbuhan sel bakteri. Jumlah sel bakteri dihitung dengan cara mengetahui kekeruhan (turbiditas) kultur. Semakin keruh suatu kultur, semakin banyak jumlah sel bakterinya.
Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya mengenai sel maka sebagian cahaya akan diserap dan sebagian cahaya diteruskan. Pengukuran jumlah cahaya mengunakan spektrofotometer. Jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan jumlah bakteri (Irianto, 2002).
Metode difusi merupakan metode yang paling sering digunakan biasanya mengunakan cawan petri dan kertas cakram. Cawan petri yang berisi media agar diinokulasi dengan kultur bakteri patogen. Isolat antibakteri diberikan pada kertas cakram yang kemudian ditempatkan pada permukaan agar. Selama inkubasi, isolat antibakteri mengalami difusi dari cakram menuju agar sehingga membentuk zona hambat.
Terbentuknya zona hambat dengan diameter yang proposional dipengaruhi olah jumlah isolat antibakteri pada cakram, kelarutan isolat, koefisien difusi, dan keefektifan isolat antibakteri (Mardigan et al., 2012).
2.5. Ekstraksi
Eksraksi merupakan proses pemisahan, yaitu suatu metode yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan bahan campuran atau senyawa tunggal yang terkandung dalam bahan alam mengunakan pelarut sehingga didapatkan crude extract (Voight et al., 1995). Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi dapat bersifat polar, semi polar, maupun polar. Menurut Amiarsih et al. (2006) pelarut yang bagus untuk digunakan memiliki beberapa syarat diantaranya tidak toksik, mampu melarutkan senyawa, mudah menguap atau dihilangkan dari ekstrak, murah, dan tidak bereaksi dengan senyawa yang diekstrak.
Senyawa polar yang terkandung dalam bahan alam akan mudah larut dalam pelarut polar. Pelaut polar juga dapat mearutkan atau menyerap senyawa dengan tingkat kepolaran yang lebih rendah. Air, metanol, etanol, dan asam asetat memiliki tingkat kepolaran yang tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pelarut polar. Aseton, etil asetat,
dan kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pelarut polar dan disebut sebagai pelarut semipolar. Pelarut semipolar dapat melarutkan senyawa yang bersifat semipolar dan senyawa nonpolar. Pelarut nonpolar seperti hexsana dan eter baik untuk mengekstrak berbagai jenis minyak (Gupta et al., 2012).
Ekstraksi atau pemisahan dapat menggunakan berbadai metode, diantaranya yaitu:
1. Infusion, pemisahan menggunakan pelarut air dengan memungkinkan bahan alam untuk tetap tersuspensi dalam pelarut dari waktu ke waktu. Proses infus dapat mengukan air dingin atau air mendidih. Untuk menghasilkan hasil infus (fresh infusion) dibutuhkan priode yang singkat sekitar 15 menit (Voight et al., 1995).
2. Dekok, pemisahan dengan air mendidih dalam waktu yang ditentukan kemudian rebusan disaring sehingga didapatkan ekstrak pekat (Voight et al., 1995).
3. Perkolasi, menambahkan pelarut secara kontinyu atau mengunakan pelarut mengalir yang selalu baru. Bahan alam diberi pelarut dan didiamkan selama 4 jam dalam wadah tertutup. Setelah itu, volume pelarut ditambah sehingga terbentuk lapisan dangkal di atas bahan alam dan dibiarkan selama 24 jam. Perkolator kemudian dibuka dan cairan yang terkandung di dalamnya akan menetes perlahan. Pelarut ditambahkan sebanyak ¾ dari volume yang dibutuhkan. Hal yang perlu diperhatikan adalah menghindari kehabisan pelarut yang ada dalam perkolator. Metode perkolasi akan menghasilkan setidaknya 95% jumlah bahan yang dapat diekstraksi (Handa et al., 2008).
4. Sokhletasi, metode ekstraks dengan mengunakan alat ekstraktor sokhlet dan disebut dengan ekstraksi panas kontinyu. Bahan alam ditempatkan pada kantung berpori (thimble) di dalam aparat sokhlet. Pelarut didalam flask dipanaskan sehingga uap mengembun pada kondensor. Ekstrak yang terkondensi akan menetes ke dalam thimble yang mengandung bahan alam yang akan diekstraksi. Ketika pelarut naik ke atas tabung siphon, pelarut akan tersedot ke dalam flask. Proses ini terjadi terus menerus sampai pelarut dalam shiphon menguap semua. Keuntungan dari metode ini adalah dapat menghemat pengunaan pelarut (Handa et al., 2008).
5. Maserasi, perendaman sampel dengan pelarut dalam suhu ruang. Bahan alam direndam ke dalam pelarut untuk mendapatkan filtrat yang mengandung senyawa bioaktif. Perendaman ditempatkan dalam wadah tertutup dibiarakan pada suhu kamar selama 1 hari hingga materi larut kemudian disaring (Handa et al., 2008). Proses perendaman menyebabkan pecahnya dinding sel sampel akibat berbedaan tekanan didalam sel dan diluar sel sehingga metabolit skunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik (Darwis, 2000).
2.6. Isolasi Senyawa Bioaktif
Kompleksitas kimia suatu senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh organisme dibutuhkan metode pemisahan organik untuk mendapatkan senyawa murni. Isolasi diterapkan pada bahan alam yang menghasilkan metabolit skunder untuk menghasilkan senyawa bioaktif. Isolasi senyawa bioaktif dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu ekstraksi, partisi, fraksinasi, dan analisis spektroskopi dari senyawa murni yang diperoleh dilanjutkan dengan uji aktivitas dari senyawa yang dipperoleh (Saleh et al., 2009).
2.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan teknik pemisahan senyawa berdasarkan dua fase yang berbeda mengunakan lapisan pelat tipis sebagai fase diam dan eulen (larutan pengembang) Sebagai fase gerak (Sherma, 2003). Pelat yang digunakan dapat berupa plastik, kaca, maupun alumunium. KLT banyak digunakan untuk tujuan analisis (kualitatif, kuantitatif, dan preparatif) (Gandjar & Rohman, 2007). KLT bisa digunakan untuk analisis ekstrak natural product, uji stabilitas ekstrak/produk, dan untuk kontrol kualitas sampel (Cimpoui, 2006).
Prinsip KLT yaitu eulen akan bergerak (bermigrasi) dengan diserap fase diam karena pengaruh kapilerisasi dengan cara naik (ascending) maupun turun (descending).
KLT mengunakan absorben berukuran kecl dengan diameter partikel 10-20 µm.
Absorben merupakan penyerap/fase diam yang digunakan dalam kromatografi sebagai sarana adsorbsi. Absorben dipilih berdasarkan sifat kepolarannya berikut adalah urutan polaritas absorben: alumina > silika gel > selulosa. Fase gerak yang digunakan merupakan pelarut organik dapat berupa satu pelarut atau campuran dari beberapa pelarut. Pemilihan pelarut menentukan pemisahan senyawa berdsarkan pada kepolaran fase gerak dan sifat senyawa. Senyawa polar akan mudah terelusi oleh eulen yang bersifat polar dan juga sebaliknya. Berikut merupakan urutan polaritas pelarut organik: air >
metanol > asetonitril > etanol > aseton > etil asetat > dietileter > kloroform > benzena >
n-heksana > peroleum eter > parafin cair (Gandjar & Rohman, 2007).
KLT dapat digunakan untuk identtifikasi pemisahan senyawa berdasarkan nilai Rf (retention factor) dan warna spot. Warna spot divisualisasi mengunakan reagen semprot untuk menentukan indikator golongan senyawa (Wettasinghe et al., 2001). Faktor yang mempengaruhi efisiensi pemisahan senyawa mengunakan KLT:
1. Fase diam sebagai absorben harus menunjukkan selektifitas maksimum terhadap senyawa yang akan dipisahkan, sehingga terdapat perbedaan kecepatan elusi.
2. Eulen harus menunjukkan selektifitas maksimum dalam menyerap/membawa senyawa yang dipisahkan.
3. Senyawa bersifat stabil sehingga mudah dipisahkan (Sherma, 2003).
2.6.2. OCC (Open Column Chromatography)
Open Column Chromatography atau kromatografi kolom terbuka adalah bentuk paling awal dari teknik kromatografi yang dahulu digunakan untuk pemisahan sampel dalam jumlah yang besar menggunakan kolom (Gandjar & Rochman, 2007). Prinsip kerja OCC adalah mengunakan kolom berbentuk seperti seperti buret dengan sampel diletakkan diatas fase diam yang telah dilarutkan dengan pelarut, kemudian sampel dialiri eulen (fase gerak) sehingga senyawa akan membentuk layer di fase diam. Berdasarkan kepolaran eulen, senyawa akan terdistribusi mengalir ke bawah sehingga fraksi sampel dapat ditampung mengunakan tabung reaksi secara berurutan. Fase gerak mengalir karena dipengaruhi oleh grafitasi dan tarikan antar molekul saat kolom dibuka dari bawah. Fraksi yang tidak tertahan olah fase diam akan keluar terlebih dahulu dan diikuti oleh fraksi lainnya. Senyawa yang dipisahkan dideteksi profilnya mengunakan KLT. Profil fraksi yang sama diduga merupakan senyawa yang sama sehingga dapat digabungkan.
2.6.3. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi didasarkan atas distribusi partisi sampel (komponen) diantara cairan fase gerak dan fase diam. Prinsip kerja HPLC adalah memisahkan komponen analit (sampel) berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen pada sampel (Gandjar & Rohman, 2007). Kepolaran analit yang lebih mirip dengan fase diam akan tertinggal di fase diam akan bergerak lebih lambat, sedangkan kepolaran yang lebih mirip dengan fase gerak akan terdistrbusi lebih jauh dan bergerak lebih capat. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara disuntikkan. Fase gerak cair dialirkan melalui melalui kolom detektor dengan bantuan pompa. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen karena perbedaan kekuatan interaksi antara komponen dengan fase diam. Komponen yang kurang kuat interaksinya akan keluar lebih lama. Setiap campuran komponen yang keluar dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
2.6.4. NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
NMR bertujuan untuk menentukan sifat fisik dan kimia dari atom atau molekul yang terkandung pada suatu senyawa dengan memanfaatkan sifat magnetik inti atom.
Informasi rinci tentang struktur, dinamika, keadaan reaksi, dan lingkungan kimia molekul diketahui berdasarkan fenomena resonansi magnetik nuklir (Soekamto, 2008).
NMR didasarkan pada penyerapan energi oleh partikel yang sedang berputar di dalam medan magnet yang kuat. Energi yang digunakan dalam pengukuran bergantung
pada jenis inti yang diukur, beberapa pengukuran mengunakan frekuensi 4-600 MHz.
Karakteristik inti atom yang dapat diukur dengan NMR yaitu: bentuk bulat; berputar;
bilangan kuantum spin = ½; jumlah proton dan neutron ganjil (contoh 1H, 19F, 31P, 11B, 13C).
Inti aktif NMR (misalnya 1H atau 13C) di dalam medan magnet terjadi penyerapan pada frekuensi tertentu yang menunjukkan karakteristik suatu isotop. Frekuensi resonansi, energi absorpsi, dan intensitas sinyal berbanding lurus dengan kekuatan medan magnet. Sebagai contoh pada medan magnet 21 telsa proton beresonansi pada 900 MHz. Nilai magnet 21 T dianggap setara dengan magnet 900 MHz meskipun inti yang berbeda beresonansi pada frekuensi yang berbeda.
Road Map Penelitian
Gambar 1. Roadmap Penelitian
Penelitian yang sudah dilakukan / sedang berlangsung
1. Efektivitas Ekstrak Daun Mangrove Avicenia Alba (Tomlinson, 1986) Dalam Mencegah Bakteri Vibrio Harveyi (Johnson & Shunk, 1936) Pada Udang Vaname (Litopenaus Vannamei)
2. Penggunaan Ekstrak Buah Avicennia Alba (Tomlinson, 1986) Sebagai Bahan
Antibakteri Alami Untuk Pengobatan Penyakit Yang Disebabkan Oleh Vibrio Parahaemolyticus (Fujino Et Al., 1951) Pada Udang Vaname (Litopenaeus Vannamei).
3. Kajian Mikroba Endo Simbion Mangrove Avicennia sp. Terhadap Infeksi Penyakit Vibriosis Pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)
Tahun I (2021) Investigasi Senyawa Bioaktif Fungi Simbion Mangrove Avicennia Sp. Terhadap Bakteri Multi Drug Resistant (MDR)
Kegiatan Luaran
1. Publikasi di Jurnal Nasional Sinta 4 (2018- 2019)
1. Seminar nasional 2. Jurnal nasional
terakreditasi ( Sinta 4)
Tahun II (2022) Identifikasi dan karakterisasi senyawa bioaktif mikroba simbion mangrove Avivennia sp. sebagai antibakteri berspektrum luas
1. Prosiding terindeks scopus
2. Jurnal nasional ( Sinta 2) 3. Seminar nasional
Mikroba Simbion mangrove Avicennia sp. sebagaai: Antibakteri Vibriosis dan Multi Drug Resistant (MDR) Kandidat antibiotik baru imunostimulan pada udang
Potensi Obat Antibakteri baru:
Senyawa bioaktif fungi simbion mangrove sebagai kandidat antibiotik baru terhadap bakteri MDR.
2021 (Perairan Lampung dan Lab. Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Lampung)
BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1.Bagan Alir Penelitian (Fishbone Diagram)
KegiatanIndikator
dan Luaran
Profil senyawa boaktif dari fungi simbion mangrove
Avicennia sp.
perairan Lampung sebagai antibakteri terhadap bakteri
Multi Drug Resistant (MDR)
Tahun dan Lokasi
Penelitian
Sampling mangrove Avicennia sp. perairan Lampung
Isolasi fungi simbion mangrove perairan Lampung
Uji antagonis fungi simbion terhadap bakteri Multi Drug Resistant (MDR)
Identifikasi Mangrove
Kultur dan fungi simbion mangrove
Uji aktivitas antibakteri ekstrak fungi simbion mangrove Avicennia sp.
Identifikasi biokimia simbion mangrove
Identifikasi morfologi fungi simbion mangrove
Identifikasi molekuler mikroba simbion mangrove
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji aktivitas antibakteri ekstrak mikroba simbion
Kromatografi Kolom Terbuka / Open Coloum Chromatography (OCC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Didapatkan isolat-isolat murni bakteri dan fungi simbion mangrove perairan Lampung
Didapatkan isolat bakteri dan fungi yang memiliki aktivitas terhadap bakteri MDR pada uji antagonis
Diketahui jenis spesies mangrove
Ekstrak mikroba simbion yang memiliki aktivitas
Terpilihnya satu ekstrak bakteri dan 1 ekstrak fungi simbon
Draf jurnal
Didapatkan data sifat-sifat biokimia bakteri simbion mangrove
Didapatan hasil identifikasi morfologi fungi dibawah mikroskop
Didapatkan hasil identifikasi molekuler, dan pohon filogenetik dari mikroba simbion mangrove
Didapatkan fraksi terbaik dari ekstrak mikroba simbion yang memiliki aktivitas antibakteri MDR
Submitted jurnal nasional terakreditasi
Gambar 2. Fishbone diagram Metode Penelitian
3.2. Pengambilan sampel
Sampel mangrove Avicennia sp. diambil dari perairan Lampung, dengan menggunakan Pisau/cutter. Sampel diambil dan dimasukkan ke dalam plastik kemudian disimpan sementara dalam cool box. Sampel selanjutnya dibersihkan untuk membersihkan bakteri perairan yang menempel pada permukaannya. Selanjutnya dilakukan isolasi fungi simbion mangrove Avicennia sp.
3.3. Isolasi dan purifikasi fungi simbion mangrove
Isolasi dan purifikasi fungi simbion mangrove dilakukan dengan menggunakan metode spread plate (Brock dan Madigan, 1991) dengan menggunakan media Malt Extract Agar (MEA). Media MEA yang merupakan media optimum penumbuh fungi (Radjasa et al., 2007; Fajarningsih et al., 2012).
3.4. Uji antagonis fungi simbion mangrove terhadap bakteri MDR
Uji antagonis antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode overlay (Terkina et al., 2006). Fungi diinokulasi pada cawan petri dan kemudian dilakukan overlay untuk pengujian antagonis terhadap bakteri MDR. Selanjutnya cawan petri dibungkus dengan plastik wrap dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 hari. Pada hari ke-2, bakteri uji yang telah ditanam dan ditumbuhkan selama 1x24 jam pada media cair ZoBell 2216E tawar sambil digoyang menggunakan shaker. Bakteri uji diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam 100 mL soft agar ZoBell 2216E tawar (1% dari total volume soft agar).
Selanjutnya soft agar yang telah berisi bakteri uji dituang ke media padat MEA laut yang telah ditumbuhi isolat fungi simbion mangrove, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1x24 jam. Isolat fungi simbion mangrove yang aktif terlihat dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang kemudian diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong.
3.5. Kultur mikroba endo-simbion
Kultur fungi simbion dilakukan secara bertahap dari volume kecil, sedang hingga volume besar. Kultur fungi simbion mangrove dimulai dengan membuat media cair MEB sebanyak 10 ml pada masing-masing tabung reaksi, dan 100 ml pada masing-masing erlenmeyer. Kemudian pindahkan kira-kira 1 cm miselium fungi yang telah dikultur pada media agar MEA ke dalam tabung reaksi yang berisi media cair MEB tersebut.
Selanjutnya inkubasi selama 2-3 hari. Setelah terbentuknya miselium baru dalam tabung reaksi, kemudian pindahkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 100 ml media cair MEB. Inkubasi selama 5-6 hari, miselium fungi siap dipanen. Kemudian disaring dan diambil miselium yang terbentuk untuk diekstrak dengan menggunakan pelarut organik.
3.6. Ekstraksi
Ekstraksi fungi simbion mangrove dilakukan dengan merendam tiap miselium fungi dengan larutan metanol selama 24 jam sebanyak 3 kali (Trianto et al., 2004). Pada fungi simbion yang diekstrak adalah miseliumnya. Kemudian larutan ekstrak mikroba simbion dievaporasi pada suhu 37 oC hingga pelarut menguap sempurna dan didapatkan crude extract dari mikroba endo-simbion tersebut (Fajarningsih, 2006).
Ekstrak kasar yang telah didapatkan, selanjutnya dikeringkan dengan gas Nitrogen untuk mendapatkan berat kering dari ekstrak. Kemudian ekstrak yang telah diketahui berat keringnya, dilakukan uji aktivitas antibakteri bakteri MDR.
3.7. Uji aktivitas antibakteri MDR
Proses selanjutnya yaitu uji aktivitas antibakteri MDR menggunakan metoda difusi agar (Ozdemir et al., 2004) dengan menyiapkan seri konsentrasi ekstrak fungi simbion masing-masing 15µg/disk, dan 150 µg/disk. Kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri MDR
Bakteri uji yang telah dikultur dalam media agar miring, selanjutnya dipindahkan dengan jarum ose ke dalam media Zobell 2216E cair steril. Kemudian diinkubasi dengan suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya bakteri bisa digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.
3.8. Isolasi dan purifikasi senyawa bioaktif 3.8.1. Separatory Funnel
Separatory funnel disebut juga corong pemisah, adalah alat berbentuk corong dari kaca dan terdapat keran di bagian bawahnya, digunakan dalam ekstraksi cair-cair untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut yang tidak bercampur. Pada penelitian ini digunakan untuk memisahkan ekstrak yang bercampur antara air dan pelarut etil asetat, dengan perbandingan (1:3).
3.8.2. OCC (open column chromatography)
Fraksi terbaik dilihat dengan zona hambat terbesar dan berat ekstrak terbanyak pada tahap separatory funnel dipilih untuk dipisahkan lagi dengan mengunakan metode OCC.
Prosedur OCC diawali dengan penentuan fase gerak dan fase diam. Fase gerak ditentukan dengan metode KLT (kromatografi lapis tipis). KLT mengunakan plat silika dipotong dengan ukuran 1 x 5,5 cm kemudian dibuat jarak 0,5 cm dari salah satu ujung plat sebagai garis awal. Fraksi terpilih di teteskan pada plat KLT kemudian plat dimasukkan pada chamber KLT tertutup yang berisi perbandingan pelarut sebanyak 2 ml. Perbandingan pelarut yang digunakan yaitu MeOH:EtOAc (1:1) dan EtOAc:Hex (7:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3,
1:4, dan 1:5). Pelarut yang menghasilkan pemisahan bercak paling baik digunakan sebagai patokan eulen pengembang pada OCC.
Fraksi yang dihasilkan diuji dengan KLT untuk menentukan kelompok fraksi. Fase gerak KLT adalah eulen yang telah ditentukan sebelumnya. Fraksi yang dihasilkan kemudian diujikan dengan metode antibacterial bioassay guided purification.
3.8.3. HPLC (high performance liquid chromatography)
Purifikasi senyawa terpilih menggunakan HPLC detektor UV dan detektor RI.
Column RP-18 sebagai kolom semi preparatif untuk purifikasi senyawa pemisahan dan analisis mengunakan fase terbalik. MeOH:Air (1:1) digunakan sebagai pelarut dengan flow rate sebesar 1 ml/min. Setiap peak yang terbentuk ditampung pada vial dikeringkan dengan gas nitrogen dan ditimbang beratnya. Hasil diuji dengan KLT untuk melihat kemurniannya. Fase gerak KLT adalah eulen yang telah ditentukan pada tahap OCC.
Visualisasi bercak KLT mengunakan vanilin asam sulfat. KLT yang telah dikering anginkan disemprot dengan vanilin asam sulfat, kemudian dipanaskan di atas hotplate.
Bercak yang terbentuk diamati untuk mengetahui kelompok senyawa. Fraksi yang dihasilkan kemudian diujikan dengan metode antibacterial bioassay guided purification.
3.8.4. Karakterisasi struktur senyawa bioaktif
Identifikasi senyawa antibakteri dilakukan dengan mengunakan NMR (nuclear magnetic resonance). Fraksi yang memiliki zona hambat terbesar dimurnikan dan dikarakterisasi untuk mendapatkan struktur kimia yang terkandung pada senyawa tersebut. Senyawa murni hasil isolasi dan purifikasi dikarakterisasi menggunakan NMR dengan panjang gelombang 400 Hz. Sampel dilarutkan dalam CD3OD (methanol deuterium) kemudian diambil 1 ml dan dimasukkan dalam tabung sampel NMR.
Selanjutnya tabung sampel dimasukkan ke dalam mesin NMR untuk mendapatkan data karbon 13C, proton 1H-HMQC, COSY, dan HMBC.
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil yang dicapai
Inokulasi dan isolasi fungi simbion A. marina didapatkan total 16 isolat fungi dengan morfologi dan karakteristik koloni yang berbeda. Isolat tersebut diekstraksi rendemen dari ekstak fungi mengunakan MeOH yang dilakukan berkisar antara 0,04- 0,85%. Data rendemen disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Isolat fungi simbion tanaman A. marina dan rendemen diekstraksi mengunakan MeOH
Sumber
Isolat Kode Isolat Berat (mg)
Rendemen (%) Miselium Ekstrak*
Akar
01-A 434 3,7 0,85
02-A 2307 2,2 0,10
03-A 458 1,7 0,37
04-A 499 2,1 0,42
05-A 316 1,6 0,51
Daun
06-D 643 1,6 0,25
07-D 587 1,2 0,20
08-D 351 1,3 0,37
09-D 1035 1,71 0,17
10-D 940 4,2 0,45
11-D 437 0,9 0,21
12-D 417 1,2 0,29
Ranting
13-R 411 2,9 0,71
14-R 871 1,8 0,21
15-R 3791 9,1 0,24
16-R 238 0,1 0,04
*Ekstrak yang memiliki aktifitas antibakteri ditandai dengan warna abu-abu.
Ekstra fungi 1%(b/v) diujikan terhadap bakteri MDR dan didapatkan 3 ekstrak (MeOH) yang memiliki aktivitas dengan spektrum luas. Ketiga ekstrak tersebut dapat menghambat pertumbuha bakteri gram positif dan gram negatif. Ukuran zona hambat disajikan pada Tabel 3. Ukuran zona hambat ekstrak jauh lebih kecil dibandingkan dengan kontrol positif (kloramfenikol 0,1%(b/v)). Ekstrak tetap memiliki potensi antibakteri karena dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Tabel 3. Ukuran zona hambat ekstrak terhadap bakteri MDR
Kode Isolat Diameter Zona Hambat (cm)*
Escherichia coli Staphylococus aureus
04-A 7,20±2,29b 4,07±2,08b
10-D 8,17±1,80b 2,87±0,81ab
15-R 6,00±1,68b 5,50±3,33b
Kontrol – 0a 0a
Kontrol + 17,63±2,40c 15,53±1,38c
Tabel 4. Ukuran zona hambat fraksi terhadap bakteri MDR
Kode Fraksi Diameter Zona Hambat (cm)*
Escherichia coli Staphylococus aureus
04-A-1 (Aquades) 0a 0a
04-A-2 (EtOAc) 8,53±5,92b 0,67±0,29ab
10-D-1 (Aquades) 0a 0a
10-D-2 (EtOAc) 9,17±1,46b 1,37±0,76b
15-R-1 (Aquades) 0a 0a
15-R-2 (EtOAc) 0,47±0,15a 1,23±0,97ab
Kontrol - 0a 0a
Kontrol + 16,10±0,46c 15,40±1,47c
*Data sudah dikurangi diameter kertas cakram. Rata-rata ± standar deviasi dari tiga ulangan diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata perlakuan, Duncan’s range P<0,05.
Ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri difraksinasi menjadi fraksi aquades dan fraksi EtOAc. Fraksi EtOAc masih memiliki aktivitas anti bakteri karena dapat membentuk zona hambat terhadap bakteri MDR. Sedangkan fraksi aquades tidak memiliki aktivitas (Tabel 4). Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa antibakteri yang menjadi target penelitian terdapat pada fraksi EtOAc.
a. Identifikasi Molekuler
Isolat fungi yang memiliki aktivitas antibakteri diidentifikasi secara molekuler untuk mengetahui nama spesies fungi. Data hasil blast pada NCBI ditampilkan pada Tabel 5. Didapatkan tiga fungi simbion A. marina dari klas Sordariomycetes (C.
gloeosporioides dan S. brevicaulis) serta klas Eurotiomycetes (A. terreus).
Tabel 5. Nama spesies fungi simbion A. marina yang menghasilkan senyawa antibakteri terhadap bakteri MDR
Kode
Isolat Klas Identifikasi Molekuler
Kemiripan**
GenBank %
04-A Sordariomycetes Colletotrichum gloeosporioides MH156758.1 94,61 10-D Eurotiomycetes Aspergillus terreus MH205918.1 98,78 15-R Sordariomycetes Scopulariopsis brevicaulis MH393398.1 93,88
**NCBI, National Institute for Health, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov)
4.2. Luaran yang dicapai
Luaran yang dicapai berupa draft artikel ilmiah yang akan diterbitkan di jurnal nasional terakreditasi (e-Jurnal Aquasains, Sinta 4) beserta Letter of Acceptance (Lampiran).
DAFTAR PUSTAKA
Amiarsih, D., Yulianingsih & Sabari, S.D. 2006. Pengaruh Jenis dan Perbandingan Pelarut terhadap Hasil Ekstraksi Minyak Atsiri Mawar. J. Hort. 16(4):356-359.
Bharathidasan, R & Panneerselvam, A. 2011. Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Avicennia marina in Ramanathapuram District. Eur J Exp Biol. 1:31- 36.
Chapman, V.J. editor. 1977. Wet Coastal Ecosystems. Ecosystems of the World: 1.
Elsevier Scientific Publishing Company. 428 hal.
Cimpoui, C. 2006. Analysis of Some Natural Antioxidants by Thin-Layer Chromatography and High Performance Thin-Layer Chromatography. J. Liquid Chrom. Tech. 29:1125-1142.
Crozier, J., Thomas, S., Aime, M., Evans, H., & Holmes, K. 2006. Molecular Characterization of Fungal Endophytic Morphospecies Isolated From Stems and Pods of Theobroma cacao. Plant Pathol. 55:783-791.
Darwis, D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium Dalam Penelitian Senyawa Bahan Alam Hayati, Workshop Pengembangan Dumber Daya Manusia Dalam Bidang Kimia Organik Bahan Alam Hayati. FMIPA Universitas Andalas Padang, Padang.
Dwiprahasto, I. 2005. Kebijakan untuk Meminimalkan Resiko Terjadinya Resistensi Bakteri di Unit Perawatan Intensif Rumah Sakit. JMPK. 8(4):177-180.
Dzen, M.S., Roekistiningsih, Santoso, S., & Winarsih, S. 2003. Bakteriologi Medik edisi pertama. Bayumedia Publising, Malang. 373 hal.
Gandjar, I.G. & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
381-382 hal.
Giesen, W., Wulffraat S., Zieren, M., & Scholten, L. 2006. Mangrove Guidebook For Southeast Asia. Rap Publication, Bangkok. 769 hal.
Gupta, A., Naraniwal, M., & Kothari, V. 2012. Modern Extraction Methods for Preparation of Bioactive Plant Extracts. IJANS. 1(1):8-26.
Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo, G., & Rakesh, D.D. 2008. Ektraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants, Trieste. ICS UNIDO, Italy. 266p.
Irianto, K. 2002. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya, Bandung.
Khalil, A.M.A., Abdelaziz, A.M., Khaleil, M.M., & Hashem, A.H. 2020. Fungal Endophytes From Leaves of Avicennia marina Growing in Semi-arid environment as a Promising Source for Bioactive Compounds. Letters in Applied Microbiology.
Kint, A. 1934. De luchtfoto en de topografische terreingesteldheid in de mangrove. De Tropische Natuur. 23:173-189.
Kumala, S. & Fitri, N.A. 2008. Screening of endophytic fungi of Shorea balangeran Korth bark as xylanase source. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 6(1):1-6.
Laport, M.S., Santoso, O.C.S., & Muricy, G. 2010. Marine Sponges: Potential Sources of New Antimicrobial Drugs. Curr. Pharma. Biotechnol. 10(1):8-105.
Lenny, S., & Zuhra, C.F. 2005. Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah (Graptophyllum pictum L. Griff) dengan Metode Brine Shirmp. Jurnal Komunikasi Penelitian. 17(5):1-4.
Lestari, E.S., Severin, J.A., Filius, P.N.G., Kuntaman, K., Duerink, D.O., Hadi, U., Wahjono, H., &Verbugh, H.A. 2007. Antimicrobial Resistance among Commmensal Isolates of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in the Indonesian Population Inside and Outside Hospitals. Eur. J. Clin. Microbiol.
Infect. Dis. 27:45-51.
Mardigan, M.T., Martinko, J.M., Stahl, D.A., & Clark, D.P. 2012. Brock Biology of Microorganisms Thirteenth Edition. Pearson Education Inc publishing as Benjamin Cummings, Sanfransisco. 1043p.
Meena, K.K., Sorty, A.M., Bitla, U.M., Choudhary, K., Gupta, P., Pareek, A., Singh, D.P., Prabha, R., Sahu, P.K., & Gupta, V.K. 2017. Abiotic Stress Responses and Microbe-mediated Mitigation in Plants: The Omics Strategies. Front Plant Sci.
8:172.
Munarsih, T. 2003. Metabolit Sekunder dari Spons sebagai Bahan Obat-obatan. Oseana.
28(3):27-33.
Nafriadi & Ganiswara, S.G., 2007. Farmakologi dan Terapi edisi ke-5. Ganeswara, S, S (Ed). Bagian Farmakologi Kedokteran, UI Press, Jakarta. 686 hal.
Noor, Y.R., Khazali, M., & Suryadiputra, I.N.N. 2016. Panduan Pengenalan Mangrove di Indonesia, Cetakan Kedua. PHKA/WI-IP, Bogor. 220 hal.
Powthong, P., Jantrapanukorn, B., Thongmee, A., & Suntornthiticharoen, P. 2018.
Screening of Antimicrobial Activities of The Endophytic Fungi Isolated From Sesbania grandiflora (L.). Pers.
Prabha, D., Wahidullah, S., Rodrigues C., & Souza, L.D. 2010. The Sponge-Associated Bacterium Bacillus licheniformis SAB1: A Source of Antimicrobial Compounds.
Mar. Drugs. 8:1203-1212.
Saleh, A., Patong, R., & Ahmad, A. 2009. Isolasi, Karakterisasi dan Uji Bioaktifitas Metabolit Skunder dari Spons Agelas clothrides. J. Sains.Teknologi. 9(1):1-7.
Setyawan, A.D. & Winarno, K. 2006. Direct utilization of mangrove ecosystem in Central Java and land use in surrounding: damage and restoration efforts. Jurnal Biodiversitas. 7(3):282-291.
Simpson, A.J., Mc Nally, D.J. & Simpson, M.J. 2011. NMR Spectroscopy in Environmental Research: From Molecular Interactions to Global Processes. Prog.
Nuc. Res. Spectros. 58:97-175.
Sinaga, E., Noverita, & Fitria, D. 2009. Antibacterial activity of endophytic fungi isolated from leaves of galangal (Alpinia galangal SW ). Jurnal Farmasi Indonesia.
4(4):161 -170.
Soekamto, N.H. 2008. Menentukan Struktur Molekul Senyawa melalui Analisis Data Spektroskopi. MIPA Universitas Hasanudin, Makasar. 55p.
Tarman, K., Safitri, D. & Setyaningsih, I. 2013. Kapang Endofit yang Diisolasi dari Rhizophora mucronata dan Aktivitas Antibakterinya. Jurnal Squalen Bulletin of Marine & Fisheries Postharvest & Biotecnology. 8(2):69-76.
Terkina, I.A., V.V. Parfenova, and T.S. Ahn. 2006. Antagonistic activity of actinomycetes of Lake Baikal. Biochem. Microbiol. 42 : 173–176.
Trianto, A., Hermawan, I., Suzuka, T., & Tanaka, J. 2011. Two New Cytotoxic Candidaspongiolides From an Indonesian Sponge. ISRN Pharmaceutics. 6p.
Voight, R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi Edisi kelima. Penerjemah: Soendani, Noerono. Gajah Mada University Press, Yogyakarta.
Wahyono, H. 2007. Peran Mikrobiologi Klinik Pada Penanganan Penyakit Infeksi.
Maalah Pidato Pengukuhan Guru Besar Dalam Ilmu Mikrobiologi Fakulas Kedokteran Universitas Diponegoro. 28 Juli 2007, Semarang.
Wassenaar, T.M. 2012. Bacteria: The Benign, the Bad, and the Beautiful. Jhon Wiley &
Sons, Inc, Kanada. 142p.
Wibowo, J.T. 2015. Resistensi Bakteri Patogen dan Strategi Mengatasi Bakteri Resisten.
Oseana. 40(3):11-17..
Lampiran 1. Draft Publikasi Jurnal
POTENSI SENYAWA BIOAKTIF FUNGI SIMBION MANGROVE AVICENNIA SP. TERHADAP BAKTERI MULTI DRUG RESISTANT (MDR)
Oktora Susanti1, Eko Efendi1, Nissa Karima2
1. Prodi Ilmu Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung.
2. Prodi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Lampung.
Jln. Prof. Dr. Sumantri Brojonegoro No. 1, Bandar Lampung 35145 Indonesia.
*Corresponding author: [email protected].
Abstrak
Bakteri MDR (Multi Drug Resistant) menjadi penyebab utama meningkatnya kematian di negara berkembang. Sekitar 70% bakteri menyebabkan infeksi telah resisten terhadap setidaknya salah satu obat yang paling umum digunakan untuk pengobatan. Salah satu strategi untuk mengatasi resistensi bakteri patogen adalah pengembangan kelas antibiotik baru untuk menghasilkan antibiotik dengan potensi yang tinggi dan spektrum yang lebih luas, namun seminimal mungkin menghasilkan bakteri resisten. Biodiversitas laut seperti fungi simbion Avicennia sp. merupakan salah satu bioprospeksi senyawa bahan alam untuk mengatasi resistensi bakteri patogen dengan strategi mengembangkan kelas antibiotik baru. Perlu dilakukan kajian mengenai potensi fungi simbion Avicennia sp. penghasil antibakteri terhadap bakteri MDR. Inokulasi dan isolasi fungi simbion Avicennia sp. didapatkan total 16 isolat fungi dengan morfologi dan karakteristik koloni yang berbeda. Ekstrak fungi simbion Avicennia sp.
Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus terreus, dan Scopulariopsis brevicaulis memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus aureus dan Escherichia coli Multi Drug Resistant.
Kata kunci: Antibakteri, Avicennia sp., Multi Drug Resistant.
Abstract
MDR (Multi Drug Resistant) bacteria are the main cause of increasing mortality in developing countries. About 70% of the bacteria causing the infection are resistant to at least one of the most commonly used drugs for treatment. One of the strategies to overcome the resistance of pathogenic bacteria is the development of new antibiotic classes to produce antibiotics with high potency and wider spectrum, but minimally produce resistant bacteria. Marine biodiversity such as the symbiont fungi Api-api abang (Avicennia marina) is one of the bioprospections of natural compounds to overcome resistance to pathogenic bacteria with a strategy of developing new antibiotic classes. It is necessary to conduct a study on the potential of the symbiont fungi producing antibacterial against MDR bacteria. Inoculation and isolation of symbiont fungi of api- api abang obtained a total of 16 isolates of fungi with different morphology and colony characteristics. The extracts of the symbiont fungi Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus terreus, and Scopulariopsis brevicaulis have antibacterial activity against Methicillin Resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli Multi Drug Resistant bacteria.
Keywords: antibacterial, Avicennia sp., Multi Drug Resistant
PENDAHULUAN
Mangrove merupakan salah satu ekosistem istimewa dan langka di dunia, karena luasnya hanya menutupi 2% permukaan bumi. Ekosistem mangrove memiliki peran penting dalam bidang ekologi, sosial ekonomi, dan sosial budaya (Setyawan dan Winarno, 2006). Tanaman api-api abang atau dalam bahasa ilmiah Avicennia marina (Forsk.) Vierh (Noor et al., 2016) merupakan salah satu tumbuhan yang terdapat pada ekosistem mangrove. Masyarakat pesisir menggunakan batang dan daun api-api abang sebagai sumber obat- obatan tradisional (Tarman et al., 2013). Penggunaan tanaman tersebut sebagai obat tradisional memungkinkan Avicennia sp. mengandung senyawa bioaktif seperti antibakteri, antijamur, antivirus, antitumor, insektisida, dan aktivitas antileukemia (Soetarno, 2000).
Avicennia sp. diharapkan memiliki metabolit sekunder spesifik berupa senyawa bioaktif, dan
merupakan inang untuk
mikroorganisme (bakteri dan jamur) simbion yang dapat memproduksi metabolit sekunder. Beberapa studi tentang fungi simbion menunjukkan potensi yang menjanjikan terutama di bidang industri farmasi untuk menghasilkan senyawa bioaktif dan penyediaan bahan baku obat (Kumala dan Fitri, 2008). Pemanfaatan fungi simbion sebagai sumber bahan baku obat dinilai lebih hemat secara ekonomi dibandingkan menggunakan tanaman obat (Sinaga et al., 2009).
Bakteri MDR (Multi Drug Resistant) menjadi penyebab utama meningkatnya kematian di negara berkembang. Sekitar 70% bakteri menyebabkan infeksi telah resisten terhadap setidaknya salah satu obat yang paling umum digunakan untuk pengobatan (Prabha et al., 2010).
Menurut Wibowo (2015) salah satu strategi untuk mengatasi resistensi bakteri patogen adalah pengembangan kelas antibiotik baru untuk menghasilkan antibiotik dengan potensi yang tinggi dan spektrum yang lebih luas, namun seminimal mungkin menghasilkan bakteri resisten.
Biodiversitas laut seperti fungi simbion api-api abang merupakan salah satu bioprospeksi senyawa bahan alam untuk mengatasi berbagai penyakit yang mematikan, seperti penyakit infeksi. Hal tersebut dapat dimanfaatkan untuk melaksanakan strategi dalam mengatasi resistensi
bakteri patogen dengan
mengembangkan kelas antibiotik baru.
Avicennia sp. merupakan sumber menjanjikan untuk penemuan senyawa aktif. Fungi Chaetomium sp.
diisolsai dari api-api abang dapat menghasilkan berbagai senyawa yang memiliki aktifitas antimicrobial, antifungal, antidepressant, antioxidant, antiinflammatory, dan antibacterial (Khalil et al., 2020).
Aktifitas antibacterial dari fungi yang bersimbion dengan api-api abang memungkinkan fungi simbion dapat menghasilkan antibakteri untuk mengatasi bakteri MDR.
Berbagai strategi telah diterapkan dalam mendeteksi bahan kimia aktif seperti antibakteri dari suatu sampel senyawa. Metode untuk penilaian aktifitas antibakteri seperti metode uji in-vitro dan in-silico.
Metode in-silico memiliki kelebihan yaitu lebih murah dan lebih cepat untuk mendapatkan hasil pencarian senyawa aktif yang diinginkan. Pendekatan komputasi untuk penelitian sains seperti prediksi senyawa aktif sering digunakan seiring dengan pendekatan zaman (Makatita et.al., 2020). Oleh karena hal tersebut, perlu dilakukan kajian mengenai potensi fungi simbion api-api abang penghasil antibakteri terhadap bakteri MDR yang dikaji dengan metode uji in-vitro dan in- silico. Metode in-vitro bertujuan mencari fungi simbion api-api abang yang mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri MDR. Kumpulan senyawa dari fungi simbion yang mempunyai aktivitas terhadap bakteri MDR diuji dengan metode in-silico untuk mengetahui kemampuan senyawa sebagai antibakteri.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada Juni 2021. Sampel api-api abang diambil dari Pulau Pasaran Kelurahan Kota Karang, Kecamatan Teluk Betung Timur, Kota Bandar Lampung.
Percobaan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung.
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian yaitu alat bedah, cawan petri, incubator, jarum ose, tabung reaksi, vortex, mikropipet, drigalski glass, kertas cakram, erlenmeyer, kertas saring, round bottom flask, rotary evaporator, vial, spatula, pipet tetes, separatory funnel, GC-MS. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu sampel api- api abang, NA (Nutrien Agar), MEA (Malt Extract Agar), MEB (Malt Extract Broth), Bakteri MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), Escherichia coli MDR, alkohol 70%, kloramfenikol, aquades steril, MeOH (CH3OH), dan EtOAc.
Metode Penelitian
Pendekatan riset empirik dengan metode eksploratif yang digunakan pada saat skrining bertujuan untuk menggali hal yang mempengaruhi terjadinya sesuatu. Metode isolasi, purifikasi, dan bioassay secara in-vitro menggunakan metode eksperimental laboratoris sedangkan metode in-silico digunakan untuk menyelidiki kemungkinan sebab akibat pada perlakuan secara komputasi.
Sedangkan data penelitian didapat dengan pengamatan sistematis dari objek yang diteliti dan data dianalisis secara deskriptif.
Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian seperti yang telah dilakukan pada Maisaroh (2014), dengan modifikasi. Setiap proses penelitian menerapkan protokol kesehatan.
