HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Uji Genotip MDROs dengan polymerase chain reaction (PCR)
4.2.1 Gen CTX-M
Analisis gen CTX-M dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen ini pada 85 isolat klinis bakteri. Pada penelitian ini gen CTX-M ditemukan pada kedua jenis bakteri yaitu Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae dengan persentase 72,94%. Hasil analisis PCR pada isolat bakteri dapat dilihat pada lampiran 4, dan juga ditampilkan pada pola pita DNA dengan ukuran pita amplikon 539bp seperti pada Gambar 1 berikut.
Gambar 1. Pola Pita DNA Gen CTX-M pada Isolat MDROs.
Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017.
Keterangan : K- (Isolat Non-ESBL), 57 (11926 E. coli), 58 (11688 K. pneumoniae), 59 (11779 E. coli), 60 (12006 K. pneumoniae), 61 (11901 K. pneumoniae), 62 (11764 E. coli), 63 (11765 E. coli), 64 (12178 E. coli), 65 (12156 E.coli), 66 (12145 K. pneumoniae), 67 (12159 K. pneumoniae), 68 (12102 K.pneumoniae), 69 (12121 K. pneumoniae) dan 70 (12117 K.pneumoniae).
Dari Gambar 1 diatas dapat dilihat bahwa munculnya pola pita DNA menujukkan adanya gen CTX-M pada isolat bakteri, sedangkan isolat bakteri yang tidak memiliki pola pita DNA maka isolat bakteri tersebut tidak mengandung gen CTX-M. Hal ini membuktikan bahwa primer yang telah didesain oleh Hout et.al (2015) dapat mendeteksi keberadaan gen CTX-M pada bakteri dengan amplikon 539bp. Pada penelitiannya, persentase gen ini mencapai
Gen bla CTX-M 539bp 400bp
1000bp
50% dari isolat klinis koleksi Surgical Center Cambodia. Menurut Bradford (2001) keberadaan gen CTX-M pada bakteri bertanggungjawab dalam menghidrolisis antibiotika sefotaksim, resistensi dapat meluas pada jenis antibiotika sefalosporin lainnya. Hal ini terbukti dari hasil uji kepekaan antimikroba secara fenotip menujukkan bahwa seluruh isolat resisten terhadap antibiotika sefotaksim dan juga generasi III sefalosporin lainnya seperti seftazidim dan seftriakson. Bahkan seluruh isolat juga resisten terhadap sefalosporin generasi IV yaitu sefepim.
Escherichia coli yang merupakan produsen CTX-M yang menjadi jenis gen yang umum. Hasil penelitian menujukkan bahwa Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae memiliki persentase yang tinggi terhadap keberadaan gen CTX-M. Menurut (Paterson et.al, 2005) gen resisten jenis CTX-M gen dominan di Eropa, sementara di negara lain gen ESBLs yang lebih bervariasi. Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa jenis ESBL diproduksi oleh kedua strain ini dan prevalensi meningkat dengan munculnya gen jenis CTX-M. Beberapa peneliti telah menyarankan bahwa saat ini gen ESBL jenis CTX-M paling sering di seluruh dunia dibandingkan dengan jenis SHV dan TEM.
Dalam beberapa tahun terakhir, munculnya varian baru pada mikroorganisme penghasil ESBL, terutama CTX-M telah menyarankan keterlibatan co-resistance terhadap golongan obat lain selama kondisi endemik.
Kehadiran co-resistance ini disebabkan transmisi yang berbeda pada jenis gen resisten dalam klon yang sama (Livermore et.al, 2007). Beberapa studi menunjukkan bahwa genotip blaCTX-M biasanya ditemukan pada besar plasmid yang sering membawa gen resistensi pada agen antimikroba lainnya termasuk
aminoglikosida, florokuinolon, klorampenikol, tetrasiklin terutama blaOXA dan
blaTEM (Kanj et.al, 2008).
4.2.2 Gen SHV
Analisis gen SHV dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen ini pada 85 isolat klinis bakteri. Hasil penelitian menujukkan bahwa gen SHV ditemukan pada seluruh isolat bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumonia. Analisis PCR terhadap gen SHV dapat dilihat pada lampiran 4 dan juga ditampilkan pola pita DNA dengan ukuran amplikon 141bp seperti pada Gambar 2 berikut.
Gambar 2. Pola Pita DNA Gen SHV pada Isolat MDROs Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017.
Keterangan : K- (Isolat Non-ESBL), 29 (11474 K. pneumoniae), 30 (11527 K. pneumoniae), 31 (11546 K. pneumoniae), 32 (11583 K. pneumoniae), 33 (11665 K. pneumoniae), 34 (11417 K. pneumoniae), 35 (11418 K. pneumoniae), 36 (11112 K. pneumoniae), 37 (10965 K. pneumoniae), 38 (11136 K. pneumoniae), 39 (11184 K. pneumoniae), 40 (11216 K. pneumoniae), 41 (11169 K. pneumoniae) dan 42 (11021 K. pneumoniae),
Munculnya pita DNA dari hasil elektroporesis menujukkan bahwa seluruh dideteksi adanya gen SHV. Hasil deteksi gen SHV memiliki persentase yang lebih tinggi ditemukan dibandingkan dengan tipe gen ESBLs lainnya. Hasil penelitian menujukkan bahwa persentase gen SHV mencapai 100% artinya seluruh isolat bakteri memiliki gen ini. Hal ini membuktikan bahwa primer yang telah didesain oleh Hout et.al (2015) spesifik mendeteksi keberadaan gen SHV pada bakteri dengan amplikon 141bp. Pada penelitiannya, persentase gen ini mencapai 100%
pada bakteri Klebsiella pneumoniae dari isolat klinis koleksi Surgical Center Cambodia. Hasil penelitian ini mengkonfimasi bahwa gen SHV adalah jenis gen terbanyak yang ditemukan pada galur ESBLs lainnya. Jika dibandingkan dengan
Gen blaSHV 141bp 100bp
200bp
penelitian sebelumnya oleh Yuwono (2013), dimana hanya 42,67% dari 75 isolat yang memiliki gen SHV. Distribusi terbanyak adalah pada Klebsiella pneumoniae 20 (62,50%) dan pada Escherichia coli 7 (21,86%). Maka persentas gen ini sangat tinggi, menunjukkan tingginya keberadaan gen SHV pada kedua jenis bakteri yang menginfeksi pasien di RSUP Haji Adam Malik Medan. Hal ini menjadi suatu data penting bagi paramedis untuk menghindari transmisi bakteri yang memiliki gen MDROs seperti SHV.
SHV tipe-1 beta-laktamase yang ditemukan pertama kali pada Klebsiella pneumoniae merupakan enzim yang dikode pada plasmid yang dapat menyebabkan terjadinya resistensi terhadap penisilin dan sefalosporin generasi I.
Gen SHV adalah gen mutasi dari TEM yang menyebabkan kemampuan untuk menghidrolisis meningkat hingga pada generasi III sefalosporin dan monobaktam.
Pada penelitian ini Gen SHV ditemukan pada isolat Escherichia coli, sementara berdasarkan asalnya gen SHV berasal dari bakteri Klebsiella pneumoniae.
Kemungkinan gen resistensi ini diperoleh Escherichia coli dari transfer gen horizontal, dan juga mutasi titik tertaut di patogen genom pada tingkat sekitar 1 di 108 per replikasi kromosom. Dapat disimpulkan bahwa gen SHV pada Escherichia coli bukan gen bawaan tapi gen dapatan. Hingga saat ini bahwa gen SHV telah mengalami mutasi menjadi 36 tipe ESBL (Rupp et.al, 2003).
Pada beberapa galur Klebsiella pneumoniae, gen blaSHV atau gen yang bersangkutan dengannya (related gene) terintegrasi dalam kromosom (Bermudes et.al, 1997). Mayoritas varian SHV yang memiliki fenotif ESBLs menunjukkan adanya subtitusi glisin menjadi serin pada posisi asam amino ke-238. Residu serin pada posisi 238 merupakan penentu efisiensi kemampuan menghidrolisis
ceftazidime, sedangkan residu lisin 240 merupakan penentu efisiensi kemampuan menghidrolisis sefotaksim (Cotton et.al, 2000).
4.2.3 Gen TEM
Pada penelitian ini gen resisten jenis TEM ditemukan pada beberapa isolat bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumonia. Analisis PCR terhadap gen TEM dapat dilihat pada lampiran 4 dan juga ditampilkan pola pita DNA dengan ukuran amplikon 972bp seperti pada Gambar 3 berikut.
Gambar 3. Pola Pita DNA Gen TEM pada Isolat MDROs. bakteri yang tidak terdapat pola pita DNA menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak memiliki gen TEM. Pada penelitian ini jenis gen TEM yang ditemukan adalah TEM-1, dimana gen ini paling umum dijumpai beta-laktamase pada bakteri gram negatif. Menurut Rupp et.al, (2003) hingga 90% dari bakteri Escherichia coli resistensi terhadap ampisilin karena keberadaan gen TEM-1. Kehadiran gen ini juga bertanggungjawab atas resistensi penisilin dan sefalosporin generasi I.
Meskipun TEM-jenis beta-laktamase yang paling sering ditemukan di Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae, mereka juga ditemukan di spesies lain bakteri gram negatif dengan meningkatnya frekuensi (Bonomo et.al, 2005).
Gen bla TEM 972bp 1000bp
300bp
Substitusi asam amino yang bertanggung jawab untuk ESBLs fenotip klaster di sekitar lokasi aktif enzim dan mengubah konfigurasi, memungkinkan akses ke substrat oxymino beta-lactam. Membuka situs aktif untuk substrat beta-lactam juga biasanya meningkatkan kerentanan enzim beta-laktamase inhibitor, seperti asam klavulanat. Substitusi asam amino tunggal pada posisi 104, 164, 238, dan 240 menghasilkan ESBLs (Thenmozhi et.al, 2014).
Strain Klebsiella pneumoniae merupakan strain yang membawa gen TEM dan SHV. Keberadaan gen TEM pada plasmid R akan menyebakan resistensi terhadap ampisilin, penisilin, sefalosporin generasi I, dan dan dapat dihambat oleh asam klavulanat. Hal ini sesuai dengan hasil uji kepekaan antimikroba yang menyebabkan resistensi tinggi terhadap antibiotik amoksilin dan sefalosporin.
Gen TEM merupakan gen utama yang menyebabkan ESBLs dan memiliki kemampuan menghidrolisis spektrum luas dari golongan sefalosporin dan dapat meningkat resistensi terhadap aztreonam (Bradford, 2001).
Secara epidemiologi penyebaran ESBL di berbagai negara di dunia berbeda– beda. Di Amerika latin 42,7%, Amerika Utara 5,8%, Eropa 2% - 31%
(Tasima, 2012). Pada negara-negara Asia prevalensi ESBLs yang diproduksi oleh Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae bervariasi antara 4,8% - 12%
(Sharma et.al, 2009). Di Indonesia prevalensi infeksi oleh bakteri penghasil ESBLs mencapai 29% pada Escherichia coli dan 36% pada Klebsiella pneumoniae. Penelitian terdahulu oleh Yuwono (2013) pada RSUP Moh. Hoesin Palembang Sumatera Selatan, berdasarkan konfirmasi gen SHV, prevalensi ESBLs mencapai 42,67%. Pada penelitian ini prevalensi gen SHV pada RSUP Haji Adam Malik dengan total 85 isolat mencapai 100%. Hasil penelitian ini
memperlihatkan bahwa tingginya distribusi gen SHV pada bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae, sehingga peran paramedis sangat penting untuk menghindari transmisi dan infeksi kedua bakteri ini.