DETEKSI GEN RESISTEN CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 PADA ISOLAT KLINIS BAKTERI Escherichia coli DAN Klebsiella
pneumoniae YANG TERGOLONG MULTIPLE DRUG RESISTANT ORGANISMS
TESIS
OLEH :
MIRZAN HASIBUAN 157030003
PROGRAM MAGISTER BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
DETEKSI GEN RESISTEN CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 PADA ISOLAT KLINIS BAKTERI Escherichia coli DAN Klebsiella
pneumoniae YANG TERGOLONG MULTIPLE DRUG RESISTANT ORGANISMS
TESIS
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister Sains dalam Program Studi Biologi pada Sekolah Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara
OLEH :
MIRZAN HASIBUAN 157030003
PROGRAM MAGISTER BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
PERNYATAAN ORISINALITAS
DETEKSI GEN RESISTEN CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 PADA ISOLAT KLINIS BAKTERI Escherichia coli DAN Klebsiella
pneumoniae YANG TERGOLONG MULTIPLE DRUG RESISTANT ORGANISMS
TESIS
Dengan ini saya menyatakan bahwa saya mengakui semua karya tesis ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali kutipan dan ringkasan yang tiap satunya telah dijelaskan sumbernya dengan benar.
Medan, 21 Agustus 2017
Mirzan Hasibuan 157030003
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademika Universitas Sumatera Utara, saya yang bertanda tangan dibawah ini :
Nama : Mirzan Hasibuan
NIM : 157030003
Program Studi : Magister Ilmu Biologi Jenis Karya Ilmiah : Tesis
Demi pembangunan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk diberikan kepada Universitas Sumatera Utara Hak Bebas Royalti Non-Eksklusif (Non-Exclusive Royalti Free Ringht) atau Tesis saya yang berjudul :
DETEKSI GEN RESISTEN CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 PADA ISOLAT KLINIS BAKTERI Escherichia coli DAN Klebsiella pneumoniae YANG
TERGOLONG MULTIPLE DRUG RESISTANT ORGANISMS
Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan) dengan Hak Bebas Royalti Non-Eksklusif (Non-Exclusive Royalti Free Ringht) ini, Universitas Sumatera Utara berhak menyimpan, mengalih media, mengelola dalam bentuk data-base merawat dan mempublikasi tesis saya tanpa meminta izin dari saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis, pemegang dan pemilik Hak Cipta.
Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Medan, 21 Agustus 2017
Mirzan Hasibuan 157030003
Tesis di uji pada Tanggal 20 Juli 2017
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc
Anggota : 1. dr. R. Lia Kusumawati, M.Biomed, Sp.MK (K), Ph.D 2. Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed
3. Dr. Saleha Hannum, M.Si
Tanggal Lulus : 20 Juli 2017
RIWAYAT HIDUP
Nama Lengkap : Mirzan Hasibuan
Tempat dan Tanggal Lahir : Paringgonan, 08 Agustus 1991 Jenis Kelamin : Laki-laki
Agama : Islam
Alamat : Jl. Selamat Gg Kecil No.19-C Kelurahan Kecamatan Durian Medan Timur
HP : 085261338020
RIWAYAT PENDIDIKAN
Tahun 1997-2003 : SD Negeri 144408 Tapian Jorbing Kab. Padang Lawas Tahun 2003-2006 : SMP Negeri 1 Ulu Barumun Kab. Padang Lawas Tahun 2006-2009 : SMA Negeri 1 Barumun Kab.Padang Lawas Tahun 2009-2013 : S1 Biologi, Peminatan Biologi Kesehatan Fakultas Biologi Universitas Medan Area Tahun 2015-2017 : S2 Biologi, Peminatan Mikrobiologi FMIPA Universitas Sumatera Utara
RIWAYAT PEKERJAAN
Tahun 2014-2017 : Staff Riset Departemen Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Tahun 2014-2015 : Research Assistant WESTAT 1600 Research USA Tahun 2017-Sekarang : Staff Riset di Clinical Research Unit (CRU) dan Unit Laboratorium Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Universitas Sumatera Utara
DETEKSI GEN RESISTEN CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 PADA ISOLAT KLINIS BAKTERI Escherichia coli DAN Klebsiella
pneumoniae YANG TERGOLONG MULTIPLE DRUG RESISTANT ORGANISMS
ABSTRAK
Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae adalah bakteri gram negatif pada kelompok Enterobacteriaceae yang dapat menyebabkan infeksi seperti septikemia, infeksi saluran kemih, pneumonia, meningitis dan gastroenteritis. Terapi antibiotika menjadi masalah besar yang dihadapi karena bakteri Multiple Drug Resistant Organisms (MDROs). MDROs terjadi karena adanya gen pengkode resistensi seperti CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 yang menyebabkan bakteri dapat memproduksi enzim Extended Spectrum Beta-Lactamase. Penelitian bertujuan untuk mendeteksi gen resisten CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 pada isolat bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae yang tergolong MDROs dan mengetahui pola kepekaan antimikroba. Penelitian dilaksanakan di Instalasi Laboratorium Diagnostik (Unit Mikrobiologi Klinik) RSUP Haji Adam Malik Medan, Laboratorium Terpadu dan Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran USU Medan. Identifikasi Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae MDROs dengan Vitek 2 Compact dan adanya gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA- 48 diamati dengan metode PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari total 85 sampel terdapat 62 (72,94%) isolat bakteri yang membawa gen CTX-M, dimana 31 (36,47%) Escherichia coli dan 31 (36,47%) Klebsiella pneumoniae.
Seluruh isolat terdeteksi gen SHV, dimana 41 (48,23%) Escherichia coli dan (51,77%) Klebsiella pneumoniae 44. Gen TEM 73 (85,88%), dimana 37 (43,52%) Escherichia coli dan 36 (42,35%) Klebsiella pneumoniae. Gen OXA-48 dideteksi pada 15 (17,64%), dimana 3 (3,52%) Escherichia coli dan 12 (14,11%) Klebsiella pneumoniae. Dari hasil penelitian antibiotika yang disarankan untuk terapi MDROs adalah imipenem, meropenem, fosfomisin dan amikasin.
Kata Kunci : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, MDROs, ESBLs, Gen.
DETECTION OF RESISTANT GENE CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 OF BACTERIA CLINICAL ISOLATE Escherichia coli AND Klebsiella
pneumoniae CATEGORY MULTIPLE DRUG RESISTANT ORGANISMS
ABSTRACT
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are gram negative bacteria in the group of Enterobacteriaceae that cause infections such as septicemia, urinary tract infections, pneumonia, meningitis and gastroenteritis. Antibiotic therapy faced a big problem since many bacterium are Multiple Drug Resistant Organisms (MDROs). MDROs occur because the gene encoding resistance such as CTX-M, SHV, TEM and OXA-48 which causes the bacteria to produce enzymes such as Extended Spectrum Beta-Lactamase. The study aims are to detect the CTX-M, SHV, TEM and OXA-48 resistant genes on the Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae classified as MDROs, and the pattern determine of antimicrobial susceptibility. This study was conducted in the Installation Diagnostic Laboratory (Unit of Clinical Microbiology) Haji Adam Malik Hospital Center, Integrated Laboratory and Deptartement Microbiology, Faculty of Medicine, USU Medan. Identification of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae MDROs was done using Vitek 2 Compact, and the presence of CTX- M, SHV, TEM and OXA-48 genes was observed using PCR method. The results showed total of 85 sampels that 62 (72.94%) of bacteria isolate bearing CTX-M genes, which 31 (36.47%) was in Escherichia coli and 31 (36.47%) was in Klebsiella pneumonia. SHV genes were detected in all isolat, which 41 (48.23%) was in Escherichia coli and 44 (51.77%) Klebsiella pneumonia. TEM genes were detected is 73 (85.88%) isolates, which 37 (43.52%) was in Escherichia coli and 36 (42.35%) was ins Klebsiella pneumonia.OXA-48 genes were detected is 15 (17.64%), which 3 (3.52%) is was Escherichia coli and 12 (14.11%) was in Klebsiella pneumoniae. From this study antibiotics were recommended for therapy of MDROs is imipenem, meropenem, fosfomycin and amikacin.
Key Words : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, MDROs, ESBL, Gene.
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberiksan berkahnya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis ini.
Selama melakukan penulisan tesis ini, penulis banyak memperoleh moril dan material dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Syafrudin, M.Biomed, selaku ketua program studi S2 dan S3 Biologi Sekolah Pasca Sarjana Universitas Sumatera Utara.
2. Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc, selaku pembimbing I yang membimbing dan mengarahkan penulisan tesis ini.
3. Ibu dr. R Lia Kusumawati, M.Biomed., Sp.MK (K) selaku pembimbing II yang membimbing dan mengarahkan penulisan tesis ini.
4. Bapak Komisi Penguji Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed dan Ibu Dr.
Saleha Hannum, M.Si atas kritik dan saran yang diberikan demi kesempurnaan penelitian ini.
5. Bapak dr. Jamaluddin, Sp.PA (K) selaku kepala Instalasi Laboratorium Diagnostik RSUP Haji Adam Malik Medan yang membantu izin penelitian.
6. Seluruh Staff Pengajar S2 Biologi Sekolah Pasca Sarjana USU.
7. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Darwin Hasibuan, Ibunda Irmawati, abang Dedi Saputra, kakak Eri Yanti, Noni Asridawati, dan adek Miska Donna, Rezki Satria yang selalu memberikan motivasi dan doa.
8. Teman-teman seperjuangan Program Studi Magister Biologi USU stambuk 2015 khususnya konsentrasi Mikrobiologi ; Syahdiana, Gaby dan Melia Sari.
Penulis menyadari tesis ini masih banyak memiliki kekurangan, namun untuk itu kritik dan saran sangat penulis harapkan. Penulis berharap semoga tesis ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
(Mirzan Hasibuan)
DAFTAR ISI
ABSTRAK ... i
ABSTRACT ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
DAFTAR ISI ... iv
DAFTAR TABEL ... vi
DAFTAR GAMBAR ... vii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 4
1.3 Tujuan Penelitian ... 5
1.4 Manfaat Penelitian ... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Antibiotika ... 6
2.2 Penggolongan Antibiotika ... 7
2.3 Mekanisme Terjadinya Resistensi Antibiotika ... 9
2.4 Multiple Drug Resistant Organisms (MDROs) ... 10
2.5 Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBLs) ... 11
2.6 Bakteri Penghasil ESBLs ... 13
1. Bakteri Escherichia coli ... 13
2. Bakteri Klebsiella pneumoniae ... 14
2.7 Tipe Gen ESBLs ... 15
2.8 Deteksi Gen ESBLs ... 17
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan tempat Penelitian ... 21
3.2 Alat dan Bahan ... 21
3.3 Metode Penelitian ... 21
3.4 Teknik Pengambilan Sampel ... 22
3.5 Preparasi dan Kultivasi ... 22
3.6 Identifikasi dan Uji Kepekaan Antimikroba ... 23
3.7 Deteksi Gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA ... 24
1. Isolasi DNA ... 24
2. Pengukuran Konsentrasi DNA ... 24
3. Deteksi Gen ... 24
4. Elektroporesis ... 25
3.8 Analisis Data ... 26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Fenotip MDROs dengan Vitek 2 Compact ... 27
4.2 Uji Genotip MDROs dengan PCR ... 30
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan ... 43
5.2 Saran ... 43
DAFTAR PUSTAKA ... 44
LAMPIRAN ... 49
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Primer Spesifik Gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 ... 25
Tabel 2 Persentase Jenis Bakteri MDROs secara Fenotip ... 27
Tabel 3 Persentase Sensitivitas Antimikroba ... 29
Tabel 4 Persentase Genotip CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 ... 30
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Pola Pita DNA gen CTX-M pada Isolat MDROs ... 33
Gambar 2 Pola Pita DNA gen SHV pada Isolat MDROs ... 35
Gambar 3 Pola Pita DNA gen TEM pada Isolat MDROs ... 37
Gambar 4 Pola Pita DNA gen OXA-48 pada Isolat MDROs ... 39
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil Identifikasi Jenis Bakteri, Uji Kepekaan
Antimikroba, Fenotip MDROs dan Genotip MDROs ... 49
Lampiran 2 Daftar Singkatan ... 52
Lampiran 3 Dokumentasi Penelitian ... 53
Lampiran 4 Hasil Elektroporesis Gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 ... 57
Lampiran 5 Ethical Clearance dan Izin Penelitian ... 60
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri Klebsiella pneumoniae dan Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae bersifat patogen. Beberapa penyakit infeksi yang disebabkan oleh kedua bakteri ini seperti septisemia, infeksi saluran kemih, pneumonia, meningitis, gastroenteritis dan penyakit lainnya. Kedua bakteri ini adalah sumber infeksi tersering di Rumah Sakit, dimana bakteri ini menjadi patogen utama pada pasien rawat inap dengan sistem kekebalan tubuh yang lemah, kekurangan gizi, trauma dan operasi. Bakteri ini secara mudah menyebar melalui tangan, air, makanan terkontaminasi dan alat kesehatan (Brooks et.al, 2007).
Saat ini, hal yang dilakukan oleh paramedis untuk menyelamatkan pasien yang terinfeksi Klebsiella pneumoniae dan Escherichia coli adalah terapi antimikroba. Antimikroba yang sering digunakan sebagai resep rutin adalah antibiotika golongan sefalosporin. Antibiotika ini merupakan golongan betalaktam, yang berasal dari fungus Cephalosporium acremonium yang diisolasi pada tahun 1948 oleh Brotzu (Jawetz dkk, 2005). Antibiotika ini menjadi bagian utama dari formulasi antibiotik di rumah sakit di negara-negara maju. Selain itu antibiotika ini dipilih karena reaksi alergi yang lebih rendah dan toksisitasnya relatif rendah (Dancer, 2001).
Kemampuan spektrum luas dari sefalosporin mendorong pertumbuhan lebih cepat beberapa mikroorganisme yang tidak berhasil dihilangkan atau dihambat oleh terapi. Organisme ini tidak hanya memiliki potensi patogen,
mereka juga menjadi resisten terhadap antibiotika (Scholz, 2004). Seiring dengan penggunaan antibiotika dalam jangka panjang untuk pengobatan maka tentu akan menyebabkan timbulnya resistensi. Seperti pada generasi ketiga memiliki rentang paparan gram negatif lebih luas, resistensi terhadap sefalosporin generasi ketiga tentu menjadi sangat serius karena akan menyebabkan resisten terhadap generasi berikutnya. Berdasarkan pola kuman di RSUP Haji Adam Malik Medan antibiotika golongan beta laktam sudah mengalami resistensi terhadap beberapa organisme terutama bakteri Klebsiella pneumoniae dan Escherichia coli.
Prevalensi resistensi antibiotika meningkat setiap tahun, seperti survei yang dilakukan oleh Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pada tahun 2013 di Amerika Serikat, setiap tahun setidaknya 2 juta manusia terkena infeksi bakteri yang resisten terhadap satu atau beberapa jenis antibiotika. Hal ini semakin diperparah dengan data yang menunjukkan bahwa sekitar 23.000 orang meninggal setiap tahunnya karena mendapat infeksi bakteri yang telah resisten terhadap antibiotika (CDC, 2013). Di Indonesia terjadi resistensi antibiotika, berdasarkan penelitian di Jakarta, Palembang, Tangerang yaitu penisilin (87,3%), tetrasiklin (88,9%), Siprolaksasin (55,8%), ofloksasin (60,6%), levoflokasin (77,0%) dan kanamisin (30,3%) (Kemenkes RI, 2014).
Resistensi antibiotika juga terjadi pada Rumah Sakit di Medan, berdasarkan persentase data pola kuman Rumah Sakit Umum Pusat Haji Adam Malik Medan pada Januari-Juni tahun 2016 yaitu Extended Spectrum Beta- Lactamase (ESBL) positif terdapat 570 (50%) dengan distribusi Escherichia coli 243 (43%), Klebsiella pneumonia 223 (39%) dan 18% lainnya adalah bakteri kelompok Enterobacteriaceae. Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi Multiple
drug resistant organisms (MDROs). Beberapa istilah yang digunakan untuk kasus MDROs yaitu methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), methicillin resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE), vancomycin resistant enterococci (VRE), dan MDR Acinetobacter baumannii complex dan MDR Pseudomonas aeruginosa (Christopher, 2012).
Multiple drug resistant organisms (MDROs) merupakan istilah yang digunakan untuk bakteri yang telah resisten terhadap minimal satu antimikroba dari ≥3 golongan antimikroba. Bakteri yang telah MDR dapat berpindah dari pasien melalui tangan paramedis yang kurang aseptik.Seperti adanya luka terbuka pada kulit, penggunaan kateter dan perangkat invasif lainnya. Resistensi antibiotika terjadi akibat penggunaan antibiotika yang tidak rasional, penggunaan jangka panjang dan terpapar dengan pengaturan perawatan kesehatan. Infeksi akibat resistensi antibiotika menjadi penyebab utama morbiditas dan mortalitas pada masyarakat umum. Sebagian besar mortalitas terkait dengan resistensi antibiotika pada sarana pelayanan kesehatan umum seperti rumah sakit (Magiorakos et.al, 2012).
Resistensi terhadap golongan sefalosporin dapat disebabkan oleh kemampuan bakteri Enterobacteriaceae mengeluarkan enzim beta-laktamase dimana enzim ini dikode oleh gen R (resisten) pada pada plasmid bakteri. Gen yang pertama kali dimediasi beta-laktamase adalah TEM, gen ini dapat menyebar ke berbagai spesies bakteri melalui konjugasi. Kemudian gen lain juga muncul seperti SHV dan CTX-M yang dapat meningkat menjadi multi resistant. Deteksi gen resisten CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 bertujuan untuk mendeteksi keberadaan gen ini, dimana masing-masing berperan dalam resistensi terhadap
antibiotika. Selain itu juga untuk melihat gen mutasi, dimana mutasi pada gen adalah mekanisme utama yang menjadi penyebab resistensi pada sebagian besar strain yang akan menyebabkan MDR (Kaur et.al, 2013). Deteksi gen resisten pada bakteri yang tergolong MDROs telah dilakukan oleh penelitian sebelumnya, pada penelitian (Nicole dkk, 2014) yaitu gen CTX-M, SHV, TEM, OXA and CIT-Type AmpCs yang terdapat pada kelompok bakteri gram negatif khususnya Enterobacteriaceae.
Di Indonesia pada penelitian di RS Dr Soetomo Surabaya (Severin et.al, 2010), deteksi gen ESBLs yaitu CTX-M, SHV dan TEM dilakukan pada 73 isolat Escherichia coli dan 72 isolat Klebsiella pneumoniae. Gen CTX-M ditemukan pada 69 isolat Escherichia coli (94,5%) dan 40 isolat (55,6%) Klebsiella pneumoniae. Gen SHV juga terdeteksi pada 47 isolat ini dan gen jenis TEM tidak ditemukan. Selain itu, deteksi gen SHV juga dilakukan (Yuwono, 2013) di Rumah Sakit Umum Pusat Moh. Hoesin Palembang. Pada 72 bakteri ESBLs ditemukan 32 sampel mengandung gen SHV, distribusi gen SHV adalah 20 (62,50%) pada Klebsiella pneumoniae, 7 (21,87%) pada Escherichia coli, 4 (12,50%) pada Enterobacter sp. dan 1 (3,13%) pada Proteus sp. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa gen SHV dominan pada bakteri Klebsiella pneumoniae.
1.2 Perumusan Masalah
Penelitian secara molekuler tentang gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 pada bakteri yang tergolong MDROs belum pernah dilakukan sebelumnya pada rumah dakit di kota Medan, sehingga perlu dilakukan penelitian tentang deteksi keberadaan gen-gen ini. Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan diatas maka rumusan masalah dalam penelitian ini adalah apakah ada gen resisten
CTXM, SHV, TEM dan OXA-48 pada isolat klinis bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae yang tergolong multiple drug resistant organisms (MDROs) dan bagaimana pola sensitivitas antimikrobanya.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi adanya gen resisten CTX- M, SHV, TEM dan OXA-48 pada isolat bakteri klinis bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae yang tergolong multiple drug resistant organisms (MDROs) dan mengetahui pola sensitivitas antimikrobanya.
1.4 Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi manfaat sebagai sumber informasi ilmiah tentang adanya gen resisten CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 dan pola sensitivitas antimikroba pada isolat bakteri klinis bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae yang tergolong multiple drug resistant organisms (MDROs). Dengan ditemukannya distribusi gen ini, dapat dijadikan sebagai antisipasi transmisi bakteri yang telah MDROs dan juga sebagai upaya menghindari peningkatan resistensi, sehingga pemberian antibiotika kepada pasien yang terinfeksi bakteri ini diterapi dengan antibiotika yang tepat.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Antibiotika
Antibiotika merupakan suatu substansi antimikroba yang diperoleh dari atau bentuk yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang umumnya adalah jamur maupun zat sintetik lain. Antibiotika dikenal sebagai agen antimikroba, adalah obat yang melawan infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Beberapa antibiotika merupakan senyawa sintetis (tidak dihasilkan oleh mikroorganisme) yang juga dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri. Secara teknis, istilah
"agen antibakteri" mengacu pada kedua senyawa alami dan sintetis, akan tetapi banyak orang menggunakan kata "antibiotika" untuk merujuk kepada keduanya.
Meskipun antibiotika memiliki banyak manfaat, tetapi penggunaannya telah berkontribusi tehadap terjadinya resistensi (Katzung, 2007).
Konsep mengontrol penggunaan obat ini sering disebut dengan pengobatan yang rasional yaitu meresepkan obat yang tepat, dalam dosis yang adekuat untuk durasi yang cukup dan sesuai dengan kebutuhan klinis pasien serta dengan harga yang paling rendah. Sedangkan menurut World Health Organization (WHO) Global Strategy, penggunaan antibiotika yang tepat adalah penggunaan antibiotik yang efektif dari segi biaya dengan peningkatan efek terapeutik klinis, meminimalkan toksisitasobat dan meminimalkan terjadinya resistensi (Ambwani et.al, 2006). Pemilihan terapi antibiotika yang rasional harus mempertimbangkan berbagai faktor, antara lain faktor pasien, bakteri dan antibiotika. Terapi empiris diarahkan pada bakteri yang dikenal menyebabkan infeksi secara umum (Tjay et.al, 2007). Penggunaan antibiotik dalam jumlah yang banyak dan
penggunaannya yang salah diduga sebagai penyebab utama tingginya jumlah patogen dan bakteri komensal resisten di seluruh dunia. Pengurangan jumlah kejadian penggunaan antibiotik yang tidak tepat merupakan cara terbaik untuk melakukan kontrol terjadinya resistensi bakteri (Bruton et.al, 2008).
2.2 Penggolongan Antibiotika
Penggolongan antibiotika secara umum dapat diklasifikasikan berdasarkan struktur kimia antibiotika (Tjay et.al, 2007) yaitu :
a. Golongan beta laktam, antara lain golongan sefalosporin yaitu generasi pertama (sefadroksil, sefazolin, sefaleksin, sefalotin, sefapirin dan sefadrin), generasi kedua (sefaklor, sefamandol, sefanisid, sefuroksim, sefamisin, sefoksitin, sefametazol dan sefotetan), generasi ketiga (sefotaksim, seftazidim, sefodiksim proksetil, sefatamet pivoksil, seftibuten, sefiksim, sefodizim, seftriakson dan sefoperazo) dan generasi keempat (sefepim, sefipirom). Golongan beta laktam juga termasuk monosiklik dan penisilin (amoksilin).
b. Antibiotika golongan aminoglikosida, dihasilkan oleh jenis-jenis fungi Streptomyces dan Micromonospora. Semua senyawa dan turunan semi- sintesis mengandung dua atau tiga gula-amino di dalam molekulnya, yang saling terikat secara glukosidis. Spektrum kerjanya luas dan meliputi terutama banyak bakteri gram negatif. Obat ini juga aktif terhadap gonococci dan sejumlah kuman gram-positif. Aktifitasnya adalah bakterisid, berdasarkan dayanya untuk menembus dinding bakteri dan mengikat diri pada ribosom di dalam sel. Contohnya streptomisin, gentamisin, amikasin, neomisin dan paranomisin.
c. Antibiotik golongan tetrasiklin, khasiatnya bersifat bakteriostatis, hanya melalui injeksi intravena dapat dicapai kadar plasma yang bakterisida lemah. Mekanisme kerjanya berdasarkan diganggunya sintesa protein kuman. Spektrum antibakterinya luas dan meliputi banyak kokus gram positif dan batang gram negatif. Contohnya antibiotika golongan ini yaitu tetrasiklin, doksisiklin dan monosiklin.
d. Antibiotika golongan makrolida, bekerja secara bakteriostatis terhadap terutama bakteri gram-positif dan spectrum kerjanya mirip penisilin-G.
Mekanisme kerjanya melalui pengikatan reversibel pada ribosom bakteri, sehingga sintesa proteinnya dihalangi. Absorbinya tidak teratur, sering menimbulkan efek samping lambung-usus, dan waktu paruhnya singkat, maka perlu ditakarkan sampai 4x sehari. Contoh jenis antibiotika ini adalah eritromisin dan azitromisin.
e. Antibiotika golongan linkomisin, dihasilkan oleh Srteptomyces lincolnensis. Contoh antibiotik ini adalah linkomisin, khasiatnya bakteriostatis dengan spektrum kerja lebih sempit daripada makrolida, terutama terhadap bakteri gram positif dan anaerob. Berhubung efek sampingnya hebat kini hanya digunakan bila terdapat resistensi terhadap antibiotika lain.
f. Antibiotika golongan kuinolon, senyawa-senyawa kuinolon berkhasiat bakterisida pada fase pertumbuhan bakteri, berdasarkan inhibisi terhadap enzim DNA-gyrase bakteri, sehingga sintesis DNAnya dihindarkan.
Golongan ini hanya dapat digunakan pada infeksi saluran kemih (ISK)
tanpa komplikasi. Contoh antibiotik golongan ini yaitu siproflokasin, levoflokasin, oflokasin, norflokasin dan maksiflokasin.
g. Antibiotik golongan kloramfenikol, golongan antibiotik ini memiliki spektrum luas, berkhasiat bakteriostatis terhadap hampir semua bakteri gram positif dan sejumlah bakteri gram negatif. Mekanisme kerjanya berdasarkan perintangan sintesa polipeptida bakteri..
2.3 Mekanisme Terjadinya Resistensi Antibiotika
Secara umcum mekanisme kerja antibiotik pada sel bakteri dapat terjadi melalui bebrapa cara yaitu menghambat sintesis dinding sel bakteri, menghambat fungsi membran plasma, menghambat sintesis asam nukleat, menghambat sintesis protein melalui penghambatan pada tahap translasi atau transkripsi meterial genetik dan menghambat metabolisme folat. Perubahan-perubahan dasar dalam hal kepekaan mikroorganisme terhadap antibiotika tanpa memandang faktor genetik. Beberapa hal yang mendasar terjadinya resistensi antibiotika yaitu ; dihasilkannya enzim yang dapat menguraikan antibiotik seperti enzim penisilinase, sefalosporinase, fosforilase, adenilase dan asetilase, perubahan permeabilitas sel bakteri terhadap obat, meningkatnya jumlah zat-zat endogen yang bekerja antagonis terhadap obat perubahan jumlah reseptor obat pada sel bakteri atau sifat komponen yang mengikat obat pada targetnya (Sudigdoadi, 2015).
Perubahan sasaran target antibiotika yaitu modifikasi menjadi insensitif, penurunan fungsi fisiologik dari target. Pencegahan mencapai target terjadi karena Kegagalan obat memasuki sel dan Inaktivasi antibiotik yang mendestruksi obat hingga memodifikasi obat sehingga gagal berikatan dengan target. Resistensi
bakteri juga dapat terjadi secara intrinsik dan gen yang didapat. Resistensi yang terjadi secara intrinsik dengan kromosomal dan berlangsung melalui multiplikasi sel yang akan diturunkan pada turunan berikutnya. Resistensi gen yang didapat terjadi akibat mutasi khromosomal atau akibat transfer DNA (Bezoen et.al, 2001).
2.4 Multiple Drug Resistant Organisms (MDROs)
MDROs merupakan bakteri yang telah menjadi resisten terhadap antibiotika tertentu, dan antibiotik ini tidak dapat lagi digunakan untuk mengontrol atau membunuh bakteri. Bakteri yang kebal terhadap lebih dari satu antibiotik disebut multiple drug resistant organisms (MDROs). Istilah lain yang digunakan termasuk resistensi antibiotika, resistensi antibakteri, dan resistensi antimikroba. MDROs berkembang ketika antibiotika dipakai dalam jangka panjang dan dipakai pada saat yang tidak diperlukan. Pada awalnya, hanya beberapa bakteri dapat bertahan hidup pada terapi dengan antibiotika. Semakin sering antibiotika digunakan, semakin besar kemungkinan bakteri untuk menjadi (Sheryl, 2013).
MDROs dapat menyebar dari pasien ke pasien di tangan petugas kesehatan, menyebar pada objek seperti troli obat-obatan, bed rawat inap, meja operasi, tiang infus dan kateter. Bakteri MDR juga dapat menyebar dari orang ke orang melalui kontak langsung misalnya menyentuh luka berdarah. Infeksi MDRO terjadi paling sering pada anak-anak, orang tua, atau pada orang yang memiliki gangguan kesehatan seperti paru-paru kronis, jantung, atau penyakit ginjal (Jane et.al, 2006).
2.5 Extended Spectrum Beta Lactamases (ESBL)
ESBLs merupakan enzim mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis antibiotika golongan penisilin, sefalosporin generasi I, II, III serta golongan aztreonam. ESBL paling banyak dihasilkan oleh Enterobacteriaceae (terutama Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae). ESBLs berasal dari enzim beta- laktamase yang termutasi, mutasi ini menyebabkan peningkatan aktivitas enzimatik beta-laktamase sehingga enzim ini dapat menghidrolisis sefalosporin generasi III dan IV serta aztreonam (Kamlesh et.al, 2015).
Penggunaan antibiotika golongan sefalosporin generasi III secara luas untuk pengobatan infeksi di rumah sakit disebutkan menjadi salah satu faktor risiko infeksi oleh bakteri penghasil ESBLs. Selain resisten terhadap antibiotika golongan sefalosporin, bakteri penghasil ESBLs juga sering menunjukkan resistensi pada penggunaan kuinolon. Selain panggunaan antibiotika secara berlebihan, pasien dengan penyakit berat, LOS (Length of Stay) yang lama dan dirawat dengan alat-alat medis yang sifatnya invasif untuk waktu yang lama juga merupakan risiko tinggi untuk terinfeksi oleh bakteri penghasil ESBLs. Penelitian tentang ESBLs sangat berkembang, yang berasal dari lebih dari 30 negara yang berbeda dan penelitian ini mencerminkan distribusi ESBLs di seluruh Dunia (Kamlesh et.al, 2015).
Gen pengkode ESBL pada bakteri paling banyak berada di plasmid, dalam suatu review artikel yang diterbitkan oleh Indian Journal microciology : ESBLs merupakan plasmid mediated dan termasuk dalam golongan TEM dan SHV.
Canadian External Quality Assesment Advisory Group for Antibiotic menyatakan bahwa gen yang mengontrol produksi beta-laktamase terletak di dalam plasmid
atau kromosom. Hal ini mempermudah kemampuan gen ESBL pindah dari satu organisme ke organisme yang lain, sehingga penyebaran resistensi sangat mudah terjadi antar strain bahkan antar spesies . Plasmid juga bertanggung jawab atas gen pengkode yang membawa gen resistensi untuk golongan obat yang lain misalnya aminoglikosida. Keadaan ini membuat pilihan antibiotika untuk melawan organisme yang memproduksi ESBLs sangat terbatas (Kaur et.al, 2013).
Umumnya ESBL berasal dari gen TEM-1, TEM-2, atau SHV-1 yang mengalami mutasi dan mengubah konfigurasi asam amino di sekitar lokasi aktif dari beta laktam. Keadaan ini membuat spektrum antibiotik beta laktam rentan terhadap hidrolisis oleh enzim ini. Famili Enterobacteriaceae sering mengekspresikan plasmid-encoded beta -lactamase (TEM-1, TEM-2, dan SHV- 1) yang mengkode resisten terhadap penisilin namun tidak terhadap sefalosporin.
Namun akhir-akhir ini sudah banyak ditemukan bakteri penghasil beta-laktamase yang resisten terhadap golongan antibiotik cephalosporin. Jenis ESBL yang sering ditemukan adalah SHV beta laktamase (kelas A), TEM beta laktamase (kelas A), CTX-M beta laktamase (kelas A), OXA beta-laktamase (class D) dan PER tipe ESBL (Deepthi et.al, 2010).
Struktur dan mekanisme kerja beta laktamase yaitu semua ESBL memiliki serine yang terletak di active sites kecuali sebagian kecil class B Grup metallo beta-lactamase dan memiliki banyak kesamaan asam amino dengan penicillin binding proteins (PBPs). Beta laktamase akan menyerang ikatan amida di cincin beta laktam penisilin, sefalosporin serta menghasilkan penicillinoic acid dan cephalosporic acid sehingga senyawa anti bakteri menjadi tidak aktif. Plasmid yang memiliki ukuran ≥ 80 Kb dan bertanggung jawab
terhadap pembawa gen ESBL. Pada organisme penghasil ESBL juga sering resisten terhadap antibiotika aminoglikosida, flurokuinolon, tetrasiklin, clorampenikol dan sulfametazol-trimetoprin (Tham, 2012).
Pada ESBL terjadi substitusi asam amino dan mengakibatkan perubahan konfigurasi enzim. Perubahan ini akan merubah fungsi enzim tersebut.
Terbukanya substrat beta laktam biasanya juga dapat meningkatkan kemampuan enzim beta-laktamase, contohnya substitusi asam amino tunggal pada posisi 104, 164, 238, dan 240 menghasilkan ESBLs. Biasanya ESBLs dengan spektrum luas memiliki lebih dari satu substitusi asam amino (Tham, 2012).
2.6 Bakteri penghasil ESBLs
ESBLs diklasifikasikan menjadi beberapa kelompok sesuai dengan urutan asam amino homologi mereka. Praktek pengendalian infeksi yang tepat dan hambatan sangat penting untuk mencegah penyebaran dan bakteri yang memproduksi ESBL. Bakteri telah mengembangkan strategi yang berbeda untuk melawan efek antibiotika, identifikasi mekanisme resistensi dapat membantu dalam penemuan dan desain agen antimikroba baru (Shaikh et.al, 2015).
Meskipun bakteri penghasil ESBLs telah banyak ditemukan pada berbagai Enterobacteriaceae dan Pseudomonadaceae di berbagai belahan dunia, namun mereka paling sering teridentifikasi dalam Klebsiella pneumonia dan Escherechia coli. Pada berbagai belahan dunia 10-40% strain Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae mengekspresikan ESBLs. Bakteri yang pernah dilaporkan sebagai penghasil ESBLs adalah Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Salmonella spp., Morganella morganii, Proteus mirabilis dan Serratia marcescens (Umadevi et.al, 2011).
1. Escherichia coli
Spesies bakteri dari genus Escherichia yang paling sering diisolasi dari spesimen klinik adalah Escherichia coli. Organisme merupakan mikroba normal utama di usus besar, dan juga merupakan bakteri penyebab utama infeksi saluran kemih, pneumonia, meningitis, serta septikemia. Paparan terhadap antibiotika yang tidak tepat akan menyebabkan berkembangnya bakteri Escherichia coli yang resisten, naik melalui plasmid maupun melalui kromosom. Terbentuknya enzim ESBL menyebabkan Escherichia coli. resisten terhadap golongan penisilin, sefalosporin dan aztreonam. Resistensi Escherichia coli terhadap golongan kuinolon disebabkan karena berkurangnya pembentukan porin, sehingga permeabilitas melalui membran luar akan berkurang (Abbot et.al, 2009).
2. Klebsiella pneumonia
Anggota genus Klebsiella tersebar luas di lingkungan (air, tanah, dan tanaman). Bakteri ini dapat hidup dalam keadaan bebas di lingkungan untuk periode waktu yang panjang. Klebsiella juga ditemukan sebagai bakteri komensal yang normal dalam saluran pencernaan vertebrata dan mamalia, termasuk burung, reptil dan bahkan serangga. Pada manusia, Klebsiella pneumoniae merupakan kuman saprofit yang terdapat di nasofaring dan saluran cerna. Klebsiella yang sering dijumpai yaitu Klebsiella pneumoniae dan Klebsiella oxytoca, merupakan kuman patogen yang penting dalam pelayanan kesehatan. Spesies ini sering menyebabkan infeksi nosokomial, seperti septikemia, endokarditis, pneumonia, osteomielitis dan infeksi saluran kemih. Klebsiella sebagai penyebab infeksi nosokomial terkait dengan pemakaian antibiotik spektrum yang luas. Pemakaian antibiotik yang luas ini menyebabkan terjadinya resistensi. Pada tahun 1980-an
ditemukan Klebsiella yang menghasilkan ESBLs. Klebsiella pneumoniae menghasilkan ESBL tipe enzim SHV-1 diperantarai plasmid ataupun kromosomal (Kotra et.al, 2002).
Mekanisme lain yang menyebabkan terjadinya resisten dan multi resisten pada Klebsiella pneumoniae yaitu melalui permeabilitas membran luar.
Permeabilitas membran luar Klebsiella pneumoniae dipengaruhi oleh adanya porin. Klebsiella mempunyai dua porin, yaitu OmpK35 dan OmpK36. Klebsiella pneumoniae yang menghasilkan ESBL mengalami mutasi pada gen gyrA sehingga hanya mempunyai satu porin saja. Penurunan ekspresi dari membran luar porin ini sering disertai dengan produksi ESBL yaitu tipe TEM atau SHV yang menyebabkan resisten terhadap sefepim atau tipe AmpC yang resisten terhadap imipenem (Jacoby et.al, 2005).
2.7 Tipe Gen ESBLs
Tipe gen ESBL memimiliki variasi genotip, genotip yang paling banyak adalah tipe SHV, TEM, dan CTX-M. Tipe lain yang penting adalah OXA, VEB dan PER (Jasser, 2006).
1. Tipe TEM (Temniore)
ESBL tipe TEM terdiri dari blaTEM-1 dan blaTEM-2. blaTEM-1 pertama kali ditemukan pada tahun 1966 dari Escherochia coli yang diisolasi dari seorang pasien bernama Temoneira di Yunani (hal ini menyebabkan enzim ini disebut sebagai TEM) (Bonomo et.al, 2005). blaTEM-1 beta laktamase adalah enzim yang bertanggungjawab atas resistensi bakteri terhadapat ampisilin, penisilin dan sefalosporin generasi pertama dan dapat diinhibisi oleh asam klavulanat. ESBL menyebabkan sekitar 90% resistensi Escherochia coli terhadap ampisilin dan juga
resistensi Haemophilus influenza dan Neisseria gonorrhoeae terhadap penisilin.
Mutasi spesifik yang terjadi pada blaTEM-1 yang dimediasi melalui proses seleksi antibiotik menyebabkan kemampuan enzim untuk menghidrolisis sefalosporin berspektrum luas dan azteronam (Rupp et.al 2003). ESBLs tipe TEM paling banyak ditemukan pada Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae (Bradford, 2001).
2. Tipe SHV (Sulfhydryl Variable)
ESBL tipe SHV lebih banyak ditemukan dibandingkan dengan tipe ESBL lainnya. SHV berasal dari kata sulfhidril variable. SHV tipe-1 beta-laktamase yang ditemukan pertama kali pada Klebsiella pneumoniae merupakan enzim yang dikode pada plasmid yang dapat menyebabkan terjadinya resistensi terhadap penicillin dan sefalosporin generasi pertama. Seperti pada blaTEM-1, mutasi yang terjadi bla SHV-1 menyebabkan kemampuan hidrolisis, blaSHV-1 meningkat sehingga dapat menghidrolisis sefalosporin berspektrum luas dan juga monobaktam. ESBL tipe SHV paling banyak ditemukan pada Klebsiella pneumoniae meskipun juga ditemukan pada Citrobacter diversus, Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Saat ini telah ditemukan 36 ESBL tipe SHV (Rupp et.al, 2003).
3. Tipe CTX-M (Cefotaxime Munich)
Beberapa tahun belakangan ini, sudah ditemukan sebuah famili plasmid- mediated ESBLs yang memiliki tingkat hidrolisis yang kuat terhadap cefotaksim, dinamakan CTX-M. Tipe ini banyak ditemukan pada Salmonella enterica, dan Escherichia coli, namun ditemukan juga pada beberapa spesies
Enterobacteriaceae lain seperti Klebsiella pneumoniae. Enzim ini terdiri dari CTX-M-1, CTX-M-2 sampai CTX-M-10 (Bradford, 2001).
4. Tipe Lain
Variasi beta laktamase lainnya telah berhasil ditemukan yaitu plasmid mediated atau integron-associated class A enzyme. Tipe ini memiliki titik mutasi yang tidak sederhana dari beta laktamase. Gen OXA tipe ESBLs digolongkan karena kemampuannya menghidrolisis antibiotika oksasilin. Sedangkan tipe lain seperti PER dikarakteristikkan berdasarkan perbedaan geografisnya. Bagian dari ESBL tipe PER hanya 25-27% yang homologi dengan tipe TEM dan SHV. PER-1 memiliki kemampuan untuk menghidrolisis penisilin dan cephalosporin, namun sensitif terhadap inhibisi dari asam klavulanat. PER-1 pertama ditemukan pada strain Pseudomonas aeruginosa di Turki. Pada perkembangannya ditemukan pula pada Salmonella entericaserovar typhimurium, Acitenobacter baumanii, Proteus mirabilis dan Alcaligenes fecalis. PER-2 yang 85 % homolog dengan PER-1, telah didapatkan pada Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, dan Vibrio cholera. PER-2 kebanyakan terdapat di Amerika Selatan (Rupp et.al, 2003).
Selain tipe PER ada juga tipe Vietnam Extended Spectrum β-lactamase (VEB). VEB-1 memiliki homologi yang paling besar dengan PER-1 dan PER-2 (38%). Memiliki kemampuan resistensi tingkat tinggi terhadap seftazidim, sefotaksim dan aztreonam. VEB-1 pertama kali ditemukan pada isolat Escherichia coli di Vietnam. Sebuah beta-laktamase lain yang memiliki struktur yang identik dengan VEB-1 telah ditemukan juga pada Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloaca and Pseudomonas aeruginosa di Thailand. ESBL tipe lainnya yang telah
ditemukan namun jarang dilaporkan karena masih dalam jumlah yang sedikit pada daerah geografis yang terbatas seperti GES, BES, SFO, TLA dan IBC beta laktamase ditemukan pada Enterobacteriaceae (Rupp et.al, 2003).
2.8 Deteksi ESBLs
Metode yang digunakan untuk skrining ESBLs dikeluarkan oleh NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) yang sekarang berganti nama menjadi CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). Berikut adalah 2 jenis uji yang dapat digunakan untuk skrining ESBL :
1. Uji Double Disk Synergy
Metode ini pertama kali ditemukan oleh Jarlier et.al (1988) dengan menggunakan agar Mueller Hinton. Skrining dengan metode uji Double Disk Synergy memiliki tingkat kesulitan yang tidak tinggi dan menggunakan alat dan bahan yang cukup sederhana. Uji double disc synergy dilakukan dengan menggunakan cakram augmentin (20 µg amoksilin dan 10 µg asam klavulanat) dan cakram sefotaksim (30 µg), seftazidim (30 µg) serta cefodoksim (30 µg) yang diletakkan di sekitar cakram augmentin sekitar 16-20 mm. Seperti yang diketahui, ESBL adalah enzim yang mampu menghidrolisis antibiotik golongan penisilin, sefalosporin golongan I,II,III serta aztreonam (Rupp et.al, 2003).
Dengan pemberian asam klavulanat sebagai inhibitor beta-laktamase, maka enzim beta-laktamase dapat dihambat. Oleh karena itu, interpretasi hasil yang positif ESBL dari metode uji double disc synergy adalah dengan adanya peningkatan zona hambat dari sefalosporin ke arah cakram asam klavulanat.
Dikarenakan hasil positif dari uji double disc synergy ini tidak memakai satuan
angka yang pasti sebagai batasan hasil positif dan negatif, tingkat subjektivitas dalam menginterpretasikan hasil merupakan kelemahan dalam metode ini (Rupp et.al, 2003).
Meskipun memiliki kelemahan, metode double disc synergy memilki tingkat sensitivitas yang cukup baik yaitu berkisar 79%-96% Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Giriyapur (2011) dari 313 sampel Enterobacteriaceae, 176 sampel (56,23%) merupakan bakteri penghasil ESBL yang diskrining dengan metode double disk synergy, sementara 200 sampel (63,89%) dinyatakan bakteri penghasil ESBL dengan metode uji phenotypic confirmatory. Hal ini menunjukkan bahwa metode double disc synergy dapat diandalkan untuk skrining bakteri penghasil ESBLs (Giriyapur et al, 2011).
2. Uji Fenotip Komersil
Metode pendeteksian ESBL yang komersil adalah E test, AB Biodisk (Solna, Sweden), Vitek 2 (Biomerieux Vitek, Hazelton, Missouri), MicroScan panels dari Dade Behring MicroScan (Sacramento,California, USA), BD Phoenix Automated Microbiology System dari Becton Dickinson Biosciences (Sparks, MO Maryland,USA) (Taneja, 2007).
Wiegand et.al (2007) telah melakukan suatu studi perbandingan terhadap tes konfirmasi fenotip yang konvensional dibandingkan dengan beberapa tes yang telah tersedia secara komersil. Hasilnya : Phoenix memiliki sensitivitas tertinggi (99%) diikuti oleh Vitek 2 (98%) dan Micro Scan (94%). Sedangkan spesifisitasnya sangat bervariasi yaitu 52% pada Phoenix dan 78 % pada Vitek 2.
Sedangkan pada uji E test strips dengan empat cakram kombinasi (termasuk
seftazidim, sefotaksim, sefuroksim, dan sefiprirom) menunjukkan sensitivitas 94% dan 93% dan spesifisitas 85 % dan 81%.
3. Uji Genotip dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dengan teknologi modern, gen penyandi ESBL dapat dideteksi melalui amplifikasi DNA yang dilakukan menggunakan metode molekuler standar, yaitu polymerase chain reaction atau PCR. Deteksi genotip memakai metode PCR membutuhkan investasi peralatan khusus yang dapat mengakibatkan kurangnya penggunaan metode ini karena keterbatasan infrastruktur (Tsering et.al, 2009).
Berbagai metode lainnya untuk amplifikasi DNA telah dikembangkan seperti nucleic acid sequence based amplification (NASBA), strand displacement amplification (SDA), dan helicase dependent amplification (HDA), serta loopmediated isothermal amplification (LAMP) (Laohasinnarong, 2011). Loop- mediated isothermal amplification (LAMP) adalah metode amplifikasi DNA yang paling baru dengan spesifisitas, sensitivitas, dan juga kecepatan yang tinggi pada kondisi isotermal dengan memakai empat buah primer dan Bst DNA Polymerase.
Dibanding dengan PCR, LAMP mempunyai beberapa keunggulan, yaitu hanya membutuhkan peralatan yang cukup sederhana, prosedur cepat, dan pembacaan hasilnya mudah untuk dilakukan sehingga dapat dipergunakan dengan infrastruktur terbatas (Fakruddin, 2011).
BAB III
BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan bulan Februari tahun 2017 di Instalasi Laboratorium Diagnostik (Unit Mikrobiologi Klinik) RSUP Haji Adam Malik Medan, Laboratorium Terpadu dan Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran USU Medan.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : ose, cawan petri, tabung inokulum, beaker glass, Neplometer (densi check), nanophotometer, rak tabung, tip steril (10, 20, 100, 200, 1000µl), mikropipet (10, 20, 100, 200, 1000µl), Bunsen, cooler box, Biologycal Safety Cabinet (BSC) Class II, alat Vitek 2 Compact, kartu dentifikasi, kartu antimicrobial susceptibility testing (AST), mesin PCR verity, alat Elektroporesis, microtube 1,5ml, microtube PCR 0,2ml, sentrifius, autoklaf, neraca digital, dry block, freezer-20oC dan UV Reader/Gel Documentation System.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : isolat bakteri, Media Mac-conkey agar, triptose soya borth (TSB), NaCl fisiologis, akuabides, akuades, ethidium bromida 1%, TE Buffer, TAE Buffer, nuclease free water, Mastermix, Primer CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 dan Agarose.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara deskriptif kualitatif yaitu dengan mengidentifikasi bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae yang
tergolong MDROs dari menggunakan alat Vitek 2 Compact secara fenotip dan mendeteksi ada tidaknya gen CTX-M, SHV, TEM, OXA-48 secara genotip menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Parameter yang diamati adalah jenis bakteri MDROs, pola sensitivtas antimikroba, persentase gen CTX- M, SHV, TEM dan OXA-48.
3.4 Teknik Pengambilan Sampel
Teknik pengambilan sampel dilakukan dengan metode purposive sampling dan metode ini cocok untuk peneltian kualitatif. Arikunto (2010) mengemukakan bahwa purposive sampling dilakukan dengan cara mengambil subjek bukan berdasarkan strata, random atau daerah tetapi didasarkan adanya tujuan tertentu.
Teknik ini dilakukan dengan karena beberapa pertimbangan, misalnya keterbatasan waktu, tenaga dan dana sehingga tidak mengambil sampel yang besar dan jauh. Penentuan besar sampel pada penelitian ini didasarkan pada data pola kuman IMK RSUP Haji Adam Malik Medan pada Januari-Juni 2016 yaitu bakteri tergolong MDRO yang ESBL sebanyak 570 isolat.
1 N.d n N2
Keterangan: n = ukuran sampel N = jumlah populasi
d = nilai presisi/ketepatan meramalkan 10% (0,1) Maka
1 (0,1) 570 n 5702
n = 85,07 Jadi, sampel dalam penelitian adalah 85 isolat bakteri
3.5 Preparasi dan Kultivasi
Preparasi sampel dimulai dengan menyiapkan peralatan yang akan digunakan untuk penanaman spesimen seperti alat BSC, ose dan media Mac-
Conkey agar. Spesimen yang dikirim ke Unit Mikrobiologi Klinik berupa sputum, darah, swab, urine, cairan otak, cairan pleura dan feses. Dilanjutkan ke tahap kultivasi, dimulai dengan mengambil sampel menggunakan ose 10µl, digoreskan pada media dengan goresan 4 kuadran. Sampel dinkubasi pada inkubator dengan suhu 37oC selama 24 jam. Adanya pertumbuhan dilihat dari koloni yang berada pada goresan yang dilanjutkan pada tahap identifikasi (dokumentasi pada lampiran 3).
3.6 Identifikasi Bakteri dan Uji Kepekaan Antimikroba
Identifikasi bakteri dilakukan dengan mengambil koloni murni pada media Mc-Conkey Agar, dimasukkan kedalam tabung inokulum berisi larutan NaCl 0.45%. Suspensi diukur dengan kekeruhan 0,5 Mac-Farland menggunakan alat densi check, hasil pengukuran muncul dalam satuan Mac Farland. Jika kekeruhan kurang maka tambahkan koloni mikroba dan jika kekeruhan berlebih maka ambil sejumlah volume dan diencerkan dengan menambahkan larutan NaCl 0,85%.
Identifikasi jenis bakteri menggunakan kartu identikasi seperti Casette GN (gram negatif) dan uji kepekaan antibiotika dengan kaset antimicrobial susceptibility testing (AST), dengan bard code agar kode sampel muncul pada monitor alat Vitek, dimasukkan kedalam alat vitek 2 compact, secara otomatis hasil akan mengidetifikasi jenis bakteris selama 24 jam.
Isolat yang tergolong MDROs berdasarkan hasil pemeriksaan Vitek 2 Compact di Unit Mikrobiologi Klinik RSUP Haji Adam Malik. Isolat kemudian dibawa ke Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran USU untuk dilakukan subkultur. Selanjutnya hasil subkultur isolat dibawa ke Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU untuk pemeriksaan secara molekuler yaitu deteksi gen
resisten CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 menggunakan polymerase chain reaction (PCR).
3.7 Deteksi Gen Resisten CTX-M. SHV, TEM dan OXA 1. Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan metode freezing-thawing yaitu dimulai dengan mengambil 1 koloni murni bakteri yang dimasukkan ke dalam microtube berisi akuabides 20µl, kemudian dihomogenkan dengan vortex. Setelah itu dimulai dengan proses kristalisasi dengan memasukkan ke dalam freezer -20oC selama 10 menit, selanjutnya dipanaskan pada dry block dengan suhu 90oC selama 10 menit (proses kristaliasi dan pemanasan dilakukan sebanyak 6 siklus). Hasil isolasi disentrifugasi dengan kecepatan 1.300 rpm selama 2 menit (dokumentasi pada lampiran 3).
2. Pengukuran Konsentrasi DNA
Hasil isolasi diuji kemurnian DNA-nya dengan menghitung rasio pada panjang gelombang 260 dan 280 nm menggunakan nanophotometer sampai didapatkan hasil sebesar 1.8-2.0 yang menunjukkan bahwa DNA bakteri memiliki kemurnian tinggi dan dapat dilakukan amplifikasi menggunakan PCR.
3. Deteksi Gen
Deteksi gen dimulai dengan membuat amplifikasi sebanyak 25µl yang terdiri dari mastermix 12,5 µl, primer reverse 1 µl, primer forward 1 µl, nuclease free water 8,5 µl dan DNA bakteri 2 µl yang digunakan sebagai template dimasukkan ke micro tube 0,2 µl. Amplifikasi gen dilakukan dengan PCR pada primer spesifik dari CTX-M, SHV, TEM dan OXA dengan kondisi themocycling seperti pada tebel 1 berikut (Hout et.al, 2015).
Tabel 1. Primer Spesifik Gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48
Primer Name Primer Sequence (5’ a 3’)
Target Gene
Product Size (bp)
Thermocycling
BlaCTX-M F
ATG TGC AGY ACC AGT AAR GTK ATG GC
BlaCTX-M 539 Denaturation 94oC (2menit) 1 Siklus Amp. Denaturation (1menit) 94 oC Anneling (30detik) 52 oC Extension (45detik) 72 oC Final Extension (5menit) 72oC 1 Siklus
BlaCTX-M R
TGG GTR AAR TAR GTS ACC AGA AYC AGC GG
BlaTEM F
TCG GGG AAA TGT GCG CG
BlaTEM 972 Denaturation 96oC (5menit) 1 Siklus Amp. Denaturation (1menit) 96 oC Anneling (1menit) 58 oC Extension (45detik) 72 oC Final Extension (10menit) 72oC 1 Siklus
BlaTEM R
TGC TTA ATC AGT GAG GCA CC
BlaSHV F
TTA TCT CCC TGT TAG CCA CC
BlaSHV 141 Denaturation 96oC (5menit) 1 Siklus Amp. Denaturation (1menit) 96 oC Anneling (1 menit) 60 oC Extension (1 menit) 72 oC Final Extension (10 menit) 72oC 1 Siklus
BlaSHV R
GAT TTG CTG ATT TCG CTC CC
BlaOXA F
GCG TGG TTA AGG ATG AAC AC
BlaOXA-48 389
Denaturation 96oC (5menit) 1 Siklus Amp. Denaturation (1menit) 96 oC Anneling (1 menit) 55 oC Extension (1menit) 72 oC Final Extension (5menit) 72oC 1 Siklus
BlaOXA R
CAT CAA GTT CAA CCC AAC CG
4. Elektroporesis
Elektroporesis dimulai dengan membuat konsentrasi agarose 2%
dilarutkan ke dalam TAE buffer 1x. Kemudian dipanaskan selama 5 menit, ditambahkan Ethidium bromida 1% dan agarose dituangkan ke dalam chamber elektroforesis. Chamber diisi dengan larutan buffer TAE sampai agarose terendam. Selanjutnya marker dimasukkan pada well pertama sebanyak 7µl dan masing-masing sampel dari hasil PCR sebanyak 5µl dimasukkan pada tiap well yang tersedia, chamber kemudian ditutup sesuai kutub negatif dan positif.
Elektroforesis dilakukan pada kondisi 80v dan 500mA selama 80 menit dan kemudian running. Setelah gel agarose diangkat dan dimasukkan ke dalam alat UV Reader/Gel Documentation System untuk melihat pola pita DNA (dokumentasi pada lampiran 3).
30 Siklus
35 Siklus
35 Siklus
35 Siklus
3.8 Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil penelitian adalah jenis bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae yang tergolong MDROs, uji sensitivitas antimikroba dan hasil deteksi gen-gen resisten. Berdasarkan data tersebut, maka data sajikan dalam tabulasi, persentasi dan distribusi jenis bakteri dan pola sensitivitas antimikroba. Sedangkan adanya gen resisten CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 disajikan berdasarkan pita DNA.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian tentang deteksi gen resisten CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 pada isolat klinis bakteri Escherchia coli dan Klebsiella pneumonia yang tergolong multiple drug resistant organisms (MDROs) telah dilaksanakan. Hasil penelitian meliputi uji fenotip dan genotip bakteri yang tergolong MDROs (lampiran 1). Adapun identifikasi secara fenotip terdiri dari jenis bakteri yang tergolong MDROs dan pola sensitivitas antimikroba menggunakan alat Vitek 2 Compact. Sedangkan secara genotip dengan mendeteksi gen CTX-M, SHV, TEM dan OXA-48 secara molekuler dengan metode PCR.
4.1 Uji Fenotip MDROs dengan Vitek 2 Compact.
Hasil uji fenotip terhadap 85 isolat bakteri dilakukan untuk mengidentifikasi jenis bakteri dan menggolongkan bakteri yang MDROs berdasarkan hasil uji sensitivitas antimikroba. Alat Vitek 2 Compact telah banyak digunakan diseluruh dunia sebagai alat identifikasi dan uji sensitivtas antimikroba sesuai standard Clinical Laboratory Susceptibility Institute (CLSI) dengan kinerja semi-otomatis yang memiliki tingkat sensitivitas dan spesifitas tinggi. Adapun persentase jenis bakteri dan fenotip MDROs dari total 85 isolat dapat dilihat pada Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Persentase Jenis Bakteri MDROs secara Fenotip.
Bakteri MDROs
% Fenotip MDROs
ESBL ESBL + Carbapenemase Escheriachia coli 48% (41) 7,05% (6)
Klebsiella pneumoniae 52% (44) 7,05% (6) Total : 100% (85) 14,1% (12)
Persentase jenis bakteri MDROs yang diidentifikasi adalah 100% jenis ESBL dengan distribusi Klebsiella pneumoniae sebanyak 52% dan Escherichia coli 48%. Dari hasil penelitian ini menujukkan bahwa kedua jenis bakteri ini merupakan bakteri yang paling sering menyebabkan infeksi di rumah sakit, tidak hanya sebagai penyebab infeksi namun kedua bakteri ini juga telah resisten terhadap antibiotika dan bahkan telah meningkat sebagai multi-resisten. Menurut Brooks et.al (2007) bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae adalah patogen utama penyebab infeksi yang berkaitan dengan perawatan (health care) di rumah sakit maupun infeksi pada populasi (komunitas).
Pada penelitian ini, secara fenotip seluruh isolat yang tergolong MDROs adalah penghasil ESBL dan sebanyak 14,16% merupakan penghasil ESBL dan Carbapenemase. Menurut Thenmozhi et.al (2014) bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae mampu memproduksi enzim Extended Spectrum β- Lactamase (ESBL) yang dapat menghidrolisis cincin beta laktam, sehingga terjadi inaktivasi dari antibiotika jenis beta laktam seperti sefalosporin, penisilin, aztreonam dan karbapenem tidak mampu melisiskan dinding sel sebagai target.
Infeksi karena bakteri penghasil ESBLs makin sulit diterapi karena pilihan antibiotika menjadi sangat terbatas dan munculnya berbagai mutan baru, akibatnya resistensi terhadap agen antimikroba yang menyebabkan kegagalan kerja antibiotika melawan bakteri penyebab infeksi (Nathisuwan et.al, 2001).
Pada penelitian ini, fenotip MDROs ditentukan oleh hasil uji sensitivitas bakteri terhadap antimikoba, dimana jika bakteri resisten terhadap minimal satu jenis antibiotika dari ≥3 golongan antibiotika. Adapun hasil uji sensitivitas bakteri
terhadap antimikroba menggunakan alat Vitek 2 Compact terlampir pada lampiran 1 dan persentase uji sensitivitas antimikroba disajikan pada Tabel 3 berikut.
Tabel 3. Persentase Sensitivitas Antimikroba.
Agen Antimikroba Sensitivitas Antimikroba n=85 (%)
Golongan Jenis Antibiotika Sensitif Resisten
Penisilin Amoksilin 0% 100%
Ampisilin 0% 100%
Sefalosporin Sefotaksim 0% 100%
Seftriakson 0% 100%
Seftazidim 0% 100%
Sefepim 0% 100%
Monobaktam Astreonam 0% 100%
Inhibitor Beta-laktamase Amoksilin/Asam Klavulanat 27% 73,0%
Piperasilin/Tazobaktam 43,5% 56,4%
Sefoperazon/Sulbaktam 63,5% 36,4%
Aminoglikosida Gentamisin 35,3% 64,7%
Amikasin 100% 0%
Karbapenem Imipenem 85,8% 14,2%
Meropenem 85,8% 14,2%
Flurokuinolon Siprolaksasin 0% 100%
Levofloksasin 25,8% 74,2%
Fosfomisin Fosfomisin 86,5% 13,5%
Folate Pathway Inhibitor Kotrimoksazol 0% 100%
Tigesil Tigesiklin 84,5% 15,5%
Uji sensitivitas antimikroba pada tabel 3 menujukkan bahwa seluruh isolat resisten terhadap antibiotika golongan betalaktam yaitu penisilin, sefalosporin dan astreonam dengan persentase 100%. Resistensi 100% tidak hanya pada golongan betalaktam, tetapi juga terjadi pada golongan flurokuinolon dengan jenis siprolaksasin dan golongan folate pathway inhibitor dengan jenis kotrimoksazol.
Resistensi terhadap golongan Inhibitor Beta-laktamase seperti amoksilin asam klavulanat mencapai 42%, piperasilin tazobaktam mencapai 38,8% dan sefoperazon sulbaktam mencapai 27%. Antibiotika dengan golongan flurokuinolon dengan jenis levofloksasin terdapat resistensi 70,5%. Pada golongan aminoglikosida dengan jenis gentamisin 63,5%, golongan tigesil yaitu tigesiklin 84,5%. Isolat yang memiliki persentase sensitivitas 85,8% adalah golongan karbapenem dengan jenis imipenem dan meropenem, dan golongan fosfomisin.
sedangkan jenis amikasin dari golongan aminoglikosida memiliki persentase sensitivitas mencapai 100%.
Dari hasil persentase sensitivitas antimikroba, maka digunakan cutoff sebagai nilai standard yang direkomendasikan oleh European Unit Reference Laboratory for Antimicrobial Resistance (EURL-AR) tahun 2013 untuk bahan pertimbangan terapi antimikroba di rumah sakit. Nilai cutoff penting untuk perbandingan resisensi antimikroba, upaya pengendalian resistensi dan membantu ahli mikrobiologi dalam interpretasi hasil uji sensitivitas antimikroba. Kriteria cutoff yaitu jika sensitivitas <60% tidak direkomendasikan untuk terapi karena umumnya kejadian resistensi sangat tinggi, sensitivitas antara 60-80% dapat dipertimbangkan dengan berkonsultasi dengan program pengendalian resistensi antimikroba (PPRA) di rumah sakit. Sedangkan jika sensitivitas >80% dapat direkomendasikan sebagai terapi empirik terutama pasien yang terinfeksi oleh bakteri MDROs. Menurut penelitian Sugianli, et.al (2017) cutoff yang digunakan sebagai terapi untuk pasien yang berkaitan dengan resistensi adalah antibiotika dengan resistensi <20%. Dari hasil penelitiannya dijumpai antibiotika yang dapat digunanakan sebagai terapi oral tunggal adalah meropenem dengan prevalensi resistensi 21,3%, fosmisin 20% dan tigesiklin 20%. Sedangkan pada penelitian ini antibiotika yang direkomendasikan untuk terapi MDROs berdasarkan persentase sensitivitas >80% adalah amikasin, fosmisin, imipenem dan meropenem.
Hasil uji sensitivitas bakteri Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae resisten terhadap golongan betalaktam dengan jenis amoksilin, sefotaksim, seftazidim, seftriakson, sefepim dan astreonam, menujukkan bahwa kedua bakteri ini adalah positif ESBL secara fenotip. Dimana kedua bakteri ini mampu
