ANALISIS FILOGENETIKA BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB.

(1)

Riska Lisnawati, 2015

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB

SKRIPSI

diajukan untuk memenuhi salah satu syarat

memperoleh gelar Sarjana Program Studi Biologi

Depertement Pendidikan Biologi

Oleh:

Riska Lisnawati NIM 1000304

PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

ANALISIS

FILOGENETIK

BAKTERI

Aeromonas hydrophila

DARI ISOLAT IKAN

SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN

gyrB

Oleh Riska Lisnawati

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Penetahuan Alam

Januari 2015

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

(3)

LEMBAR PENGESAHAN

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gB

Oleh

Riska Lisnawati

1000304

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH: Pembimbing I

Dr. Topik Hidayat, M.Si NIP. 197004101997021001

Pembimbing II

Diah Kusumawaty, M.Si NIP.19708112001122001

Mengetahui,

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI

(4)

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Analisis Filogenetik Bakteri Aeromonas hydrophila dari Isolat Ikan Sehat Menggunakan Sikuen Gen gyrB” ini

beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya sendiri, dan saya tidak melakukan

penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika keilmuan

yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini, saya siap menanggung

sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila kemudian ditemukan adanya pelanggaran

terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini atau klaim dari pihak lain terhadap keaslian

karya saya ini.

Bandung, Januari 2015

Yang membuat pernyataan

Riska Lisnawati

(5)

(6)

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB

ANALISIS FILOGENETIKA BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB

ABSTRAK

Aeromonas hydrophila berperan sebagai microbial flora bagi hewan-hewan air pada kondisi lingkungan

stabil dan dapat menjadi patogen pada ikan kondisi lingkungan perairan yang buruk. Klasifikasi genus

Aeromonas sangat kompleks, salah satu spesies yang taksonominya masih diperdebatkan, hingga menjadi

salah satu isu taksonomi yang konvensional dalam genus ini yaitu A.hydrophila. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mempelajari hubungan kekerabatan A. hydrophila yang diisolasi dari beberapa ikan sehat berdasarkan sikuen gen gyrB. Pada penelitian ini dilakukan pengujian morfologi dan biokimia guna memastikan isolat bakteri yang digunakan merupakan bakteri A. hydrophila yang sama digunakan dengan penelitian sebelumnya yang berasal dari intestin ikan sehat (gurame, nila, lele, dan mas). Selain itu, dilakukan identifikasi secara molekuler dengan menggunakan gen lip sebagai gen spesifik A. hydrophila. Hasil pengujian secara morfologi dan biokimia menunjukkan 6 isolat yang diuji merupakan bakteri A.

hydrophila. Keenam isolat tersebut merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk basil pendek,

merupakan bakteri fakultatif anaerob, bersifat motil dan dapat menghasilkan gas H2S, positif pada uji

oksidasi dan memiliki kemampuan β hemolisis. Hasil pendeteksian dengan gen lip pada seluruh isolat A. hydrophila, hanya 2 isolat yang menunjukkan amplikon pada gen ukuran 760 bp, sedangkan dari hasil

analisis bioinformatika menggunakan sikuen gen gyrB menunjukkan keenam isolat bakteri tersebut berada dalam satu kelompok yang sama dengan A. hydrophilA ATCC 7966.

(7)

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB

PHYLOGENETIC ANALYSIS OF Aeromonas hydrophila OF HEALTHY FISH ISOLATE USING gyrB GENE

ABSTRACT

Aeromonas hydrophila act as microbial flora of aquatic organism in stable environmental conditions and

it can be pathogenic to fish under the poor environmental conditions. Classification of the genus

Aeromonas is very complex, one of the species that is still being discussed regarding its taxonomy and

becoming a controversial taxonomic issue is the species of A. hydrophila. The purpose of this research is to study the phylogenetic relationship of A. hydrophila isolated from several healthy fish based on gyrB gene sequence. In this study, morphological and biochemical test is run to confirm that the bacteria isolates of A. hydrophila is the same isolate used in the previous studies, taken from healthy fish’s intestine (carp, tilapia, catfish, and goldfish). In addition, molecular identification was tested using lip gene detection as the specific gene of A. hydrophila. The results of morphological and biochemical test showed 6 isolates examined were A. hydrophila bacteria. The sixth isolates are identified as gram-negative bacteria with the form of short bacillus, facultative anaerobic bacteria, motile, and produces H2S gas, positive in oxidation test and has the ability of β hemolysis. Gene detection using lip gene on all isolates of A. hydrophila, revealed only 2 isolates which showed amplicon size of 760 bp. While the results of bioinformatics analysis using gyrB gene sequence showed that the six isolates are in the same group with A. hydrophila ATCC 7966.

(8)

1

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DARI ISOLAT IKAN SEHAT MENGGUNAKAN SIKUEN GEN gyrB

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Ikan dan produk olahan dari ikan memiliki nilai gizi yang sangat tinggi dan

bermanfaat bagi kesehatan. Meskipun merupakan makanan yang bergizi, namun

kontaminasi pada ikan sangat tinggi, karena ikan merupakan inang bagi bakteri

pathogen alami yang terdapat dilingkungan perairan (Illanchezian et al., 2010). Dari

berbagai tempat pembudidayaan ikan yang merupakan sumber ikan yang dikonsumsi

masyarakat diketahui memiliki permasalahan yang relatif sama, yaitu tingginya

tingkat kematian ikan karena adanya serangan penyakit yang diakibatkan oleh

bakteri. Bakteri yang banyak menyebabkan kematian pada ikan ini yaitu bakteri

Aeromonas hydrophila (Mangunwardoyo et al., 2010; Haryani et al., 2012; Dianti et

al., 2013). Bakteri A. hydrophila dapat menginfeksi ikan dan hewan-hewan yang

umumnya berhabitat di perairan. Sebenarnya bakteri A. hydrophila memiliki peranan

sebagai microbial flora bagi hewan-hewan air pada kondisi lingkungan yang stabil

(Cipriano, 2001), karena memiliki sifat opertunis bakteri ini dapat menjadi pathogen

bagi hewan air itu sendiri (Gardenia et al., 2010), sehingga bakteri ini dapat diisolasi

baik dari ikan sehat maupun ikan yang terinfeksi (Beaz-Hildago et al., 2014;

Vega-Sanchez et al., 2014). Beberapa tahun terakhir, ketertarikan para ilmuan terhadap

genus Aeromonas yang dapat menyebabkan patogen pada manusia meningkat secara

signifikan, karena meningkatnya penyakit akibat infeksi A. hydrophila terhadap ikan

yang menyebabkan penyakit pada manusia (Tekedar et al., 2013). Pemilihan sumber

isolat yang digunakan sendiri yang berasal dari intestin ikan sehat, bertujuan untuk

penelitian selanjutnya guna pengembangan vaksin bagi ikan yang berasal dari bakteri

A. hydrophila yang avirulen permanen, dan untuk mengetahui ekspresi dari gen yang

dapat mencegah eskpresi dari gen yang dapat menyebabkan A. hydrophila menjadi

pathogen bagi ikan.

Bakteri A. hydrophila merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang,

(9)

2

kemampuan memfermentasi glukosa serta dapat motil, karena memiliki flagel

(Yadav et al., 2014), range habitat A. hydrophila sangat luas. Akan tetapi pada

umunya bakteri ini banyak ditemukan dilingkungan akuatik (Figueras et al., 2011),

namun tetap dapat diisolasi dari ekosistem terestrial, seperti pada makanan, sayuran,

dan hewan perternakan (Martino et al., 2011). Bakteri A. hydrophila merupakan

bakteri patogen yang selain dapat menginfeksi ikan dan manusia juga dapat

menginfeksi invertebrata, reptil, dan amphibia (Jagoda et al., 2014a).

Klasifikasi genus Aeromonas ini sangat kompleks (Kupfer et al., 2006). Akan

tetapi dalam dua dekade terakhir, penelitian mengenai pendeskripsian setiap spesies

dalam genus ini meningkat secara progresif. Salah satu spesies yang taksonominya

masih diperdebatkan, hingga menjadi salah satu isu taksomoni yang konvensional

dalam genus ini yaitu spesies A. hydrophila. Karena spesies ini memiliki hubungan

yang sangat dekat dengan spesies A. bestiarum, A. salmonicida (Soler et al., 2004),

A. media (Kupfer et al., 2006), dan A. veronii (Alperi et al., 2010), sehingga

taksonomi A. hydrohila menjadi kompleks. Oleh karena itu, pendeskripsian

mengenai identifikasi bakteri A. hydrohila ini dirasa penting, mengingat besarnya

pengaruh bakteri A. hydrophila dalam klasifikasi genus Aeromonas.

Umumnya analisis filogenetik bakteri dilakukan dengan menggunakan sikuen

gen 16S rRNA, yang sudah menjadi prosedur yang baku guna merekonstruksi

sejarah evolusi dan menentukan hubungan filogenetik bakteri. Molekul 16S rRNA

ini memiliki sifat ubikuitas, yaitu terdapat dimana-mana, dengan sifat yang identik

pada seluruh organisme dan juga memiliki beberapa daerah yang urutan basanya

relatif konservatif, berfungsi untuk merekontruksi pohon filogenetik universal karena

mengalami perubahan yang relatif lambat (Stackebrandt & Goebel, 1995).

Menurut hasil penelitian Maesaroh (2013), dari 46 isolat bakteri yang diperoleh

dari intestin ikan sehat hanya 8 isolat yang digunakan untuk analisis filogenetik

bakteri A. hydrophila dengan menggunakan sikuen gen 16S rRNA, dengan hasil

yang menunjukkan kekerabatan yang tinggi baik antara seluruh isolat maupun

dengan A. hydrophila ATCC 7966, sebagai kontrol, sedangkan 38 isolat bakteri ikan

(10)

3

rRNA, karena berdasarkan pengujian morfologi, biokimia, dan molekuler dengan

deteksi gen lipase (lip) tidak menunjukkan indikasi sebagai bakteri A. hydrophila.

Empat isolat dari 8 isolat bakteri yang dianalisis dengan sikuen gen 16S rRNA telah

positif dalam identifikasi molekuler dengan menggunakan gen lipase (lip), dengan

target ukuran amplikon 760 pb (Cascon et al.,1996). Kedelapan isolat bakteri ini

juga memiliki karakteristik yang sama dengan A. hydrophila setelah dianalisis secara

morfologi dan biokimia, yaitu merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk batang, positif dalam uji oksidase dan β hemolisis, serta bakteri fakultatif anaerob dan dapat motil, hal ini sesuai dengan hasil positif pengujian bakteri A. hydrophila

secara biokimia yang juga dilakukan oleh Abbott et al. (2003).

Hasil analisis filogenetik bakteri Aeromonas dengan menggunakan sikuen gen

16S rRNA menunjukkan bahwa genus Aeromonas terdiri dari kelompok yang

memiliki hubungan filogenetik yang sangat dekat pada level spesies, yang hanya

dibedakan atas sedikit nukleotida (Kupfer et al., 2006). Faktanya gen 16S rRNA

memiliki daerah konservatif yang tinggi, sehingga dapat membuat pendeskripsian

baru dari beberapa spesies yang dipertanyakan (Yanez et al., 2003). Menurut Singh

et al. (2012), kemampuan sikuen gen 16S rRNA dalam analisis filogenetik bakteri

Aeromonas menunjukkan tingginya tingkat homologi antara berbagai strain bakteri

Aeromonas, sehingga penggunaan sikuen gen 16S rRNA tidak dapat menunjukkan

perbedaan interspesies A. hydrophila dan tidak dapat membedakan spesies genom

yang terkait erat (Demarta et al., 2004). Kupfer et al. (2006) membandingkan

penggunaan berbagai penanda molekuler seperti gen 16S rRNA dan gen

housekeeping, menyatakan untuk menganalisis hubungan filogenetik dan taksonomi

pada tingkat spesies penggunaan gen housekeeping lebih baik digunakan sebagai

penanda molekuler dibandingkan dengan gen 16S rRNA.

Pemilihan gen penanda untuk analisis filogenetika tidak dapat ditentukan begitu

saja, banyaknya gen terutama untuk katabolisme, diketahui dapat melakukan transfer

gen secara horizontal antara spesies bakteri yang berbeda, sehingga gen-gen tersebut

tidak dapat digunakan untuk melacak catatan evolusi bakteri inang atau nenek

(11)

4

filogenetika yaitu (i) gen essensial yang dapat digunakan dalam aktivitas

housekeeping, seperti replikasi DNA, transkripsi, dan translasi, (ii) gen penanda yang

dapat melakukan single copy pada setiap genom, dan (iii) gen yang memiliki

setidaknya dua wilayah konservasi untuk amplifikasi PCR dengan menggunakan

primer yang komplementer dengan wilayah konservasi tersebut (Yamamoto &

Harayama, 1996).

Beberapa gen memiliki fungsi yang sama dengan gen 16S rRNA, yaitu untuk

analisis filogenetik bakteria. Akan sangat baik jika gen tersebut juga memiliki sifat

sebagai gen housekeeping, seperti gyrB dan rpoB (Brady et al., 2010). Gen

housekeeping merupakan gen yang memiliki rerata evolusi lebih tinggi dari pada gen

16S rRNA (Avise, 1994). Lebih tingginya rerata evolusi pada gen housekeeping

menyebabkan gen tersebut dapat mengakumulasi perubahan yang terjadi pada lokus,

sehingga saat terjadi transfer gen secara horizontal yang dapat merubah genom yang

dimiliki bakteri, akibat dari perubahan lingkungan, gen housekeeping dapat

menyimpan perubahan tersebut (Lee & Cote, 2006). Sementara gen 16S rRNA

cenderung lebih lambat berevolusi meskipun memiliki sifat ubikuitas, namun saat

terjadi transfer gen secara horizontal yang dapat mengakibatkan perubahan genom

sehingga terjadi perubahan fenotip dalam waktu yang relatif singkat, gen konservatif

seperti gen 16S rRNA tidak sempat mengakumulasi perubahan tersebut, sehingga

perbedaan pada level antar spesies tidak dapat tergambarkan (Alperi et al., 2010).

Gen housekeeping atau gen fungsional yang banyak digunakan dalam analisis

filogenetik genus Aeromonas khususnya A. hydrophila adalah sikuen gen gyrB

(Yanez et al., 2003; Soler et al., 2004; Kufper et al., 2006). Sikuen gen gyrB (protein

subunit B dari DNA gyrase, DNA topoisomerase tipe II) lebih banyak digunakan,

jika dibandingkan dengan gen housekeeping lainnya, seperti sikuen gen rpoB, rpoD,

gyrA, pyrH, dan recA, untuk analisis filogenetik A. hydrophila karena dari hasil yang

didapatkan terlihat hasil pohon filogenetik dengan ranting yang jelas (Yanez et al.,

2003). Selain itu hasil perbandingan dengan sikuen gen rpoB, gen gyrB memiliki

nilai maksimum interspesies divergensi 15,2% lebih besar dari gen rpoB dengan nilai

(12)

5

dilakukan analisis filogenetik dengan menggunakan sikuen gen gyrB pada bakteri A.

hydrophila untuk mengetahui hubungan kekerabatan di level spesies, sebagai

penelitian lanjutan terhadap penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Maesaroh

(2013) dengan menggunakan sikuen gen 16S rRNA, yang bertujuan lebih

memperjelas keanekaragaman interspesies A. hydrophila.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah di atas maka rumusan masalah pada

penelitian ini adalah Bagaimanakah hubungan filogenetik bakteri A. hydrophila dari

isolat beberapa jenis ikan sehat dengan munggunakan sikuen gen gyrB?

C. Pertanyaan Penelitian

Adapun pertanyaan penelitian yang dikembangkan berdasarkan rumusan

masalah, yaitu:

1. Bagaimanakah karakteristik A. hydrophila yang terdapat pada isolat bakteri

yang berasal dari ikan sehat secara biokimia dan morfologi?

2. Bagaimanakah hubungan kekerabatan A. hydrophila dari isolat beberapa ikan

sehat dengan sikuen gen gyrB?

D. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah untuk mempelajari

hubungan kekerabatan A. hydrophila yang didapat dari beberapa jenis ikan sehat

berdasarkan sikuen gen gyrB.

E. Manfaat Penelitian

Beberapa manfaat yang ingin diberikan dari penelitian ini, diantaranya:

1. Memberikan gambaran mengenai hubungan kekerabatan bakteri A.

(13)

6

2. Memberikan gambaran mengenai perbandingan analisis filogenetik bakteri

A. hydrophila yang diisolasi dari beberapa ikan sehat dengan gen penanda

gyrB terhadap gen 16S rRNA.

3. Untuk mengidentifikasi jenis bakteri A. hydrophila yang terdapat pada ikan

sehat dengan gen penanda gyrB.

4. Sebagai tambahan ilmu khususnya bidang mikrobiologi dan biologi

molekuler.

F. Batasan Masalah

1. Isolat bakteri A. hydrophila dari intestin ikan sehat berasal dari penelitian

sebelumnya yang telah dilakukan oleh Maesaroh (2013).

2. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen gyrB adalah primer forward

(14)

86

DAFTAR PUSTAKA

Abbott, S. L., Wendy K. W., Cheung, & Janda, J. M. (2003). The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. Journal Of Clinical Microbiology, 41(6).

Abbott, S.L. & Janda, J.M. (2010). The genus Aeromonas: taxonomy, pathogenicity, and infection. Clinical Microbiology Reviews, 23(1), hlm. 35-75.

Acumedia. (2011). MacConkey agar (7102). [Online]. Diakses dari http://www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7102_PI.pdf.

Alperi, A., Martinez-Murcia, A. J., Monera, A., Saavedra, M. J., & Figueras, M. J. (2010). Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from a spainsh river. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 60, hlm. 72-77.

Aravena-Roman, M., Harnett, G. B., Riley, T. V., Inglis, T. J. J., & Chang, B. J. (2011). Aeromonas aquariorum is widely distributed in clinical and environmental specimens and can be misidentified as Aeromonas hydrophila. Journal of Clinical Microbiology, 49(8), hlm. 3006-3008.

ASMMicrobelibrary. (2013a). Indol test protocol. [Online]. Diakses dari http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3202-indole-test-protocol.

ASMMicrobelibrary. (2013b). Citrate test protocol. [Online]. Diakses dari http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3202-citrate-test-protocol.

ASMMicrobelibrary. (2013c). Methyl Red and Voges-Proskauer test protocols. [Online]. Diakses dari http://www.microbelibrary.org/component/resource/ laboratory-test/3202-methyl-red-and-voges-proskauer-test-protocol.

(15)

87

isolates with spoilageof common carp (Cyprinus carpio). FEMS Microbiology Letters Advance Access.

Bergey’s Manual of Systematics Determinative Bacteriology of Archaea and Bacteria. (2005). Bergey’s Manual of Systematics Determinative Bacteriology of Archaea and Bacteria. [Online]. Diakses dari http://www.bacterio.cict.fr/.

Brady, C., Denman, S., Kirk, S., Venter, S., Rodriguez-Palenzuela, P., & Countinho, T. (2010). Description of Gibbsiella quercinecans gen. nov., sp. nov., associated with acute oak decline. Systematic and Applied Microbiology, 33, hlm. 444-450.

Brumlik, M. J. & Buckley, J. T. (1996). Identification of the catalytictriad of the lipase/ acyltransferase from Aeromonas hydrophila. Journal of Bacteriology, hlm. 2060-2064.

Bryn, K., Ulatrup, J. C., & Stbrmer, F. C. (1973). Effect of acetate upon the formation of acetoin in Klebsiella and Enterobacter and its possible practical application in a rapid Voges-Proskauer test. Applid Microbiology, American Society for Microbiology, 25(3).

Buxton, R. (2013). Blood agar plates and hemolysis protocols. American Society for Microbiology. California: the benjamin comings publishing company Inc.

Carvalho, M. J., Martinez-Murcia, A., Esteves, A. C., Correia, A., & Saavedra, M. J. (2012). Phylogenetic diversity, antibiotic resistence and virulence traits of Aeromonas spp. from untreated water for human consumption. Int. J. Food Microbioll, 159(3), hlm. 230-239.

Cascon, A., Juan, A., Hernanz, C., Mari´A. S., Ferna, N., & Germa´N. N. (1996). Identification of Aeromonas hydrophila hybridization group 1 by PCR assays. Applied And Environmental Microbiology, American Society For Microbiology, 62(4).

(16)

88

Chirila, F., N. Fit, G. Nadas, O. Negrea, & R. Ranga. (2008). Isolation and characterization of an Aeromonas hydrophila strain in a crap (Cyprinus carpio) toxemia focus. Bulletin UASVM VeterinaryMedecine, 65(1).

Cipriano, R. C. (2001). Aeromonas hydrophila and motile Aeromonas septicemias of fish. U.S. Geological Survey, Leetown Science Center, National Fish Health Research Laboratory.

Conda. (2013). MacConkey agar European Pharmacopoeia. Pronadisa Micro and Molecular Biology.

Costenaro, L., Grossmann, J. G., Ebel, C., & Maxwell, A. (2005). Small-angle X-ray scattering reveals the solution structure of the full-length DNA gyrase A subunit. Structure, 13, hlm. 287-296.

Cynthia, S. (2007). Lab manual untuk mikrobiologi untuk ilmu kesehatan. [Online]. Diakses dari http://onbonsai.com/201110/agar-darah-bap-medium-pertumbuhan-bakteri.htm.

Deen, A. E. N. E., Dorgham, S. M., Hassan, A. H. M., & Hakim, A. S. (2014). Studies on Aeromonas hydrophila in cultured Oreochromis niloticus at Kafr El Sheikh governorate, Egypt with reference to histopathological alterations in some vital organs. World Journal of Fish and Marine Sciences, 6(3), hlm. 233-240.

Demarta, A., de Respinis, S., & Peduzzi, R. (2004). Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of 16S rDNA and gyrB genes sequence analysis. FEMS Microbiology Letters, 238, hlm. 423-428.

Departement of Veterinary Disease Biology. (2011). Aeromonas hydrophila.

[Online]. Diakses dari

http://picture.life.ku.dk/atlas/microatlas/food/bacteril/Aeromoas_hydrophil a/.

Dewi, C. L. H. (2012). Analisis biomolekuler gen internal transcribed spacer (ITS) dalam studi filogenetik Zingiber loerzingii Valeton (Zingiberaceae). (Skripsi). Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

Dianti, L., Prayitno, S. B., & Ariyati, R. W. (2013). Ketahanan nonspesifik ikan mas (Cyprinus carpio) yang direndam ekstrak daun jeruji (Acanthus ilicifolius) terhadap infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. Journal of Aquaculture Management and Technology, 4(2), hlm. 63-71.

(17)

89

Erdem, B., Kariptaş, E., Cil, E., & Işik, K. (2011). Biochemical identification and numerical taxonomy of Aeromonas spp. Isolated From Food Samples In Turkey. Turk J Biol, 35, hlm. 463-472

Figueras, M. J., Breambilla, E., Alperi, A., Monera, A., Beaz-Hidalgo, R., Stackebrandt, E., & Martinez-Murcia, A. J. (2011). Aeromonas rivuli sp. nv., isolated from the upstream region of a karst water Rivulet. International Journal of Systematic and Evolutanary Microbiology, 61, hlm 242-248.

Gardenia, L., Koesharyani, I., Supriyadi, H., & Mufidah, T. (2010). Aplikasi Aeromonas hydrophila penghasil aerolisin dengan menggunakan Polimerase Chain Reaction (PCR). Prosiding forum Inovasi Teknologi Akuakultur. Pusat Riset Perikanan Budidaya.

Griffin, M. J., Goodwin, A. E., Merry, G. E., Liles, M. R., Williams, M. A., Ware, C., & Waldbieser, G. C. (2013). Rapid quantitative detection of Aeromonas hydrophila associated with disease outbreaks in catfish aquaculture. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 25(4), hlm. 473-481.

Hall, T. (2004). BioEdit version 7.0.0. Ibis Therapeutics, a division of Isis Pharmaceuticals, Inc.

Haryani, A., Grandiosa, R., Buwono, I. D., & Santika, A. (2012). Uji efektivitas daun pepaya (Carica papaya) untuk pengobatan infeksi bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan mas koki (Carassius auratus). Jurnal Perikanan dan Kelautan, 3(3), hlm. 213-220.

Hayes, J. (2004). Aeromonas hydrophila. [Online]. Diakses dari http://hmsc.oregonstate.edu/classes/MB492/hydrophilahayes/.

Herupradolto, B. A. & Yuliani, G. A. (2010). Karakteristik protein spesifik Aeromonas hydrophila penyebab penyakit ulser pada ikan mas. Jurnal Veteriner, 3(11), hlm. 158-162.

Hidayat. T, Kusumawaty. D, Kusdianti, Yati. D. D, Muchtar. Astry. A, & Mariana. D. (2008). Analisis filogenetika molekuler pada Phyllanthus Niruri L. (Euphorbiaceae) menggunakan urutan basa DNA daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). Jurnal Matematika & Sains ITB, 13, hlm. 16-21.

Hidayat, T & Pancoro, A. (2006). Sistematika dan filogenetik molekuler. kursus simgkat aplikasi peramgkat lunak PAUP dan MrBayes untuk penelitian filogenetika molekuler SITH-ITB.

(18)

90

Hu, M., Wang, N., Pan, Z. H., Lu, C. P., & Liu, Y. J. (2011). Identity and virulence properties of Aeromonas isolates from diseased fish, healthy controls and water environmental in China. Letters in Applied Microbiology, 55(3), hlm. 224-233.

Illanchezian, S., Jayaraman, S. K., Manoharan, M. S., & Valsalam, S. (2010). Virulence and cytotoxicity of seafood borne Aeromonas hydrophila. Brazilian Journal of Microbiology, 41, hlm. 978-983.

Jagoda, S. S. S. de S., Tan, E., Arulkanthan, A., Kinoshita, S., Watabe, S., & Asakawa, S. (2014a). Draft genome sequence of Aeromonas hydrophila strain Ae34, isolated from a septicemic and moribund koi carp (Cyprinus caprio koi), a freshwater aquarium fish. GenomeA Journals ASM, 3(2).

Jagoda, S. S. S. de S., Wijewardana, T. G., Arulkanthan, A., Igarashi, Y., Tan, E., Kinoshita, S., Watabe, S., & Asakawa, S. (2014b). Characterization and antimicrobial susceptibility of motile Aeromonads isolated from freshwater ornamental fish showing signs of septicaemia. Diseases of Aquatic Organisms, 109, hlm. 127-137.

Jayavignesh, V., Kannan, K. Sendesh, B., & Abhijith, D.. (2011). Biochemical characterization and cytotoxicity of the aeromonas hydrophila isolated from catfish. Scholars Research Library, 3(3), hlm. 85-93.

Karp, A., Kresovich, S., Bhat, K. V., Ayad, W. G., & Hodgkin, T. (1997). Molecular tool in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI Tech. Bull, 2.

Khalaf, S. H., Ali, T. S., & Dhahi, S. J. (2005). The use of modified Rimler-Shotts agar as a selective medium for the isolation of Aeromonas species from children diarrhea in Mosul-Iraq. Raf. Jour. Sci, 16(7), hlm. 5-14.

Kupfer, M., Kuhnert, P., Korczak, B. M., Peduzzi, R., & Demaerta, A. (2006). Genetic relationships of Aeromonas strains inferred from 16S rRNA, gyrB and rpoB gene sequences. International Journal of Systematic and Evalutionary Microbiology, 56, hlm. 2743-2751.

Lee, S., Kim, S. Oh, Y., & Lee, Y. (2000). Characterization of Aeromonas hydrophila isolated from rainbow trouts in Korea. The Journal of Microbiology, 38(1), hlm. 1-7.

Lee, H. Y. & Cote, J. C. (2006). Phylogenetic analysis of -proteobacteria inferred from nucleotide sequence comparisons of the housekeeping genes adk, aroE and gdh: comparisons with phylogeny inferred from 16S rRNA gene sequences. J. Gen. Appl. Microbiol., 52, hlm. 147-158.

(19)

91

molecular biology using matlab. Proc. Cairo International Biomedical Engineering Conference.

Macrogen. (2014). Macrogen sequencing troubleshooting giude. [Online]. Diakses dari http://www.macrogen.com/eng/business/seq_service1.html.

Maesaroh. (2013). Analisis filogenetik isolat bakteri Aeromonas hydrophila dari ikan sehat menggunakan gen 16S rRNA. (Skripsi). FPMIPA UPI Bandung.

Manik, V. T. (2013). Identifikasi dan filogenetika bakteri Aeromonas sp. isolat air kolam beberapa kota berdasarkan sikuen gen 16S rRNA. (Skripsi). FPMIPA UPI Bandung.

Mangunwardoyo, W., Ismayasari, R., & Riani, E. (2010). Uji patogenisitas virulensi Aeromonas hydrophila stanier pada ikan nila (Oreochromis niloticus Lin.) melalui postulat koch. J. Ris. Akuakultur, 5(2), hlm. 245-255.

Martin-Carnahan, A. & Joseph, S. W. (2005). Bergey’s manual of systematics of determinative bacteriology 2nd Ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.

Martinez-Murcia, A. J. (1999). Phylogenetic positions of Aeromonas encheleia, Aeromonas popoffii, Aeromonas DNA hybridization group 11 and Aeromonas group 501. Int J Syst Bacterial, 49, hlm. 1403-1408.

Martino, M. E., Manfrin, A., Fasolato, L., Patarnello, T., Montemurro, F., Novelli, E., Rosteghin, M., & Cardazzo, B. (2011). determination of microbial diversity of Aeromonas strains on the basis of multilocus sequence typing, phenotype and presence of putative virulence genes. Applied and Environmental Microbiology, 14(77), hlm. 4986-5000.

Nikiforov, I., Goldman, J., Cheriyath, P., Vyas, A., & Nookala, V. (2014). Aeromonas hydrophila sepsis associated with consumption of raw oysters. Hindawi Publishing Corporation Case Reports in Infectious Diseases, 3.

Noga, J. E. (2000). Fish disease diagnosis and treatment. Lowa State Press. USA, 366p.

Nyffeler, R & D. A. Baum. (2000). Phylogenetic relationships of the durians (Bombacaceae Durioneae or [Malvaceae] Helicteroideae/ Durioneae) based on chloroplast and nuclear ribosomal DNA sequences. Plant Systematics and Evolution, 224, hlm. 55-82.

(20)

92

Pangastuti, A. (2006). Review: species definition of procaryotes based on 16S rRNA and protein coding genes sequence. Biodiversitas, 3(7), hlm. 292-296.

Pelczar, M. J. & Chan, E. C. S., (2005). Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press).

Pevsner, J. (2003). Bioinformatics and functional genomics. New Jersey: Wiley Liss, John Wiley & Sons, Inc..

Popoff, M. (1984). Bergey’s manual of systematics of determinative bacteriology 1st Ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.

Pridgeon, J. W. & Klesius, P. H. (2011). Molecular identification and virulence of three Aeromonas hydrophila isolates cultured from infected channel catfish during a disease outbreak in West Alabama (USA) in 2009. Diseases of Aquatic Organisms, 94(3), hlm. 249-253.

Promega. (2013). PCR Master Mix. Promega Corporation.

Purnomo, M. & Pudjoarinto, A. (1999). Struktur perkembangan i (morfologi tumbuhan). Yogyakarta: Fakultas Biologi UGM.

Purwoko, T. (2009). Fisiologi mikroba. Jakarta: PT. Bumi Aksara.

Santoso, P. J., Saleh, G. B., Saleh, N. M., & Napis, S. (2005). Phylogenetic relationships amongst 10 Durio species based on PCR-RFLP analysis of two chloroplast genes. Indonesian Journal of Agricultural Science, 6(1), hlm. 2027.

Sarkar, A., Saha, M., & Roy, P. (2013). Detection of 232bp virulent gene of pathogenic Aeromonas hydrophila through PCR based technique: (a rapid molecular diagnostic aproach). Advances in Microbiology, 3, hlm. 83-87.

Shotts, E. B. & Rimler, R. (1973). Medium for the isolation of Aeromonas hydrophila. College of Veterinary Medicine American Society for Microbiology, 26(4).

Singh, V., Somvanshi, P., Rathore, G., Kapoor, D., & Misrha, B. N. (2010). Gene cloning, expression, and characterization of recombinant aerolysin from Aeromonas hydrophila. Appl. Biochem Biotechnol, 160, hlm. 1985-1991.

(21)

93

SNI 7303. (2009). Metode identifikasi Aeromonas hydrophila secara biokimia. BSNI.

Soler, L., Yanez, M. A., Chacon, M. R., Aguilera-Arreola, M. G., Catalan V., Figueras, M. J. & Martinez-Murcia, A. J. (2004). Phylogenetic analysis of the genus Aeromonas based on two housekeeping genes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, hlm. 1511-1519.

Stackebrandt, E. & Goebel, B. M. (1995). A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. International Jurnal of Systematic Bacteriology, 44, hlm. 846-849.

Subandi, H. M. (2010). Mikrobiologi. Bandung: PT Remaja Rosdakarya.

Swaminathan, T. R., Rathore, G., Rehana, A., Kapoor, D. (2004). Detection of Aeromonas hydrophila byPolymerase Chain Reaction. Indian J. Fish, 51(1), hlm. 251-254.

Syadza, A. (2012). Karakterisasi gen virulen dan uji patogenitas bakteri Aeromonas hydrophila strain A2 pada ikan gurame (Osphronemus gouramy). (Skripsi). FPMIPA UPI Bandung.

Tekedar, H. C., Waldbieser, G. C., Karsi, A., Liles, M. R., Griffin, M. J., Vamenta, S., Sonaegard, T., Hossain, M., Schroeder, S. G., Khoo, L., & Lawrence, M. (2013). Complete genome sequence of a channel catfish epidemic isolate, Aeromonas hydrohila strain ML09-199. Genomea.asm.org, 5(1).

Thermo Scientific. (2012). DreamTaq Green PCR Master Mix. Product Information Thermo Scientific.

Vega-Sanchez, V., Latif-Eugenin, F., Soriano-Vargas, E., Beaz-Hildago, R., Figueras, M. J., Aguilera-Arreola, M. G., & Castro-Escarpulli, G. (2014). Re-identification of Aeromonas isolates from rainbow trout and incidence

of class 1 integron and -lactamase genes. Veterinary Microbiology, 172, hlm. 528-533.

Vivas, J., Carracedo, B., Riano, J., Razquin, B. E., Lopez-Fierro, P., Acosta, F., Naharro, G., & Villena, A. J. (2004). Behavior of an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine in water microcoms. Applied and Environmental Microbiology, 70(5), hlm. 2702-2708.

(22)

94

Aeromonas sobria by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, 41(3), hlm. 1048-1054.

Watson, J. D., Baker, T. A., Bell, S. P, Gann, A., Levine, M., & Losick, R. (2004). Molecular biology of the gene. United States of America: Pearson Benjamin Cummings.

Yamamoto, S. & Harayama, S. (1995). PCR ampllificatioon and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their applicatin to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains. Appl. Enverion Microbiol, 61, hlm. 1104-1109.

Yamamoto, S. & Harayama, S. (1996). Phylogenetic analysis of Acinetobacter strains based on the nucleotide sequences of gyrB genes and on the amino acid sequences of their product. Int J Syst Bacterial, 46, hlm. 506-511.

Yadav, S. Kumara, S., Pramod K., & Dixit, A. (2014). Characterization of immune respone elicited by the recombinant outer membrane protein OmpF of Aeromonas hydrophila, a potential vaccine candidate in murine model. Molecular biology reports, 41(2), hlm. 1837-1848.

Yanez, M. A., Catalan, V., Apraiz, D., Figueras, M. J., & Martinez-Murcia, A. J. (2003). Phylogenetic analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53, hlm. 875-883.

Yu, H. B., Zhang, Y. L., Lau Y.L., Yao, F, Vilches, S., Merino, S., Tomas, J. M., Howard, S. P., Yeung, K.Y. (2005). Identification and characterization of putative viral genes and gene clusters in Aeromonas hydrophila. Appl. Environ Microbiol, 71, hlm. 4469-4477.

Yuwono, T. (2005). Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.

Zhang, X., Yang, W., Wu, H., Gong, X., & Li, A. (2014). Multilocus sequence typing revealed a clonal lineage of Aeromonas hydrophila caused motile Aeromonas septicemia outbreaks in pond-cultured cyprinid fish in an epidemic area in central China. Aquaculture, 432, hlm. 1-6.