Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila

(1)

EVALUASI KETAHANAN IKAN MAS TURUNAN KETIGA YANG

**MEMPUNYAI MARKA MOLEKULER Cyca-DAB1*05 TERHADAP**

INFEKSI BAKTERI Aeromonas hydrophila

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

(2)

(3)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Evaluasi Ketahanan Ikan

Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

(4)

RINGKASAN

LA ODE MUHAMMAD ARSAL. Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA, SRI NURYATI dan ALIMUDDIN.

Serangan penyakit merupakan salah satu kendala utama dalam kegiatan budidaya ikan mas Cyprinus carpio, yang dapat menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup tinggi, sehingga perlu penanganan yang cukup serius guna mengurangi tingkat kerugian yang ditimbulkan. Adanya infeksi akan ditanggapi oleh sistem pertahanan tubuh khususnya imun non-spesifik sebagai pertahanan pertama terhadap infeksi. Respons imun non-spesifik tersebut dapat diamati melalui uji gambaran darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan mas turunan ketiga (F3) yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 terhadap gambaran darah sebagai respresentasi tanggap kebal ikan mas, serta tingkat kelangsungan hidup ikan mas pascainfeksi.

Penelitian ini dilakukan dengan menginfeksikan bakteri A. hydrophila sebanyak 0,1 mL dengan kepadatan bakteri 108 cfu/mL pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05. Sebagai kontrol digunakan ikan mas tanpa marka (tidak diseleksi kandungan marka molekulernya), yang diperoleh dari pembudidaya ikan di Bogor, diinfeksi dengan bakteri sebagai kontrol positif, dan diinjeksi dengan bufer fosfat salin sebagai kontrol negatif. Masing-masing perlakuan terdiri atas tiga ulangan. Sebanyak 180 ekor ikan mas diuji tantang menggunakan A. hydrophila, dan ikan dipelihara dalam akuarium berukuran 100x100x60 cm3. Uji tantang dilakukan selama 14 hari. Parameter yang diamati meliputi gambaran darah dan kelangsungan hidup ikan. Darah diambil pada hari ke-0, 3, 7 dan 14 pascainfeksi untuk menghitung total sel darah merah, hemoglobin, hematokrit, total sel darah putih, dan diferensial leukosit.

Hasil penelitian terhadap gambaran darah menunjukkan bahwa ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki imunitas yang lebih baik dibandingkan ikan mas kontrol. Pada hari ke-3 pascainfeksi, terjadi penurunan total sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit. Sebaliknya, pada hari ke-3, total sel darah putih meningkat sebagai indikasi respons imun non-spesifik. Hari ke-7 merupakan puncak dari kinerja respons imun non-spesifik yang ditandai dengan peningkatan total sel darah putih dibandingkan hari ke-3, serta adanya peningkatan persentase monosit dan neutrofil yang berperan dalam mengeliminasi patogen. Hari ke-14, respons imun non-spesifik mengalami penurunan, terlihat dari berkurangnya total sel darah putih, dan diiringi dengan peningkatan total sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit. Pengamatan terhadap tingkat kelangsungan hidup menunjukkan ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki tingkat kelangsungan hidup 2,6 kali lebih tinggi dibandingkan ikan mas tanpa marka. Dengan demikian, profil gambaran darah ikan mas sejalan dengan daya tahannya terhadap infeksi A. hydrophila.

(5)

SUMMARY

LA ODE MUHAMMAD ARSAL. Evaluation of Resistances of the 3rd Generation Common Carp having Cyca-DAB1*05 Molecular Marker Against Aeromonas hydrophila Infection. Supervised by MUNTI YUHANA, SRI NURYATI and ALIMUDDIN.

Infectious disease is one of the major constraints in aquaculture of common carp Cyprinus carpio, which can cause high economic losses, so it needs a serious treatment to reduce the level of losses incurred. Infection should be dealt with by the immune defense system of the body, especially the non-specific as the first defense against infection. Non-specific immune response can be observed through hematologycal test. This study was performed to observe the effect of bacterial Aeromonas hydrophila infection on blood profilesas representative of common carp immune response, and the survival of fish

The study was performed by infecting 0.1 mL bacterial A. hydrophila of 108 cfu/mL to common carp possessing a Cyca-DAB1*05 molecular marker. Fish without the marker obtained from farmer in Bogor was used as control; infected by bacterial as positive control and with phosphate buffer salin as negative control. Each treatment was consisted of three replications. Challenge test was conducted for 14 days and blood was collected at day 0, 3, 7 and 14 post-infection. As many as 180 common carp was challenged with A. hydrophila, and maintained in an aquarium sized 100x100x60 cm3. The observed parameters were blood profiles and the survival of fish. Blood samples were collected at day 0, 3, 7 and 14 post infectionsto measuring the numbers red blood cells, hemoglobin, hematocrite, number of leukocytes and differential leukocytes.

The results of this study showed that common carp possessing Cyca-DAB1*05 molecular marker have better non-specific immunity than control. On day 3post-infection (pi), number red blood cells, hemoglobin and hematocrite was decreased. In contrast, on day 3, total white blood cell as an indication of non-specific immune response was increased. Day 7was the peak of the non-non-specific immune response indicated by an increase in total white blood cells compared to day 3, as well as an increase in the percentage of monocytes and neutrophils that play a role in eliminating pathogens. At day 14, non-specific immune responseswere decreased, it seen from the reduction in the number of white blood cells, and accompanied by an increase in he red blood cells, hemoglobin and hematocrite. Observations on survival showed thatfish possessing Cyca-DAB1*05 molecular marker have 2.6 times higher survival than the control. Thus, common carp blood profiles were in line with the resistance to A. hydrophila infection. Keywords: Cyprinus carpio, Aeromonas hydrophila, molecular marker,

(6)

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

(7)

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

EVALUASI KETAHANAN IKAN MAS TURUNAN KETIGA YANG

**MEMPUNYAI MARKA MOLEKULER Cyca-DAB1*05 TERHADAP**

INFEKSI BAKTERI Aeromonas hydrophila

LA ODE MUHAMMAD ARSAL

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(8)

(9)

Judul Tesis : Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila

Nama : La Ode Muhammad Arsal NIM : C151100151

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Dr. Munti Yuhana, SPi MSi Ketua

Dr. Sri Nuryati, SPi, MSi

Anggota Dr. Alimuddin, SPi, MSc Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur

Dr. Ir. Widanarni, MSi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dahrul Syah, MScAgr

(10)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila” berhasil diselesaikan.Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai dengan bulan Agustus 2014, yang bertempat di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Departemen Budidaya Perairan (BDP) serta Laboratorium Kesehatan Ikan BDP-FPIK-IPB.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Munti Yuhana, SPi MSi, Ibu Dr Sri Nuryati, SPi MSi dan Bapak Dr Alimuddin, SPi MSc selaku pembimbing. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta, Bapak La Ode Fahuma, SH MH (alm.) dan Ibu Samria, Kakak Wa Ode Sitti Ilmawati, SSi MSc, adik Wa Ode Siti Musnina, SSi MSc, Wa Ode Sitti Aztin, SSi, serta seluruh keluarga atas doa dan motivasinya. Terimakasih penulis ucapkan kepada Sitti Yani, S.Si M.Si* yang setia menemani dan terus

memberikan semangat serta do’a, You are the best. Terima kasih kepada

pihak-pihak yang telah membantu serta memberikan masukan dan ide yang membangun, Pak Ranta, teman-teman Laboratorium Kesehatan Ikan yang telah membantu proses analisis sampel Dendi Hidayatullah, SPi, serta teman-teman Laboratorium Reproduksi & Genetik Organisme Akuatik, Rangga Gernama, SPi, Asep Akmal, SPi, Darmawan, SPi MSi, Fajar Maulana, SPi MSi yang senantiasa membantu dan menyemangati selama masa penelitian. Terima kasih kepada saudara-saudaraku di Wisma Firdaus (Kost AA) Dwi Arinto, SSi MSi, Ary Tjahyadi, SSi, La Ode Muh. Hazairin Nadia, SPi, Agusrinal, SSi, Tezza Fauzan, SPi MSi, Arfan Afandi, SPi, Ansar SPi. Terima kasih penulis ucapkan kepada teman-teman Forum Wacana Sulawesi Tenggara. Terima kasih pula penulis ucapkan kepada teman-teman mahasiswa Program Studi Ilmu Akuakultur angkatan 2010 atas kekompakan serta motivasinya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

(11)

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang ... 1

Perumusan Masalah ... 2

Tujuan ... 2

Manfaat ... 2

METODOLOGI 3 Preparasi Bakteri ... 3

Penentuan LD-50 ... 3

Persiapan Ikan Uji... 3

Uji Tantang ... 3

Parameter Uji ... 4

Pengambilan Sampel Darah ... 4

Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah ... 4

Penghitungan Kadar Hemoglobin... 5

Penghitungan Kadar Hematokrit ... 5

Penghitungan Jumlah Total Sel Darah Putih ... 5

Diferensial Leukosit... 6

Pengamatan Kelangsungan Hidup ... 6

Respons Makan ... 6

Gejala Klinis ... 6

Analisis Data ... 6

HASIL DAN PEMBAHASAN 7 Hasil ... 7

Pembahasan ... 12

KESIMPULAN DAN SARAN 19 Kesimpulan ... 19

Saran ... 19

DAFTAR PUSTAKA 21

LAMPIRAN 25

(12)

DAFTAR GAMBAR

1 Total sel darah merah (SDM) ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M), dan tanpa marka yang diperoleh dari

pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila……. ……..7

2 Kadar hemoglobin ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………8

3 Nilai hematokrit ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………9

4 Total sel darah putih ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………9

5 Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N)………..…...……10

6 Persentase monosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N).………...……….10

7 Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N)……….11

8 Kurva kelangsungan hidup ikan mas selama percobaan yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 dan tanpa marka .………..…………11

9 Gejala klinis pada ikan mas pascainfeksi bakteri Aeromonas hydrophila (A & B= radang pada lokasi suntik + hemoragi; C = nekrosis/kerusakan jaringan; D = tukak/ulcer).……….……..15

(13)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan salah satu komoditas budidaya utama di Indonesia. Kebutuhan pasar yang tinggi diimbangi dengan produksi ikan mas dalam jumlah yang besar melalui sistem budidaya intensif dengan tingkat kepadatan tinggi. Namun demikian, dibalik keberhasilan tersebut masih terdapat faktor pembatas dalam pelaksanaan budidaya ikan mas berupa serangan penyakit, baik bakterial maupun viral yang juga merupakan salah satu permasalahan utama dalam kegiatan akuakultur (Gilad et al. 2003). Angka kematian kumulatif yang terkait dengan wabah penyakit memberikan dampak negatif yang besar pada industri budidaya berupa kerugian ekonomi yang cukup signifikan.

Salah satu bakteri yang sering menyerang ikan mas adalah Aeromonas hydrophila. Gejala infeksi A.hydrophila meliputi pembengkakan jaringan, perdarahan yang meluas pada permukaan kulit (haemorrhagic septicemia), nekrosis, luka pada kulit hingga luka terbuka (ulcer) pada permukaan tubuh atau hingga ke dalam jaringan (Mu et al. 2011; Pridgeon dan Klesius 2011). Pada beberapa jenis ikan lain sering ditemukan tanda klinis seperti sirip punggung dan sirip ekor rontok, serta pembengkakan pada perut dan berisi cairan (dropsy), yang diikuti dengan kematian (Popma & Masser 1999; Yuasa et al. 2003). Ikan-ikan dari golongan cyprinidae, siluridae, ictaluridae, serta claridae adalah ikan yang rentan terhadap serangan A. hydrophila. Meskipun sering dianggap sebagai patogen sekunder yang terkait dengan wabah penyakit, A. hydrophila juga bisa menjadi patogen utama, yang menyebabkan wabah dengan angka kematian yang tinggi (Pridgeon et al. 2011).

Adanya infeksi akan ditanggapi oleh sistem imun dengan mengaktifkan kekebalan tubuh bawaan (non-spesifik) yang merupakan pertahanan dasar pertama yang aktif ketika terjadi infeksi baik viral maupun bakterial. Pada ikan, respons imun bawaan memiliki peranan yang sangat penting dalam hal pertahanan menghadapi invasi patogen (Uribe et al. 2011). Sistem pertahanan tubuh bawaan seperti sel fagosit, monosit dan neutrofil akan diaktifkan ketika terjadi infeksi.

(14)

2

Saat ini major histocompatibility complex (MHC) merupakan marka yang umum digunakan dalam studi mengenai hubungan daya tahan ikan terhadap suatu penyakit. Hal ini didasarkan karena MHC berperan penting dalam sistem imun. MHC dikodekan oleh dua subfamili utama, yakni MHC kelas I dan kelas II yang berfungsi untuk mengikat dan menyajikan antigen ke limfosit T melalui molekul CD8+ dan CD4+ (Rakus 2008). MHC kelas I dan kelas II berperan dalam pengenalan beragam patogen, antigen peptida asing dan berperan penting dalam respons imun, baik bawaan maupun adaptif (Kales 2006).

Dengan menggunakan metode polymerase chain reaction, ikan mas yang tahan terhadap infeksi patogen dapat diidentifikasi dengan primer yang didesain dari sekuen Cyca-DAB1*05 yang termasuk MHC kelas II (Alimuddin et al. 2011). Saat ini telah diproduksi ikan mas strain Majayala generasi ketiga (F3) di Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar Sukabumi, yang membawa marka molekuler MHC. Ikan mas F3 tersebut merupakan hasil pemijahan ikan F2 jantan dan F2 betina yang tahan penyakit dan juga membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05. Daya tahan terhadap patogen dan korelasinya dengan gambaran darah perlu diuji sebelum ikan tersebut dapat dirilis ke pembudidaya.

Perumusan Masalah

Aeromonas hydrophila merupakan bakteri yang sering menyerang ikan mas, baik di lingkungan alami maupun di wadah budidaya terkontrol. Akibat dari serangan A. hydrophila, pembudidaya dapat mengalami kerugian yang signifikan, sehingga perlu suatu usaha penanggulangan yang serius guna mencegah penularan penyakit serta menekan kerugian ekonomi yang ditimbulkan. Salah satu usaha yang dikembangkan hingga saat ini adalah dengan mengembangkan jenis ikan mas yang tahan terhadap A. hydrophila melalui seleksi dengan bantuan marka molekuler major histocompatibility complex II (Alimuddin et al. 2011). Individu ikan mas yang tahan terhadap serangan A. hydrophila dianggap memiliki tingkat imunitas yang lebih baik sehingga apabila kemudian dikembangkan sebagai induk, maka keturunannya diharapkan memiliki daya tahan yang tinggi terhadap serangan A. hydrophila.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh infeksi bakteri A. hydrophila pada ikan mas F3 yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 terhadap gambaran darah sebagai respresentasi tanggap kebal ikan mas serta pengaruhnya terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan mas pascainfeksi.

Manfaat

(15)

3

METODOLOGI

Preparasi Bakteri

Bakteri Aeromonas hydrophila yang digunakan berasal dari Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen BDP, FPIK-IPB. Bakteri A. hydrophila ditumbuhkan pada media trypticase soy agar (TSA). Selanjutnya bakteri A. hydrophila tersebut diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 24-25˚C pada media TSA miring pada

tabung reaksi. Biakan A. hydrophila diambil menggunakan jarum Ose sampai memenuhi lingkaran jarum, kemudian dilarutkan dalam media tripticase soy broth (TSB). Bakteri tersebut diinkubasi selama 18-24 jam dalam waterbath. Selanjutnya bakteri hasil inkubasi digunakan dalam uji tantang.

Penentuan LD-50

Penentuan LD-50 bertujuan untuk mengetahui konsentrasi bakteri yang dapat menyebabkan kematian sebanyak 50% pada ikan uji setelah proses infeksi melalui metode penyuntikan. Ikan disuntik secara intramuskuler menggunakan bakteri A. hydrophila sebanyak 0,1 mL dengan konsentrasi 108_{, 10}7_{, 10}6_{, 10}5_{, 10}4_,

dan 103 cfu/mL. Ikan uji merupakan ikan mas dengan bobot 10-15 gram sebanyak 10 ekor untuk setiap perlakuan. Hasil dari uji LD-50 menunjukkan bahwa dosis yang dapat membunuh ikan mas sekitar 50% adalah konsentrasi 108 cfu/mL. Hasil uji LD-50 selanjutnya digunakan untuk penyuntikan ikan pada saat uji tantang.

Persiapan Ikan Uji

Ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan mas keturunan ketiga (F3) yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05, hasil pemijahan di Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar (BBPBAT), Sukabumi, serta ikan mas yang tidak membawa marka (tidak diseleksi kandungan marka molekulernya) diperoleh dari pembudidaya di wilayah Bogor. Ikan mas F3 tersebut diaklimatisasi selama 2 minggu dalam wadah akuarium berukuran 100x100x60 cm3, sebanyak 6 buah, dan setiap akuarium diisi sebanyak 30 ekor ikan mas. Ikan mas tersebut selanjutnya digunakan dalam uji tantang dengan A. hydrophila untuk mengevaluasi gambaran darah serta tingkat kelangsungan hidup.

Uji Tantang

(16)

4

Parameter Uji

Parameter uji yang diamati dalam penelitian ini meliputi total sel darah merah, hemoglobin, hematokrit, total sel darah putih, diferensial leukosit, dan tingkat kelangsungan hidup pascainfeksi A. hydrophila.

Pengambilan Sampel Darah

Untuk pengamatan gambaran darah, sampling dilakukan pada hari ke-0, 3, 7, dan 14 pascainfeksi. Setiap kali sampling, 3 ekor ikan diambil dari setiap perlakuan. Ikan yang telah diambil darahnya dipisahkan pada akuarium yang berbeda untuk mencegah kemungkinan terambil kembali saat pengamatan pada hari berikutnya. Sebelum pengambilan darah, ikan terlebih dahulu dibius menggunakan stabilizer, dengan cara mencampurkan 1 mL stabilizer ke dalam 1 liter air, kemudian ikan mas dimasukkan ke dalam wadah tersebut untuk dibius dan selanjutnya dilakukan pengambilan sampel darah. Pada saat pengambilan darah, ikan diletakkan dengan kepala di sebelah kiri. Jarum suntik (syringe) yang sebelumnya sudah dibilas dengan natrium sitrat 3% (sebagai antikoagulan) diarahkan ke bagian vena kaudalis (bagian ekor). Darah dihisap sampai batas yang diinginkan. Alat suntik dicabut, kemudian darah ditempatkan ke dalam eppendorf yang telah dibilas dengan natrium sitrat. Darah yang terambil diberi antikoagulan dengan perbandingan 1:4 dengan jumlah darah yang diambil. Selanjutnya dilakukan pengamatan terhadap parameter gambaran darah yang diperlukan.

Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah

Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 0,5. Lalu tambahkan larutan Hayem’s (berfungsi untuk mematikan sel-sel darah putih) sampai skala 101, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada hemositometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah merah dihitung dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah total sel darah dihitung pada 5 kotak kecil hemositometer, dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu 1989):

SDM Fp

Keterangan:

SDM = Jumlah sel darah merah.

A = Jumlah sel darah merah terhitung.

(17)

5

Penghitungan Kadar Hemoglobin

Kadar hemoglobin (Hb) diukur menurut metode Sahli (Wedemeyer dan Yasutake 1977) yaitu dengan mengisi tabung Sahlinometer dengan larutan HCl 0,1 N sampai garis skala paling bawah (skala 10), kemudian ditempatkan diantara 2 tabung dengan warna standar. Darah ikan dari tabung Eppendorf diambil dengan pipet Sahli sebanyak 0,02 mL dan dimasukkan ke tabung Sahli dan didiamkan selama 3 menit, sebelumnya ujung pipet dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit dan diaduk sampai berubah warna tepat sama dengan warna standar yang ada dalam Hb meter tersebut. Skala dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung Sahli yang dilihat pada skala jalur g% (kuning) yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 mL darah.

Penghitungan Kadar Hematokrit

Kadar hematokrit (Ht) diukur menurut Svobodova (1991) yaitu dengan memasukkan sampel darah ke dalam tabung mikrohematokrit sampai 2/3 bagian tabung, ujung tabung disumbat dengan cretoceal dan disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Kadar hematokrit dinyatakan sebagai % volume padatan sel darah. Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai mencapai ¾ bagian tabung. Kemudian ujung tabung ditutup dengan cretoceal sedalam 1 mm. Lalu tabung mikrohematokrit disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang bervolume sama berhadapan agar putaran sentrifugasi seimbang. Nilai kadar hematokrit ditentukan dengan persentase panjang bagian darah yang mengendap (a) serta panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung (b): (a/b) x 100%. Kadar hematokrit ini mencerminkan banyaknya sel darah (digambarkan dengan endapan/padatan) dalam cairan darah.

Penghitungan Jumlah Total Sel Darah Putih

Penghitungan total sel darah putih dilakukan dengan cara mengencerkan

darah terlebih dahulu dengan menggunakan larutan Turk’s. Penambahan larutan

Turk’s yang bersifat asam akan menyebabkan sel darah merah mengalami lisis

sehingga yang tertinggal hanya sel darah putih saja. Pencampuran dilakukan di dalam pipet pencampur berskala maksimum 11. Pipet ini berisi bulir berwarna putih yang berfungsi sebagai pengaduk. Untuk menghitung sel darah putih, darah dihisap dengan pipet pencampur sampai skala 0,5 dan selanjutnya ditambahkan dengan larutan Turk’s. Pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata.

(18)

6

Keterangan:

SDP = Jumlah sel darah putih.

A = Jumlah sel darah putih terhitung.

N = Jumlah kotak hemositometer yang diamati. V = Volume kotak hemositometer yang diamati. Fp = Faktor pengenceran

Diferensial Leukosit

Darah diteteskan pada gelas objek bagian kanan atas. Selanjutnya gelas objek yang lain diletakkan di atas tetesan darah sampai membentuk sudut sekitar 30o, lalu ditarik sampai darah menyebar sepanjang tepi gelas objek pertama. Setelah itu ulasan darah dikeringudarakan, lalu direndam dalam larutan Giemsa (1:20) selama 15-20 menit. Kemudian dibilas dengan akuades. Selanjutnya diamati menggunakan mikroskop (Blaxhall & Daisley 1973).

Pengamatan Kelangsungan Hidup

Kematian ikan dicatat setiap hari setelah diinfeksi. Tingkat kelangsungan hidup (KH) dihitung untuk masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan berdasarkan persamaan Zonnoveld et al. (1991):

Respons Makan

Pengamatan respons makan ikan mas dilakukan secara deskriptif selama 14 hari pascainfeksi A. hydrophila dengan melihat selang waktu ikan memakan pakan yang diberikan, dan jumlah pakan yang dimakan.

Gejala Klinis

Pengamatan terhadap gejala klinis dilakukan secara deskriptif selama 14 hari pascainfeksi A. hydrophila, meliputi hiperemia, radang, hemoragi, nekrosis, dan tukak. Ikan yang menunjukkan gejala klinis infeksi A.hydrophila dipisahkan untuk mempermudah pengamatan proses recovery.

Analisis Data

(19)

7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Gambaran Darah

Pengamatan terhadap total sel darah merah menunjukkan bahwa antara ikan yang membawa marka molekuler dan ikan mas tanpa marka secara statistik tidak berbeda nyata (Lampiran 1; p>0,05). Sel darah merah total ikan mas yang membawa marka molekuler pada hari ke-0 berada pada nilai 1,56±0,20 (x 106 sel/mm3), sedangkan ikan mas tanpa marka sebesar 1,16±0,47 (x 106 sel/mm3) (Gambar 1). Pada hari ke-3 sel darah merah total menurun, baik pada ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan tanpa marka. Sel darah merah total ikan mas yang membawa marka molekuler 1,38±0,21 (x 106 sel/mm3), dan ikan mas tanpa marka sebesar 0,85±0,30 (x 106 sel/mm3). Hari ke-7, jumlah sel darah merah total menurun, pada ikan yang membawa marka molekuler 1,14±0,26 (x 106 sel/mm3), dan pada ikan mas tanpa marka 0,76±0,22 (x 106 sel/mm3). Pada pengamatan hari ke-14 menunjukkan peningkatan sel darah merah total, baik pada ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan mas tanpa marka. Sel darah merah total ikan mas yang membawa marka molekuler sebesar 1,17±0,06 (x 106 sel/mm3), sedangkan pada ikan mas tanpa marka sebesar 0,90±0,19 (x 106 sel/mm3).

Waktu (hari ke-)

(20)

8

membawa marka molekuler dan ikan mas tanpa marka (Lampiran 2). Hari ke-7 kembali terjadi penurunan nilai hemoglobin, 6,00±1,44 g% (ikan mas yang membawa marka molekuler), 3,93±1,03 g% (ikan mas tanpa marka). Pengamatan hari ke-14 menunjukkan terjadinya peningkatan kadar hemoglobin pada ikan mas yang membawa marka molekuler dengan nilai sebesar 7,13±1,10 g%. Demikian halnya pada ikan mas tanpa marka, terjadi peningkatan kadar hemoglobin 4,93±0,64 g% (Gambar 2).

Secara umum, hasil uji statistik pada nilai hematokrit tidak berbeda nyata antara ikan mas yang membawa marka molekuler dengan ikan tanpa marka (Lampiran 3). Nilai hematokrit hari ke-0 pada ikan mas yang membawa marka molekuler 30,04±2,86%, sedangkan pada ikan mas tanpa marka sebesar 38,40±6,41% (Gambar 3). Pada hari ke-3 terjadi penurunan nilai hematokrit, baik pada ikan mas yang membawa marka molekuler maupun pada ikan mas tanpa marka. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler sebesar 27,55±4,57%, sedangkan ikan mas tanpa marka sebesar 24,11±5,48%. Pengamatan hari ke-7 masih menunjukkan penurunan nilai hematokrit pada ikan mas yang membawa marka molekuler, dengan nilai sebesar 19,69±8,03%. Penurunan nilai hematokrit juga terjadi pada ikan mas tanpa marka, 16,36±4,28%. Hari ke-14, terjadi peningkatan kadar hematokrit pada ikan mas yang membawa marka molekuler dengan nilai 23,52±5,02%. Akan tetapi, pada ikan mas tanpa marka kadar hematokrit masih mengalami penurunan, dengan nilai 14,32±3,99%.

Waktu (hari ke-)

Gambar 2. Kadar hemoglobin ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.

(21)

9 DAB1*05 (M) dan tanpa marka diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.

Waktu (hari ke-)

Gambar 4. Total sel darah putih ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*06 (M) dan tanpa marka diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.

Pengamatan terhadap diferensial leukosit dalam hal ini limfosit, monosit dan netrofil hanya menunjukkan hasil yang berbeda nyata pada limfosit dan monosit di hari ke-3 pascainfeksi, sedangkan pada neutrofil tidak berbeda nyata selama masa infeksi (Lampiran 5). Hari ke-0 persentase limfosit, monosit dan neutrofil pada ikan yang membawa marka molekuler secara berurutan 97,67±1,15%, 1,33±1,53%, 1±1%. Sedangkan pada ikan mas tanpa marka 95,67%±0,58, 1,67±0,58%, 2,67±1,15% (Gambar 5, 6, 7).

(22)

10

Waktu (hari ke-)

Gambar 5. Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.

Waktu (hari ke-)

Gambar 6. Persentase monosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.

Hari ke-3 pascainfeksi, terjadi peningkatan persentase monosit dan neutrofil baik pada ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan mas tanpa marka. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler persentase monosit dan neutrofil sebesar 6,33±0,58%, 12±3%, dan pada ikan mas tanpa marka 10,67±1,15%, 17,67±2,52%. Sebaliknya, persentase limfosit menurun di hari ke-3 pascainfeksi. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler 81,67±3,06%, dan pada ikan mas tanpa marka 71,67±2,52%. Hari ke-7 pascainfeksi, persentase monosit dan neutrofil kembali meningkat. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler persentase monosit dan neutrofil sebesar 23,33±0,58%, 27,67±1,15%, dan pada ikan mas tanpa marka 21,33±3,06%, 22,33±4,16%. Persentase limfosit kembali menurun. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler persentase limfosit sebesar 49±1%, dan pada ikan mas tanpa marka 56,33±6,11%. Hari ke-14

(23)

11 pascainfeksi, terjadi penurunan persentase monosit dan neutrofil. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler secara berurutan 19,00±1%, 20±1,73%. Pada ikan mas tanpa marka 19±2% dan 19,33±1,53%. Sebaliknya, persentase limfosit meningkat baik pada ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan mas tanpa marka. Pada ikan mas yang membawa marka molekuler persentase limfosit sebesar 61±2%, dan pada ikan mas tanpa marka 61,67±1,53%.

Waktu (hari ke-)

Gambar 7. Persentase neutrofil pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka diperoleh dari pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.

Kelangsungan Hidup

Kurva kelangsungan hidup ikan mas selama percobaan ditunjukkan pada Gambar 8. Persentase kelangsungan hidup ikan mas pada akhir percobaan (hari ke-14) yang membawa marka molekuler mencapai 37,78±5,09%, sedangkan pada ikan mas tanpa marka sebesar 14,45±3,85%. Hasil uji statistik menunjukkan tingkat kelangsungan hidup ikan mas yang membawa marka molekuler berbeda nyata terhadap ikan mas tanpa marka (P<0,05).

(24)

12

Respons Makan

Pengamatan terhadap respons ikan terhadap pakan ditabulasi seperti pada Tabel 1. Pada hari ke 0 setelah penyuntikan terlihat ikan mas pada tiap perlakuan tidak mau makan (tidak ada respons terhadap pakan). Respons makan mulai terlihat pada hari pertama, dan pada hari ke-5 ikan mas membawa marka molekuler memiliki respons lebih baik daripada ikan kontrol. Respons makan ikan mempuanyai marka menjadi sangat baik pada hari 10, sedangkan ikan kontrol pada hari 12. Dengan demikian, pemulihan respons makan lebih cepat pada ikan mempunyai marka molekuler.

Tabel 1. Respons makan ikan mas pascainfeksi Aeromonas hydrophila

Hari Ke- Respons Makan

M N Respons makan sedikit = + Respons makan baik = ++

Respons makan sangat baik= +++

Pembahasan

(25)

13 hematologis termasuk pengukuran hematokrit, sel darah putih, sel-sel darah merah dan hemoglobin telah terbukti berharga bagi ahli biologi perikanan dalam pemantauan respons stres dan menilai status kesehatan ikan (Aruldoss et al. 2014).

Pemantauan kesehatan ikan menggunakan analisis hematologi sangat penting sebagai indikator langsung karena dapat memberikan informasi status kesehatan ikan yang berkaitan dengan toleransi terhadap agen stressor atau penyakit ikan seperti virus dan bakteri (Del Rio-Zaragoza et al. 2011; Daneshvar et al. 2012). Parameter hematologi seperti hematokrit, hemoglobin, jumlah eritrosit dan sel-sel darah putih merupakan indikator penting dalam studi mengenai status kesehatan/imunologi ikan.

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap seluruh aspek gambaran darah pada hari ke-0, tidak ada perbedaan spesifik antara ikan mas yang membawa marka molekuler dengan ikan mas tanpa marka, kecuali pada hemoglobin dan total sel darah putih yang secara statistik berbeda nyata. Pada ikan sehat jumlah sel darah putih biasanya rendah dibandingkan sel darah merah, demikian pula sebaliknya. Tingginya jumlah sel darah merah diikuti oleh tingginya persentase hematokrit dan hemoglobin.

Hasil pemeriksaan gambaran darah hari ke-3 menunjukkan adanya penurunan jumlah sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit baik pada ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan mas tanpa marka. Penurunan jumlah sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit tersebut terjadi akibat terjadinya infeksi oleh A. hydrophila. Menurut Bailone et al. (2010), penurunan jumlah sel darah merah dan kadar hemoglobin dapat disebabkan oleh infeksi agen bakteri. Selain itu, kemampuan bakteri A. hydrophila dalam menghasilkan eksotoksin yang dapat melisis sel darah merah menjadi salah satu faktor penyebab menurunnya sel darah total. Angka (2005), menyatakan bahwa bakteri A. hydrophila menghasilkan eksotoksin berupa hemolisin yaitu enzim yang mampu melisiskan sel-sel darah merah dan membebaskan hemoglobinnya. Sebaliknya, jumlah sel darah putih mengalami peningkatan dihari ke-3 pascainfeksi. Meningkatnya jumlah sel darah putih sebagai respons pertahanan tubuh ikan untuk melawan infeksi yang disebabkan oleh A. hydrophila. Sel darah putih merupakan salah satu komponen darah yang aktif di dalam sistem pertahanan tubuh dan berfungsi sebagai pertahanan non-spesifik yang dapat menghancurkan patogen melalui proses fagositosis. Menurut Priyatna et al. (2011), peningkatan jumlah sel darah putih (leukosit) dapat dijadikan petunjuk adanya fase pertama infeksi maupun stres. Peningkatan jumlah sel darah putih disebabkan oleh peningkatan aktivitas pembelahan sel, karena sel darah putih berperan dalam mengeliminasi patogen yang masuk ke dalam tubuh melalui proses fagositosis. Sel darah putih memainkan peranan penting pada ikan dan terlibat dalam sistem pertahanan tubuh organisme dibawah beberapa kondisi, seperti stres, peradangan, dan parasitisme (Silveira-Coffigni et al. 2004; Azevedo et al. 2006 Martins et al. 2006; Daneshvar et al. 2012).

(26)

14

pada stadia awal infeksi antara hari ke-4 sampai hari ke-8. Peningkatan jumlah monosit dan netrofil tersebut diduga sebagai respons sistem imun non-spesifik dalam melawan serta mengeliminasi patogen. Monosit dan netrofil berperan sebagai sel fagosit (APC) yang dapat menghancurkan patogen. Menurut Ardó (2010), sel fagosit merupakan komponen seluler yang paling penting dari sistem kekebalan tubuh bawaan ikan. Aktivitas fagositosis merupakan mekanisme pertahanan primordial dan karakteristik penting dari sistem kekebalan tubuh non-spesifik. Antigen yang telah diproses oleh sel-sel fagosit kemudian dipresentasikan oleh molekul MHC II kepada sel T, untuk diproses (dikenali) hingga terbentuk antibodi (imunitas spesifik).

Pada hari ke-14, jumlah sel darah putih menurun bersamaan dengan menurunnya persentase monosit dan neutrofil. Penurunan tersebut diduga disebabkan mulai menurunnya aktivitas imun non-spesifik pasca hari ke-7, dan perannya digantikan oleh imunitas spesifik (antibodi). Antibodi terbentuk pascapresentase antigen asing melalui molekul yang terdapat pada sel-sel antigen presenting cells (APC) yaitu makrofag, selanjutnya akan memberi sinyal kepada limfosit B untuk berproliferasi dan menghasilkan antibodi. Menurut Kollner et al. (2002), antibodi diproduksi oleh limfosit B setelah distimulasi oleh peptida antigen yang dipresentasikan melalui molekul MHC II yang terdapat pada sel-sel APC. Antibodi yang terbentuk akan merangsang sel-sel fagosit untuk menghancurkan patogen asing yang menginfeksi. Molekul MHC kelas II menyajikan peptida patogen dan menstimulus limfosit B untuk memproduksi antibodi, yang mengaktivasi sel fagositik, dan aktivasi sifat imunologi yang terlibat dalam eliminasi parasit dan bakteri serta netralisasi virus (Wegner 2008; Moulana et al.2008; Rakus et al. 2009). Eliminasi patogen yang dilakukan oleh sistem imun selanjutnya berpengaruh terhadap peningkatan laju penutupan luka (recovery). Proses pemulihan mulai terlihat antara hari 7-8, yang ditandai dengan berkurangnya gejala klinis pascainfeksi serta terbentuknya jaringan baru pada bagian luka, mulai terjadi peningkatan jumlah eritrosit, hemoglobin dan hematokrit pada ikan mas yang membawa marka molekuler. Akan tetapi, pada ikan mas tanpa marka hanya jumlah eritrosit dan hemoglobin saja yang meningkat. Hematokrit pada ikan mas tanpa marka masih lebih rendah dibandingkan hari ke-7. Hal ini diduga akibat ukuran ikan yang diamati pada hari ke-14 lebih kecil dibandingkan pada hari ke-7. Peningkatan jumlah eritrosit, hemoglobin dan hematokrit tersebut mengindikasikan bahwa sistem pertahanan spesifik mulai bekerja.

(27)

15 Pada hari ke-2, pergerakan renang kurang aktif, nafsu makan yang rendah, nekrosis pada bagian yang mengalami peradangan, ikan yang sakit lebih banyak berenang di dasar akuarium, serta kematian beberapa ekor ikan. Enzim eksotoksin dari A. hydrophila seperti protease dan elastase diduga menyebabkan kerusakan pada permukaan tubuh ikan mas yang terinfeksi, karena pada jaringan otot dan saluran pembuluh darah terdapat banyak kandungan protein. Ketika terjadi kerusakan pada pembuluh darah akibat eksotoksin, maka darah akan keluar dari pembuluh darah dan menyebabkan hemoragi pada permukaan tubuh. Efek dari eksotoksin yang berkelanjutan akan meningkatkan kematian sel pada jaringan otot sehingga menyebabkan nekrosis pada permukaan tubuh (Gambar 9).

Pengamatan gejala klinis dan nafsu makan menunjukkan di hari ke-3, nafsu makan ikan masih rendah, terdapat luka terbuka (tukak/ulcer) pada daerah sekitar lokasi penyuntikan yang diikuti dengan hemoragi. Hari ke-5, kematian beberapa ekor ikan khususnya ikan mas yang membawa marka molekuler, sedangkan pada ikan mas tanpa marka tidak ditemukan ikan yang mati. Pada hari ke-5 ikan mulai menunjukkan peningkatan nafsu makan, dan pada ikan mas yang membawa marka molekuler mulai menunjukkan proses penutupan luka yang ditandai dengan hilangnya bagian nekrosis serta berkurangnya hemoragi di sekitar luka. Pada ikan mas tanpa marka masih belum menunjukkan tanda-tanda penutupan luka seperti halnya pada ikan mas yang mempunyai marka molekuler. Adanya penutupan luka tersebut disebabkan karena mulai bekerjanya sistem imun khususnya imunitas non-spesifik pada ikan. Lorenzen & LaPatra (2005), menyatakan bahwa proteksi dari sistem imun non-spesifik bekerja pada stadia awal infeksi antara hari ke-4 sampai hari ke-8.

(28)

16

Hari ke-7 dan ke-8, luka pada ikan mulai mengalami proses pemulihan, terutama pada ikan mas yang membawa marka molekuler. Hal ini diduga karena ikan-ikan tersebut memiliki kecepatan regenerasi sel yang lebih tinggi dibandingkan ikan mas tanpa marka (Gambar 10).

Gambar 10. Proses penutupan luka pada ikan mas yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 pascainfeksi dengan Aeromonas hydrophila (A = tukak/ulcer + hemoragi; B = tukak tanpa hemoragi; C= terbentuknya jaringan baru; D= luka mulai menutup; E= luka hampir menutup sempurna) (tanda panah menunjukkan proses recovery)

Kecepatan regenerasi sel sangat ditentukan oleh tingkat imunitas ikan terhadap infeksi patogen. Kemampuan sistem imun pada ikan mas yang membawa marka molekuler dalam mempresentasikan peptida asing jauh lebih baik sehingga berdampak pada peningkatan kemampuan tubuh untuk memproduksi antibodi sehingga mampu menetralisir dan membunuh antigen dan mempercepat laju penutupan luka. Menurut Kollner et al. (2002), antigen spesifik antibodi disekresikan oleh limfosit B setelah presentasi peptida antigen asing oleh makrofag melalui molekul MHC kelas II.

(29)

(30)

(31)

19

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Berdasarkan hasil analisis gambaran darah pascainfeksi A. hydrophila, ikan mas F3 yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki respons imun dan tingkat kelangsungan hidup yang lebih baik dibandingkan ikan mas tanpa marka.

Saran

(32)

(33)

21

DAFTAR PUSTAKA

Alimuddin, Mubinun, Santika A, Carman O, I. Faizal I, Sumantadinata K. 2011. Identification of Majalaya common carp strain resistant to KHV infection using Cyca-DAB1*05 allele as the marker. Indonesian Aquaculture Journal. 6(2): 157-163.

Angka SL. 2005. Kajian penyakit motile aeromonad septicaemia pada ikan lele dumbo (Clarias sp.): Patologi dan pencegahannya dengan fitofarmaka [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Ardó L, Jeney Z, Adams A, Jeney G. 2010. Immune responses of resistant and sensitive common carp families following experimental challenge with Aeromonas hydrophila. Fish Shellfish Immunol. 29:111-116. doi:10.1016/j.fsi.2010.02.029

Aruldoss K, Kannan K, Chandira A. 2014. Effect of cynodon dactylon on the heamatological parameters in the blood of Oreochromis mossambicus. Int. J. Modn. Res. Revs. 2(5), 171-177.

Bailone RL, Martins ML, Mouriño JLP, Vieira FN, Pedrotti FS, Nunes GC, Silva BC. 2010. Hematology and agglutination titer after polyvalent immunization and subsequent challenge with Aeromonas hydrophila in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Arch Med Vet 42: 221-227

Daneshvar E, Ardestani MY, Dorafshan S, Martins MC. 2012. Hematological parameters of Iranian cichlid Iranocichla hormuzensis Coad, 1982 (Perciformes) in Mehran river. An Acad Bras Cienc. 84(4): 943-949 Del Rio-Zaragoza OB, Fajer-Ávila EJ, Almazán-Rueda P, Abdo de la Parra MI.

2011. Hematological characteristics of the spotted rose snapper Lutjanus guttatus (Steindachner, 1869) healthy and naturally infected by dactylogyrid monogeneans. Tissue and Cell 43:137–142. doi:10.1016/j.tice.2011.01.002

Gilad O, Yun S, Adkison MA, Way K, Willits NH, Bercovier H, Hedrick RP. 2003. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi. J General Virol. 84: 2661–2668.

Kales SC. 2006. A functional study of major histocompatibility expression and immune function in rainbow trout, (Oncorhynchus mykiss). [Disertasi]. Ontario. University of Waterloo.

Kollner B, Wasserrab B, Kotterba G, Fischer U. 2002. Evaluation of immune functions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)-how can environmental influences be detected? Toxicology Letters. 131: 83-95. Lorenzen N, LaPatra SE. 2005. DNA vaccine for aquaculture fish. Rev Sci Tech

Off Int Epiz. 24 (1): 201-213

(34)

22

Anostomidae) naturally infected by Goezia leporini (Nematoda: Anisakidae) in fish pond. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 56(5): 640-646. Moulana M, Evenhuis J, Albertino M, Godwin U, Kountikov EI, Stuge TB,

Wilson M, Bengten E, Miller NW, McConnell TJ. 2008. Characterization of anti-channel catfish MHC class IIβ monoclonal antibodies. Vet Immunol Immunopathol. 26: 120-130. doi:10.1016/j.vetimm.2008.06.012 Mu X, Pridgeon JW, Klesius PH. 2011. Transcriptional profiles of multiple genes in the anterior kidney of channel catfish vaccinated with an attenuated Aeromonas hydrophila. Fish Shellfish Immunol. 31:1162-1172. doi:10.1016/j.fsi.2011.10.011

Nabib R, Pasaribu FH. 1989. Patologi dan Penyakit Ikan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. 158 hal

Nuryati S, Kuswardani Y, Hadiroseyani Y. 2006. Pengaruh pemberian resin lebah terhadap gambaran darah ikan koki Carassius auratus yang terinfeksi bakteri Aeromonas hydrophila. JAI. 5(2): 191-199

Perera HACC, Pathiratne A. 2008. Enhancement of immune responses in Indian carp, Catla catla, following adistration of levamisole by immersion, pp. 129-142. In Bondad-Reantaso MG, Mohan CV, Crumlish M, Subasinghe RP (eds.). Diseases in Asian Aquaculture VI. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. 505 pp.

Pridgeon JW, Aksoy M, Klesius PH, Li Y, Mua X, Srivastava K, Reddy G. 2011. Identification and expression profiles of multiple genes in Nile tilapia in response to bacterial infections. Vet Immunol Immunopathol. 144:111– 119. doi:10.1016/j.vetimm.2011.07.018.

Pridgeon JW dan Klesius PH. 2011. Virulence of Aeromonas hydrophila to channel catfish Ictaluras punctatus fingerlings in the presence and absence of bacterial extracellular products. Dis Aquat Org. 95:205-215. doi:10.3354/dao02357.

Priyatna R, Indarjulianto S, dan Kurniasih. 2011. Infeksi Aeromonas salmonicida dari berbagai wilayah di Indonesia pada ikan mas (Cyprinus carpio). Biota.16 (2): 287−297. ISSN 0853-8670

Popma T, Masser M. 1999. Tilapia Live History and Biology. Southern Regional aquaculture. United States Department of agriculture. 283 hal.

Rakus KŁ, Wiegertjes GF, Adamk M, Siwicki AK, Lepa A, Irnazarow I. 2009. Resistance of common carp (Cyprinus carpio L.) to Cyprinid herpesvirus-3 is influenced by mjor histocompatibility (MH) class II B gene polymorphism. Fish Shellfish Immunol. 26:737-743. doi:10.1016/j.fsi.2009.03.001.

Rakus KŁ. 2008. Major histocompatibility (MH) polymorphism of common carp. Link with disease resistance. [Disertasi]. Wageningen: Wageningen University.

Satheeshkumar P, Ananthan G, Kumar GS, Jagadeesan L. 2011. Haematology and biochemical parameters of different feeding behaviour of teleost fishes from Vellar estuary, India. Comp Clin Pathol. 21 (6), 1187-1191. doi:10.1007/s00580-011-1259-7

(35)

23 aureus S. Comp. Biochem. Physiol. 139:245–250. doi:10.1016/j.cca.2004.11.009

Uribe C, Folch H, Enriquez R, Moran G. 2011. Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review. Vet Medicina. 56(10): 486–503

Wedemeyer CA, Yasutake WT. 1977. Clinical methods for the assessment of the effects of environmental stress on fish health. United stated technical papers and united states fish wildlife services. 89:1-18

Wegner KM. 2008. Historical and contemporary selection of teleost MHC genes: did we leave the past behind? J Fish Biol. 73:2110-2132 doi:10.1111/j.1095-8649.2008.02051.

Yardimchi B dan Aydin Y. 2011. Pathological findings of experimental Aeromonas hydrophila infection in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Ankara Üniv Vet Fak Derg. 58:47-54.

Yuasa KN, Panigoro MB, Kholidin. 2003. Panduan diagnosa penyakit ikan: Teknik diagnosa penyakit ikan budidaya air tawar di Indonesia. Balai budidaya air tawar Jambi dan Jakarta. International cooperation agency: 75 hlm.

(36)

(37)

25

LAMPIRAN

Lampiran 1. Uji Anova Total Sel Darah Merah (SDM)

(38)

(39)

27 Lampiran 2. Uji Anova Kadar Hemoglobin

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable:Hb0

Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected

Model 6.000

a ₁ _{6.000 450.000} _.000

Intercept 274.727 1 274.727 20604.500 .000

Perlakuan 6.000 1 6.000 450.000 .000

Error .053 4 .013

Total 280.780 6

Corrected Total

6.053 5

a. R Squared = .991 (Adjusted R Squared = .989)

Dependent Variable:Hb3 Source

Type III Sum

of Squares df Mean Square F Sig.

Corrected Model

3.840a 1 3.840 24.000 .008

Intercept 245.760 1 245.760 1536.000 .000

Perlakuan 3.840 1 3.840 24.000 .008

Error .640 4 .160

Total 250.240 6

Corrected Total

4.480 5

(40)

28

Type III Sum

Corrected Model

6.407a 1 6.407 4.089 .113

Intercept 148.007 1 148.007 94.472 .001

Perlakuan 6.407 1 6.407 4.089 .113

Error 6.267 4 1.567

Total 160.680 6

Corrected Total

12.673 5

Type III Sum

Corrected Model

7.260a 1 7.260 8.926 .040

Intercept 218.407 1 218.407 268.533 .000

Perlakuan 7.260 1 7.260 8.926 .040

Error 3.253 4 .813

Total 228.920 6

Corrected

Total 10.513 5

(41)

29 Lampiran 3. Uji Anova Hematokrit

Dependent Variable:Ht0

Model 104.918

a ₁ _{104.918 4.255} _.108

Intercept 7025.366 1 7025.366 284.928 .000 Perlakuan 104.918 1 104.918 4.255 .108

Error 98.626 4 24.657

Total 7228.910 6

Corrected Total

203.544 5

Dependent Variable:Ht3 Source

Type III Sum

Corrected Model

17.750a 1 17.750 .698 .451

Intercept 4002.100 1 4002.100 157.324 .000

Perlakuan 17.750 1 17.750 .698 .451

Error 101.755 4 25.439

Total 4121.605 6

Corrected Total

119.505 5

(42)

30

Type III Sum

Corrected Model

16.633a 1 16.633 .402 .561

Intercept 1949.404 1 1949.404 47.090 .002

Perlakuan 16.633 1 16.633 .402 .561

Error 165.588 4 41.397

Total 2131.625 6

Corrected Total

182.222 5

a. R Squared = .091 (Adjusted R Squared = -.136)

Type III Sum

of Squares Df Mean Square F Sig.

Corrected Model

126.960a 1 126.960 6.175 .068 Intercept 2147.042 1 2147.042 104.422 .001 Perlakuan 126.960 1 126.960 6.175 .068

Error 82.245 4 20.561

Total 2356.247 6

Corrected

Total 209.205 5

(43)

31 Lampiran 4. Uji Anova Total Sel Darah Putih (SDP)

Dependent Variable:SDP0 Source

Type III Sum

Corrected Model

2.344a 1 2.344 9.375 .038

Intercept 157.594 1 157.594 630.375 .000

Perlakuan 2.344 1 2.344 9.375 .038

Error 1.000 4 .250

Total 160.938 6

Corrected Total

3.344 5

Type III Sum

Corrected

Model 10.667

a ₁ _{10.667 5.069} _.087

Intercept 204.167 1 204.167 97.030 .001

Perlakuan 10.667 1 10.667 5.069 .087

Error 8.417 4 2.104

Total 223.250 6

Corrected Total

19.083 5

(44)

32

Type III Sum

Corrected Model

Error 9.792 4 2.448

Total 405.063 6

Corrected Total

48.552 5

Type III Sum

Corrected Model

4.594a 1 4.594 2.346 .200

Intercept 213.010 1 213.010 108.771 .000

Perlakuan 4.594 1 4.594 2.346 .200

Error 7.833 4 1.958

Total 225.438 6

Corrected

Total 12.427 5

(45)

33 Lampiran 5. Uji Anova Diferensial Leukosit

Dependent Variable:Limfosit0

Model 6.000

a ₁ _6.000 _{7.200 .055}

Intercept 56066.667 1 56066.667 67280.000 .000

Perlakuan 6.000 1 6.000 7.200 .055

Error 3.333 4 .833

Total 56076.000 6

Corrected Total

9.333 5

Dependent Variable:Limfosit3 Source

Type III Sum

Corrected Model

Error 43.333 4 10.833

Total 35460.000 6

Corrected Total

193.333 5

(46)

34 Intercept 16642.667 1 16642.667 868.313 .000

Perlakuan 80.667 1 80.667 4.209 .110

Intercept 22570.667 1 22570.667 7127.579 .000

(47)

35

Intercept 2166.000 1 2166.000 866.400 .000

(48)

36

Dependent Variable:Monosit14 Source

Type III Sum

Corrected Model

.000a 1 .000 .000 1.000

Intercept 2166.000 1 2166.000 866.400 .000

Perlakuan .000 1 .000 .000 1.000

Error 10.000 4 2.500

Total 2176.000 6

Corrected Total

10.000 5

a. R Squared = .000 (Adjusted R Squared = -.250)

Dependent Variable:Neutrofil0

Model 4.167

a ₁ _{4.167 3.571} _.132

Intercept 20.167 1 20.167 17.286 .014

Perlakuan 4.167 1 4.167 3.571 .132

Error 4.667 4 1.167

Total 29.000 6

Corrected Total

8.833 5

(49)

37

Dependent Variable:Neutrofil3 Source

Type III Sum

Corrected Model

48.167a 1 48.167 6.283 .066 Intercept 1320.167 1 1320.167 172.196 .000

Perlakuan 48.167 1 48.167 6.283 .066

Error 30.667 4 7.667

Total 1399.00

0 6

Corrected

Total 78.833 5

Dependent Variable:Neutrofil7

Source Type III Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Corrected

Model 42.667

a ₁ _{42.667 4.571} _.099

Intercept 3750.000 1 3750.000 401.786 .000

Perlakuan 42.667 1 42.667 4.571 .099

Error 37.333 4 9.333

Total 3830.000 6

Corrected Total

80.000 5

(50)

38

Dependent Variable:Neutrofil14 Source

Type III Sum

Corrected Model

.667a 1 .667 .250 .643

Intercept 2320.667 1 2320.667 870.250 .000

Perlakuan .667 1 .667 .250 .643

Error 10.667 4 2.667

Total 2332.000 6

Corrected Total

11.333 5

a. R Squared = .059 (Adjusted R Squared = -.176) Lampiran 6. Uji Anova Tingkat Kelangsungan Hidup (SR)

Dependent Variable:SR Source

Type III Sum

Corrected

Model 816.433

a ₁ _816.433 _{40.072 .003}

Intercept 4090.915 1 4090.915 200.790 .000 Perlakuan 816.433 1 816.433 40.072 .003

Error 81.496 4 20.374

Total 4988.845 6

Corrected Total

897.930 5

(51)

39

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Lasunapa Kabupaten Muna, Sulawesi Tenggara, pada tanggal 09 Desember 1984 sebagai anak ke dua dari empat bersaudara pasangan La Ode Fahuma, SH., MH. (alm.) dan Samria A.