Produksi IgY Antitetanus pada Telur Ayam
Produksi IgY antitetanus dilakukan dengan menyuntikkan toksoid tetanus dosis bertingkat selama 4 minggu. Toksoid tetanus diperoleh dari PT Biofarma (Persero) Bandung dengan konsentrasi 2000 Lf /ml. Antigen toksoid diemulsikan dengan Freund’s adjuvant. Antibodi spesifik terhadap toksoid tetanus pada serum ayam dideteksi dengan menggunakan uji agar gel presipitasi (AGP) (Gambar 8). Antibodi mulai terdeteksi minggu kelima dan tidak terdeteksi lagi minggu kesembilan dari imunisasi awal (Tabel 3). Setelah dilakukan pengulangan imunisasi, seminggu kemudian IgY antitetanus terdeteksi lagi. Sedangkan telur mulai dikoleksi seminggu setelah IgY antitetanus positif di serum.
Tabel 3 Hasil uji AGP IgY antitetanus pada serum dan telur ayam
serum telur Mgg 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1* - - - *** *** *** *** *** 2* - - - *** *** *** *** *** 3* - - - *** *** *** *** *** 4* - - - *** *** *** *** *** 5 + + + + + *** *** *** *** *** 6 + + + + + + + + + + 7 + + + + + + + + + + 8 - + - + + + + + + + 9** - - - + + - + - + + 10 + + + + + - + - - - 11 + + + + + + + + + + Keterangan * Waktu imunisasi * * Imunisasi ulang
*** belum dilakukan koleksi telur
+ terjadi garis presipitasi pada agar AGPT - tidak terjadi garis presipitasi pada agar AGPT
Titer IgY antitetanus mencapai puncak dalam serum pada minggu keenam, sedangkan dalam telur pada minggu ketujuh dari awal imunisasi (minggu ketiga sejak mulai terdeteksi di serum). Rataan total titer IgY spesifik antitetanus pada serum adalah 13.84 ± 2.89 IU/ml sedangkan pada telur adalah 28.23 ± 7.62 IU/ml. Rataan titer tertinggi dari kelima ayam pada serum 34.53 ± 14.94 IU/ml dan terendah 2.68 ± 1.32 IU/ml. Pada telur rataan titer tertinggi dari kelima ayam adalah 80. 16 ± 33.55 IU/ml dan terendah 1.69 ± 0.63 IU/ml (Gambar 7).
48
Titer IgY antitetanus
0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Minggu Titer (IU/ml) serum telur
Gambar 7 Rataan titer IgY antitetanus pada serum dan telur.
Titer IgY antitetanus dalam serum mengalami penurunan pada minggu kedelapan. Hasil uji AGP (Tabel 3) menunjukkan nilai negatif pada beberapa sampel, tetapi pada pemeriksaan ELISA konsentrasinya masih tinggi yaitu berkisar antara 0.18 IU/ml sampai 2.68 IU/ml. Kristiansen et al. (1997) melaporkan efek toksik dari kuman tetanus tidak terjadi pada penderita yang memiliki konsentrasi antitetanus dalam serum di atas 0.01 IU/ml.
Gambar 8 Hasil uji imunodifusi IgY antitetanus Ayam. (1) toksoid tetanus, (2) IgY antitetanus ayam. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi antara toksoid tetanus (1) dengan sampel (2).
Imunogenitas suatu bahan berhubungan langsung dengan berat molekul. Bahan dengan berat molekul lebih besar dari 5 kDa adalah imunogen yang baik, bahan dengan berat molekul 4.5 kDa imunogen yang jelek dan dengan berat molekul kurang dari 1 kDa tidak imunogenik. Jumlah antigen yang umum dipakai untuk imunisasi adalah 50 sampai 100 ug (Liddell dan Weeks 1995) . Pada penelitian ini toksoid yang digunakan mempunyai berat molekul 150 kDa dengan jumlah 300 Lf per ekor. Sehingga dari syarat berat molekul sudah memenuhi sebagai imunogen yang baik.
1 2 2 2 2 2 2
49 Gambar 7 memperlihatkan titer IgY antitetanus pada serum mengalami penurunan mulai minggu ketujuh walaupun dengan uji AGP masih positif. Penurunan secara nyata terjadi pada minggu ke sembilan. Begitu juga halnya dengan titer IgY antitetanus pada telur, penurunan pada minggu kesembilan sangat nyata dibandingkan minggu sebelumnya dan terjadi peningkatan pada minggu kesepuluh setelah imunisasi ulang.
Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap terbentuknya antibodi adalah umur hewan, ukuran molekul antigen, kerumitan struktur kimiawi antigen, genetik, rute imunisasi, dan dosis antigen, serta waktu dan jumlah pengulangan imunisasi (Liddell dan Weeks 1995; Behn et al. 1996). Struktur antigen bakteri utuh lebih kompleks dan rumit sehingga dengan dosis yang sedikit mampu merangsang antibodi dibandingkan dengan komponen metabolit bakteri atau komponen sel bakteri. Kapsul bakteri S equi subsp. Zooepidemicus yang tersusun atas asam hyaluronat kurang imunogenik karena komponen biokimiawi penyusun asam hyaluronat terdiri atas ulangan polisakarida yang sama dengan struktur oligosakarida kompleks hanya pada bagian tertentu saja (Wibawan et al.1999). Begitu juga halnya dengan toksoid yang merupakan metabolit bakteri strukturnya sederhana sehingga mudah dipecah oleh enzim dalam tubuh. Rawendra (2005) melaporkan imunisasi pada ayam menggunakan antigen whole cel l EPEC K1.1
secara intravena tanpa penambahan adjuvan, antibodi dalam serum sudah dideteksi pada hari ketujuh, dan tetap bertahan sampai minggu kedelapan. Sedangkan Paryati (2006) melaporkan penggunaan antigen idiotipe virus rabies, antibodi pada serum ayam baru muncul pada minggu ketujuh, dan antibodi masih terdeteksi selama 10 min ggu. Penggunaan venom sebagai antigen yang dicampur adjuvan komplit, dilaporkan antibodi terdeteksi dua minggu setelah vaksinasi. Titer antibodi meningkat setelah imunisasi boster dan tetap tinggi sampai 24 minggu (Almeida et al. 1998).
Aplikasi imunisasi secara intravena memerlukan dosis antigen dua kali lebih tinggi diba ndingkan dengan imunisasi intramuskular dan konsentrasi antibodi di serum cepat turun. Ayam diimunisasi dengan antigen whole blood
tanpa menggunakan adjuvan didapatkan titer yang tinggi empat minggu setelah vaksinasi pertama dan tetap stabil selama 7 minggu (Gutierrez et al. 2001).
50 Carlender (2002) melaporkan penggunaan adjuvan menyebabkan titer antibodi pada serum tetap tinggi sampai 6 bulan. Ayam yang di imunisasi dengan rotavirus terus bertelur tanpa ada perubahan periode bertelur. Produksi anti HRV pada ayam menunjukkan 15 sampai 20 kali lebih efektif dibandingkan diproduksi pada kelinci dengan titer netralisasi dalam kuning telur tetap tinggi dalam jangka waktu lebih dari setahun (Hatta et al. 1993). Sedangkan Chang et al. (1999) melaporkan imunisasi secara intra muskular dengan adjuvan mampu meningkatkan antibodi 10 kali lebih tinggi dibandingkan imunisasi secara subcutan.
Penurunan kadar antibodi dalam serum merupakan cermin dari hilangnya populasi sel plasma penghasil antibodi spesifik. Setiap berdiferensiasi penuh, sel plasma mati setelah tiga sampai enam hari, dan antibodi yang dihasilkan menurun karena proses katabolisme (Tizard 1988). Efektivitas produksi antibodi pada serum tergantung atas pelepasan antigen yang konstan untuk merangsang sistem imun. Substansia yang digunakan untuk itu adalah adjuvan (Behn et al. 1996).
Injeksi antigen tiga kali berturut-turut setiap 4 minggu tanpa pemberian adjuvan menimbulkan titer antibodi rendah, titer antibodi yang tinggi dicapai pada imunisasi menggunakan adjuvan (Behn et al. 1996). Penggunaan Freund’s
adjuvant komplit dan tidak komplit yang dicampur antigen merangsang
terbentuknya titer antibodi tinggi pada serum dan telur ayam. Komponen penyusun Freund’s adjuvant komplit adalah minyak mineral, deterjen, dan mikobakterium mati. Minyak mineral bersifat hidrofobik cenderung tertahan pada tempat injeksi dan lambat diabsor psi, droplet dari minyak ini akan disingkirka n secara perlahan oleh makr ofag sistem retikuloendotelial sehingga antigen yang terkandung dapat secara maksimal memapar sistem imun. Deterjen berfungsi mempertahankan emulsi minyak mineral dengan antigen. Emulsi air dalam minyak lebih baik dibandingkan minyak dalam air, sehingga komposisi perbandingan adjuvan dengan antigen dianjurkan 2 : 1 atau lebih. Mikobakterium yang telah mati menyebabkan rangsangan nonspesifik terhadap sistem
retikuloendotelial dan sistem imun dengan cara proliferasi makrofag dan limfosit secara lokal dan sistemik. Bahan aktif lain yang sering digunakan pada adjuvan adalah bordetella pertusis, corynebakterium parvum, dan levamisol. Vaksin rekombinan hepatitis B dicampur dengan adjuvan aluminium hydroxide
51 (AL2(HO)3) juga mampu merangsang terbentuknya antibodi pa da serum dan telur
ayam. Freund’s adjuvant sangat kuat dalam merangsang respon imum dan digunakan hanya pada hewan coba, sedangkan adjuvan aluminum hydroxide
adalah adjuvan yang aman digunakan pada manusia dan hewan (Makvandi dan Fiuzi 2002).
Untuk tetap mempertahankan titer IgY antitetanus yang tinggi (hiperimun) pada serum dan telur perlu dilakukan imunisasi secara berkala. Waktu imunisasi berbeda pada masing-masing hewan. Pada mencit dilakukan setiap dua minggu, pada hewan besar bisa sampai tiap dua bulan sedangkan boster dilakukan dua minggu menjelang panen. Pada kuda imunisasi dilakukan setiap satu bulan dilanjutkan boster tiap 4 hari untuk mendapatkan titer antitetanus yang tinggi (PT Biofarma 2003). Pada mencit boster dilakukan beberapa hari menjelang panen. Pada ayam belum ada laporan secara pasti tentang waktu boster yang baik untuk mendapatkan titer yang tinggi. Sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.
Pada`pengujian selanjutnya, sampel dengan titer tinggi dikumpulkan, sedangkan sampel dengan titer rendah disingkirkan. Dari hasil pemeriksaan titer tertinggi pada serum sebesar 83.82 IU/ ml sedangkan pada telur 165.65 IU/ml (Tabel 4).
Tabel 4 Hasil pengukuran titer IgY antitetanus (IU/ml) No Pengukuran Serum (IU/ml) Telur (IU/ml)
1 83. 82 153.54 2 36.53 165.65 3 19.73 38.63 4 12.93 42.04 5 21.01 57.51 6 45.12 61.08 7 38.32 37.13 8 11.08 96.26 9 9.18 93.07 10 19.44 48.64 rataan 29.72 79.36
Titer pada telur lebih tinggi karena telur bertindak sebagai penampung dan persiapan calon anak ketika akan lahir. IgY pada telur tidak mengalami degradasi oleh enzim yang ada di kuning telur, karena ada granul-granul komponen
52 lipoproteinsakarida pada kuning telur yang melindungi IgY (Scmidt et al. 1989). Pada serum, imunoglobulin mengalami degradasi sesuai dengan waktu paruhnya. Waktu paruh dari IgY adalah 36 jam (Carlendar 2002).
Ekstraksi, Purifikasi dan Karakterisasi IgY Antitetanus dari Kuning Telur Ekstraksi IgY antitetanus dari kuning telur bertujuan untuk memisahkan protein dari lemak telur. Secara umum metode ekstraksi IgY terdiri atas empat tahap : (1) pelarutan kuning telur dengan buffer, (2) pengendapan lemak, (3) pengendapan protein, (4) pelarutan endapan protein (Szabo et al. 1998). Ada bermacam-macam metode ekstraksi seperti presipitasi garam, presipitasi isoelektik, dan presipitasi dengan larutan organik. Selain metode itu protein dapat juga diendapkan dengan polimer organik. Polimer organik yang sering digunakan adalah polyethylene glycol (PEG) dengan berat molekul 6000 sampai 20 000. Pada penelitian ini ekstraksi IgY antitetanus dari kuning telur dengan teknik PEG- kloroform.
Langkah pertama ekstraksi IgY antitetanus dari kuning telur mengendapkan lemak telur dengan kloroform sehingga diperoleh supernata n yang mengandung IgY antitetanus berwarna jernih (Gambar 9). Kloroform merupakan senyawa nonpolar, apabila ditambahkan pada lipid dalam bentuk fase cair akan membentuk larutan lipid yang semisolid dan mengendap jika disentrifus (Wilson dan Walker 2000).
Gambar 9 A. Penambahan kloroform pada larutan kuning telur. B. Pemisahan supernatan yang mengandung IgY antitetanus dari lemak telur yang telah mengendap.
Pengendapan protein dari supe rnatan dilakukan dengan penambahan PEG 6000 sampai mencapai konsentrasi 12% (w/v) diperoleh endapan (pelet) protein
53 yang berwarna putih di dasar tabung setelah disentrifugasi. Pelet dilarutkan kembali dengan PBS dan dikoleksi (Gambar 10).
Gambar 10 Penambahan PEG 6000 pada supernatan. B. Pemisahan pelet dari supernatan setelah disentrifuse
Penambahan PEG 6000, bertujuan meningkatkan konsentrasi bahan yang mampu bersaing dengan protein untuk mengikat air, sehingga afinitas antara molekul protein meningkat, yang berakibat daya larut protein berkurang dan mengendap dengan sentrifugasi. Sedangkan komponen lain (bebas) akan tetap larut dalam air. Proses ini dipengaruhi perubahan muatan elektrostatik larutan yang sangat dipengaruhi oleh titik isoeletrik bahan dan pH (Chard 1990). Konsentrasi protein (IgY) dari ekstraksi diperoleh sebesar 0.65 ± 0.04 mg/ml (Tabel 5). Protein yang telah diisolasi dilihat pola pita proteinnya dengan SDS- PAGE (Gambar 11).
Berbagai teknik telah dilaporkan untuk memisahkan IgY dari komponen lemak telur. Metode PEG–Kloroform terpilih karena metode ini sangat sederhana, waktu untuk isolasi singkat, dan sangat efisien dengan kehomogenan IgY lebih dari 90%. Disamping itu kloroform juga tidak berefe k terhadap aktivitas antibodi (Polson 1990).
Tahapan dari setiap metode purifikasi dapat memungkinkan IgY ikut terbuang atau tertinggal pada alat atau terikutnya protein lain karena memiliki massa molekul yang sama, sehingga tidak mungkin dapat mengisolas i IgY 100% murni. Hal ini dipengaruhi oleh beberapa hal seperti : jeratan (perangkap) fisik komponen bebas di dalam kompleks komponen terikat, adanya kotoran dalam media pelarut yang memiliki struktur kimia mirip dengan komponen terikat, penyerapan ligan yang kurang terhadap komponen bebas, pemisahan komponen
54 bebas dan terikat tidak sempurna , disosiasi (terpisahnya kembali) kompleks komponen terikat (Liddell dan Weeks 1995).
Tabel 5 Konsentrasi protein hasil ekstraksi dan purifikasi IgY antitetanus No Pengukuran Ekstraksi PEG-Chloroform
(mg/ml) Purifikasi FPLC (mg/ml) 1 0.65 1.02 2 0.71 1.99 3 0.71 1.99 4 0.71 2.22 5 0.61 2.13 6 0.62 1.16 7 0.62 1.48 8 0.64 1.68 9 0.64 1.34 10 0.62 1.42 Rataan 0.65 1.64
Persamaan regresi untuk pengukuran PE G- Kloroform : Y= 0.5500X + 0.0788, r = 0.975 Persamaan regresi untuk pengukuran FPLC : Y= 0.5772X - 0.0319, r = 0.987
(Y= Nilai Absorbsi pada panjang gelombang 565nM, X= Konsentrasi protein, r = koefisien regresi)
Faktor-faktor yang mempengaruhi pengendapan protein adalah jumlah dan posisi grup polar, berat molekul protein, pH larutan, dan temperatur. Protein akan mengendap pada kondisi 50% jenuh. Metode ekstraksi lain seperti yang dilaporkan oleh Akita dan Nakai (1992) yaitu ekstraksi IgY me lalui water dilusi
(pelarutan dalam air) dilanjutkan presipitasi IgY dari water soluble fraction
(WSF) menggunakan amonium sulfat. Hasil isolasi dari WSF sangat dipengaruhi oleh pH larutan, tingkat kelarutan kuning telur, dan lama inkubasi. Penurunan pH dapat mengurangi LDL pada supernatan. Pada telur segar tanpa penurunan pH didapatkan lebih banyak kontamina n lemak dan diperlukan waktu lebih la ma mendapatkan supernatan yang jernih. Hal ini karena lipid berikatan secara nonkovalen pada protein terutama lipoprotein. Pe ngaruh pH akan mengubah integritas granul kuning telur terhadap ikatan lipid. Prepsipitasi lemak telur juga dapat dilakukan dengan dektran sulfat yang mengandung CaCl2 (Szabo et al.1998), mencampur dengan asam kaprilat kemudian diendapkan dengan amonium sulfat dan didialisis dengan PBS (Bhanushali et al. 1994).
55
Gambar 11 Profil pita protein IgY antitetanus ekstraksi dengan metode PEG kloroform. M= marker, S = Sampel
Polson (1990) melaporkan penggunaan PEG dengan berat molekul 6000 sangat baik untuk IgY dibandingkan dengan pelarut organik yang lain seperti ether , toluene dan amonium sulfat. Sedangkan Jensenius et al. (1981) menggunakan dextran sulfat untuk mengendapkan IgY dari WSF. Penggunaan teknik ultrafiltrasi untuk memisahkan IgY dari WSF berdasarkan perbedaan berat molekul sangat sulit karena membran tersumbat oleh material lemak. Penggunaan teknik ini harus diawali pengendapan IgY dengan amonium sulfat (Akita dan Nakai 1993b), atau me ngubah pH larutan WSF menjadi pH 9.0 (Nakai et al.
1994). Untuk menghilangkan residu lemak dari WSF dapat juga digunakan food gum grade, sodium alginate, dan λ-carrageenan (Hatta et al.1997) atau dengan
anionic polysaccharide (Chang et al. 2000). Kriteria utama dalam pemilihan metode ekstraksi adalah efisiensi dan praktis. Efisiensi berarti terpisahnya secara sempurna komponen bebas dengan komponen terikat, meskipun secara nyata sulit didapatkan. Kepraktisan metode itu, yang menyangkut hal kecepatan proses, sederhana, mudah diaplikasikan, dan murah.
Hasil ekstraksi selanjutnya didialisis dalam larutan PBS pH 8 selama 24 jam pada suhu 4 oC. Dialisis merupakan proses buffer exchanges dari larutan konsentrasi rendah ke larutan konsentrasi tinggi, dalam proses ini terjadi pertukaran buffer dari tabung yang berisi PBS dengan larutan yang ada dalam tabung dialisis. Bersamaan dengan pertukaran buffer ikut juga terbuang molekul- molekul garam atau protein yang memiliki berat molekul kecil yang menkontaminasi sampel. Dalam penelitian ini digunakan tabung dialisis dengan
M S 220 170 116 53 21.5 180 50 18 kDa kDa
56
cut off 12 kDa, artinya hanya molekul dengan ukuran berat molekul kurang dari 12 kDa lolos dari tabung dialisis sedangkan ukuran molekul lebih besar akan tetap tertahan dalam tabung (Ford 2004).
Selanjutnya, hasil ekstraksi IgY antitetanus dipurifikasi untuk mendapatkan IgY antitetanus murni. Dari Gambar 11 terlihat masih ada pita protein dengan berat molekul tidak sama dengan IgY , hal itu membuktikan masih ada cemaran. Teknik pemurnian yang sering digunakan yaitu kromatografi dengan prinsip ion exchange (DEAE-Sephacel) (Akita dan Nakai 1992), filtrasi gel (Szabo et al.1998), thiophilic interaction chromatography (Hansen et al. 1998). Yokohama et al. (1993) melaporkan purifikasi IgY dengan hydoxypropyl methylcellulose phthalate 5% dilanjutkan dengan afinitas kromatografi menggunakan gel avil AL synthetic mendapatkan IgY konsentrasi tinggi dan tidak merusak aktivitas biologis IgY.
Dalam penelitian ini metode purifikasi setelah ekstraksi adalah secara kromatografi dengan teknik fast purification liquid chromatografi (FPLC) menggunakan alat AKTATM explorer 10S dengan kolom HiTrapT M IgY Purification
(Amersham pharmacia biotech). Kromatogram hasil pengujian IgY antitetanus Gambar 12 Kromatogram hasil FPLC IgY antitetanus.
57 ditampilkan pada (Gambar 12). Kolom ini berisi matriks dengan medium absorpsi
thiophilic, 2-mercaptopyridine digandengkan dengan sepharose high
performance, merupakan kolom yang mempunyai afinitas spesifik terhadap IgY. Interaksi antara IgY dan ligan (matriks) terjadi akibat kombinasi antara pertukaran (donor) elektron dan penerimaan aksi pada ligan atau gabungan antara interaksi hidrofilik dan hidrofobik antara ligan dan IgY.
Fraksi yang ditampung dan digunakan untuk uji selanjutnya adalah fraksi dengan puncak tertinggi (fraksi 4). Untuk meyakinkan bahwa fraksi itu merupakan protein (IgY) yang diharapkan, dilanjutkan dengan uji AGP untuk mengetahui spesifitasnya (Gambar 13) dan pengujian dengan SDS-PAGE untuk menentukan berat molekul dari protein yang diisolasi.
Karakterisasi IgY antitetanus dari kuning telur dilihat dari kespesifikan reaksi antara IgY antitetanus dengan toksoid tetanus yang diuji menggunakan uji AGP memperlihatkan terbentuknya garis presipitasi di antara lubang tengah (antigen) dan lubang sekeliling (antibodi) (Gambar 13). Presipitasi merupakan reaksi sekunder sebagai akibat dari interaksi primer antara antibodi dan antigen (Roit 2003), interaksi nonkovalen antara determinan antigen, epitop antigen, dan regio hipervariabel pada molekul antibodi (Kuby 2003). Hal itu menunjukkan bahwa antibodi yang diisolasi adalah IgY antitetanus. Penggunaan teknik AGP untuk deteksi terbentuknya antibodi (IgY) pada serum memerlukan keseimbangan jumlah antigen dan antibodi untuk membentuk garis presipitasi (Kuby 1997), karena AGP merupakan teknik difusi pasif (Liddell dan Weeks 1995).
Gambar 13 Hasil uji agar gel presip itasi IgY antitetanus setelah pemurnian dengan FPLC. Reaksi toksoid (1) dengan IgY (2). 1 2 2 2 1 2 2 2
58 Profil pita protein hasil pemurnian menggunakan kromatografi (FPLC) dianalis is menggunakan SDS-PAGE dengan pewarnaan comassie blue (Gambar 14). Metode SDS-PAGE digunakan mendeteksi keberadaan protein berdasarkan atas ukuran protein. SDS adalah detergen anionik yang mampu bereaksi dengan bagian hidrofobik dari protein. Dengan pemanasan maka seluruh bagian polipeptida akan terselimuti sehingga menjadi tidak bermuatan (Hames dan Rickwood 1987).
Profil pita protein setelah pemurnian pada sumur satu menunjukkan pita protein dengan berat molekul 180 kDa dan 198 kDa merupakan protein IgY utuh. Tidak ada pita protein yang lain menandakan tidak ada cemaran, dibandingkan dengan hasil SDS-PAGE hasil ekstraksi (Gambar 11) masih ditemukan banyak pita protein. Hal ini menandakan purifikasi dengan FPLC menghasilkan sampel protein lebih murni. Beberapa peneliti melaporkan berat molekul IgY berkisar antara 160 kDa sampai 200 kDa (Sun et al. 2001; Zhang 2003). Kadang-kadang pada SDS-PAGE didapatkan dua pita protein dengan berat 70 kDa untuk IgY rantai berat dan 21 kDa untuk IgY rantai ringan (Hatta et al. 1993).
Hasil purifikasi diidentifikasi kandungan proteinnya menggunakan spektrofotometri dengan metode Bradford. Pada Tabel 5 terlihat konsentrasi protein hasil purifikasi dengan FPLC sebesar 1.64 ± 0.42 mg/ml. Ini berarti konsentrasinya lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi hasil ekstraksi. Hal
Gambar 14 Hasil SDS-PAGE IgY antitetanus setelah pemurnian FPLC. M=Marker BM, 1 = IgY
M 1 220 170 116 76 53 21.5 kDa 198 180
59 ini disebabkan sebelum dimasukkan ke dalam alat FPLC telah dilakukan pemekatan dengan PEG 6000. Selanjutnya hasil purifikasi dipekatkan kembali sampai diperoleh konsentrasi protein 5.31 mg/ml, yang akan dipakai sebagai larutan stok IgY antitetanus untuk uji-uji berikutnya.
Metode purifikasi harus dilakukan secara berurutan tahap demi tahap, diawali dengan ekstraksi untuk pemisahan lemak telur, memisahkan plasma protein terlarut dari granul kuning telur dilanjutkan purifikasi secara kromatografi (Akita dan Nakai 1992). Pemilihan teknik perlu dipertimbangkan dalam memfasilitasi pengembangan pasar ke depan terutama untuk produk yang punya nilai tambah. Pertimbangan biaya produksi IgY merupakan masalah yang krusial dan perlu dicermati supaya produk itu tidak terlalu mahal dan terjangkau konsumen. Pengembangan teknik pemisahan dan purifikasi IgY dari kuning telur yang sederhana , efisien, otomatis, proses berlangsung secara kontinyu tanpa menggunakan zat kimia perlu dipertimbangkan.
Aktivitas Biologis Ig Y Antitetanus.
Titrasi toxoid, sampel IgY antitetanus, dan konjugate enzim
Konsentrasi toxoid optimal dalam uji Elisa untuk IgY antitetanus pada konsentrasi 4 Lf/ml buffer carbonat-bicarbonats. Konjugate yang dipakai adalah
Rabbit anti– chicken horseradish peroxidase konjugate No Product A 9046 (SIGMA). Konjugate anti-chicken diencerkan 1:20 000 dengan menggunakan larutan PBS yang mengandung Tween 20 (PBST). Konsentrasi sampel IgY antitetanus murni yang digunakan adalah 4 µg/ml .
Aktivitas IgY antitetanus Setelah perlakuan pH
Hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas IgY antitetanus dapat dilihat pada Gambar 15. Aktivitas biologis IgY antitetanus menurun sangat nyata (p<0.01) pada perlakuan pH. Penurunan sangat nyata terutama terjadi pada perlakuan pH 2 dan pH 3. Penurunan aktivitas IgY antitetanus terjadi pada semua perlakuan pH (pH 7.6 sebagai kontrol). Penurunan aktivitas bertambah besar sejalan dengan peningkatan waktu inkubasi terutama pada pH 2 dan 3 (Gambar 16), dengan waktu inkubasi 15, 30, 45, 60, dan 120 menit, persentase penurunan
60 pada pH 2 adalah : 26.98%, 30.88%, 50.35%, 55.21%, dan 91.16%, pH 3 masing- masing 15.67%, 21.04%, 35.55%, 51.01%, 87.63%, pH 7 masing-masing 14.96%, 15.22%, 19.69%, 19.69%, 20.97% , dan pH 9 masing-masing 16. 11%, 16.94%, 15.09%, 28.06%, 23.33% . Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Shimizu
et al. (1992) dan Hatta et al. (1993) yang menyatakan stabilitas IgY terhadap pH 2 sampai 3 lebih rendah dibandingkan dengan IgG sapi dan IgG kelinci (Camenisch
et al. 1999). Shin et al.(2002) melaporkan penurunan aktivitas IgY pada pH 2 dan pH 3 sampai 80% dan 70% dan aktivitasnya baik pada pH 4 sampai 8.
Penurunan aktivitas IgY antitetanus diinkubasi 15 menit berbeda nyata pada semua pH perlakuan dibandingkan de ngan kontrol (p<0.5) (Gambar 16). Aktivitas IgY antitetanus pada pH 7 dan pH 9 tidak berbeda nyata (P>0.5) pada inkubasi sampai 120 menit. Sedangkan aktivitas IgY antitetanus pada pH 2 dan pH 3 menurun secara nyata sejalan dengan bertambahnya waktu inkubasi, penurunan yang sangat nyata terjadi setelah diinkubasikan selama 120 menit baik pada pH 2 maupun pH 3. pengaruh pH 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 0 15 30 45 60 120 waktu inkubasi
Nilai elisa unit
pH2 pH3 pH7 pH9
Gambar 15 Pola aktivitas IgY antitetanus setelah perlakuan pH.
Penurunan aktivitas ini terjadi karena variasi struktur protein yang dimiliki oleh IgY bersifat lebih sensitif terhadap pH asam dibandingkan dengan pH basa (Hatta et al. 1993). Begitu pula secara struktural, lemahnya ikatan disulfida dan fleksibilitas regio hinge yang terbatas secara keseluruhan mempengaruhi stabilitas molekul IgY (Narat 2003). IgY secara natural dilindungi oleh granul-granul
61 kuning telur (Schmidt et al. 1989). Jika zat kimia itu hilang saat purifikasi dan IgY diseliputi lagi (encapsulated) maka ketahanan IgY terhadap pH dan enzim pencernaan meningkat (Akita dan Nakai 1993a). Penurunan aktivitas IgY yang sangat cepat disebabkan kerusakan antigen binding site akibat inkubasi pada asam. Perubahan IgY ke bentuk Fab juga diikuti peruba han antigen binding site. Perubahan struktur skunder IgY (domain konstan) juga terjadi setelah perlakuan asam. Ketahanan molekul IgY dipengaruhi oleh ikatan nonkovalen intermolekular (s-s) antara tempat reduksi rantai berat dan rantai ringan, ikatan itu lebih lemah pada IgY dibandingkan dengan IgG. Setelah terjadi reduksi rantai berat dan rantai ringan, IgY lebih mudah dipisahkan dibandingkan dengan IgG. Hal itu juga