Pembentukan Populasi BC1F1 Ciherang/Swarna-Sub1 dan BC1F1
Ciherang/IR64-Sub1
Pembentukan populasi BC1F1
Ciherang-Sub1 dari penelitian ini merupakan penggabungan sifat yang dimiliki dari dua
jenis tetua yang berbeda. Proses
pembentukan populasi BC1F1 tersebut dilakukan melalui proses persilangan antara kepala putik dengan benang sari sehingga
dapat dihasilkan embrio yang akan
berkembang menjadi benih. Menurut Welsh (1981), penggabungan sifat yang berbeda dari kedua tetua pada BC1F1 terjadi secara
acak, sehingga kombinasi sifat yang
dihasilkan bersifat lebih menguntungkan dari kedua tetuanya. Keturunan yang dihasilkan akan memiliki sifat baru yang berbeda dengan kedua induknya. Keturunan BC1F1 yang dihasilkan bersifat heterozigot. Hasil persilangan antara Ciherang (host)
dengan F1 Ciherang-Sub1 (donor) akan
menghasilkan populasi BC1F1 dengan
komposisi gen 75%:25%. Secara teori gen dari kedua tetua telah bersegregasi dalam tanaman BC1F1 dengan komposisi gen Ciherang paling banyak terkandung pada populasi BC1F1 Ciherang-Sub1 (Gambar 5).
Gambar 5 Diagram metode persilangan terarah.
Pembentukan benih BC1F1 Ciherang-Sub1 merupakan suatu proses penyilangan balik (back cross) antara tanaman tetua Ciherang (nontoleran genangan) dengan
tanaman F1 Ciherang-Sub1 (toleran
genangan atau donor Sub1) (Gambar 6).
Metode yang digunakan dalam proses penyilangan ini adalah metode persilangan terarah (site-directed crossing). Metode persilangan terarah ini lebih dikenal dengan nama mark er-assisted back crossing (Lu & Chang 1980, Mackill et al. 2007). Metode persilangan terarah merupakan alternatif yang dapat digunakan untuk mengintroduksi sifat tertentu secara spesifik tanpa harus melalui rekayasa genetika yang dapat menghasilkan tanaman transgenik (Xu et al. 2004, Mackill et al. 2007). Penyilangan balik tanaman F1 Ciherang-Sub1 terhadap Ciherang ditujukan agar tanaman BC1F1
Ciherang-Sub1 yang dihasilkan memiliki
sifat yang dimiliki oleh Ciherang, seperti produktivitas padi yang dihasilkan tinggi dan tahan terhadap penyakit.
Proses penyilangan yang dilakukan
untuk menghasilkan tanaman BC1F1
Ciherang-Sub1 perlu perhatian yang khusus,
salah satunya waktu penyilangan.
Persilangan dilakukan ketika pembungaan antara tetua jantan dan tetua betina memiliki waktu yang sama. Oleh karena itu, pengaturan dan penghitungan jarak waktu tanam perlu dilakukan agar kedua tetua
dapat berbunga secara bersamaan.
Persilangan antara Ciherang dengan F1
Ciherang/IR64-Sub1 terjadi lebih awal
dengan masa berbunga ±86 hari, sedangkan persilangan antara Ciherang dengan F1 Swarna-Sub1 memiliki masa berbunga ±104 hari.
Faktor lain yang mempengaruhi
tingkat keberhasilan proses penyilangan adalah proses kastrasi. Tetua betina (padi Ciherang) harus benar-benar bersih dari kandungan benang sari agar tidak terjadi penyerbukan sendiri. Apabila padi Ciherang ini melakukan penyerbukan sendiri maka padi yang dihasilkan adalah padi Ciherang bukan padi BC1F1 Ciherang-Sub1. Proses
penyilangan yang dilakukan dalam
penelitian ini dapat dikatakan berhasil. Sepuluh tanaman padi Ciherang yang disilangkan dengan sepuluh tanaman padi F1
Ciherang-Sub1 dapat menghasilkan cukup
banyak benih padi BC1F1 Ciherang-Sub1.
Jumlah benih BC1F1 Ciherang/Swarna-Sub1
yang dihasilkan dari proses penyilangan ini sebanyak 147 benih, sedangkan benih
BC1F1 Ciherang/IR64-Sub1 sebanyak 124
benih. Benih yang dihasilkan dari
persilangan memiliki bentuk ramping
panjang tanpa kulit luar. Benih-benih
tersebut kemudian ditumbuhkan untuk
menghasilkan tanaman utuh BC1F1
Ciherang-Sub1 (Gambar 6).
Gambar 6 Pembentukan dan seleksi padi
BC1F1 Ciherang-Sub1. (1)
Tetua host betina Ciherang
dengan donor F1 Ciherang-Sub1
yang telah dikastrasi; (2) Bunga padi yang telah diserbuki tepung sari dari bunga jantan dan ditutup dengan kertas minyak;
(3) Benih BC1F1 hasil
persilangan; (4) Benih ditanam pada petri dan bak kecil; (5)
Pengujian genangan; (6)
Populasi tanaman BC1F1
Ciherang-Sub1 dalam ember. Seleksi Uji Toleransi Genangan Tanaman padi pada umumnya dapat beradaptasi terhadap lingkungan yang terkena cekaman genangan, seperti lahan yang terkena banjir berlebihan. Respon tanaman padi terhadap lingkungan yang seperti itu akan melakukan dua proses pertahanan, yaitu pemanjangan sel tanaman dan toleran terhadap cekaman genangan
tersebut (Fukao & Bailey 2008).
Pemanjangan sel tanaman di bawah kondisi
Ciherang (host) F1Ciherang-Sub1 1 2 3 4 5 6
11
DNA padi Ciherang. Hal ini menunjukkan bahwa jumlah DNA yang diperoleh dari
hasil isolasi jumlahnya sedikit. Nilai
konsentrasi ini sangat berpengaruh terhadap proses selanjutnya yaitu analisis PCR. Konsentrasi masing-masing sampel harus disamakan dalam analisis PCR agar jumlah DNA yang teramplifikasikan relatif sama. Oleh karena itu, dilakukan pengenceran pada semua sampel hingga 50 µg/mL. Nilai kemurnian yang diperoleh juga memberikan hasil yang berbeda. Sampel DNA yang memiliki nilai kurang dari 1.8 (seperti pada
Ciherang) menunjukkan sampel DNA
mengalami kontaminasi protein sedangkan nilai kemurnian lebih dari 2.0 menunjukkan adanya kontaminasi oleh RNA (Sambrook & Russel 1989).
Tabel 2 Pengukuran konsentrasi dan
kemurnian DNA daun padi
Varietas padi Konsentrasi
(µg/mL) A260/280 Ciherang (Cih) 524.7117 1.6 Swarna-Sub1 1045.3893 2.0 IR64-Sub1 860.4125 1.9 BC1F1 Cih/Swarna-Sub1 1 3575.0753 1.6 BC1F1 Cih/Swarna-Sub1 2 4585.5420 1.5 BC1F1 Cih/Swarna-Sub1 3 4512.3892 1.5 BC1F1 Cih/IR64-Sub1 1 4121.3164 1.9 BC1F1 Cih/IR64-Sub1 2 2358.7227 1.8 BC1F1 Cih/IR64-Sub1 3 1573.6383 1.9
Hasil Seleksi BC1F1 Ciherang-Sub1
dengan Analisis PCR
Marka Sub1A (AEX1)
Tanaman BC1F1 Ciherang-Sub1 yang
telah diseleksi dari uji toleran genangan perlu diuji lebih lanjut melalui analisis PCR.
Tanaman BC1F1 Ciherang-Sub1 yang
diduga telah terintrogresi gen Sub1 dari
tanaman tetua Ciherang/Swarna-Sub1 dan
Ciherang/IR64-Sub1 perlu ditentukan secara spesifik bahwa tanaman tersebut telah mengandung gen Sub1. Analisis PCR yang pertama kali dilakukan adalah seleksi
tanaman padi BC1F1 Ciherang-Sub1 dengan
marka Sub1A (AEX1). Marka ini digunakan
untuk menyeleksi tanaman BC1F1
Ciherang-Sub1 yang mengandung gen
Sub1A. Menurut Septingsih et al. (2008), SNP (Spesific Single Nucleotide Polymorphism) dalam daerah pengkodean Sub1A menyebabkan terjadinya substitusi
asam amino (nontoleran: CCG=prolin;
toleran: TCG=serin) yang ditargetkan untuk desain marka. Marka AEX1 merupakan pengembangan primer PCR dengan SNP
pada ujung 3’. Marka tersebut secara
spesifik dirancang untuk alel toleran
(IR40931). Primer marka AEX1F sebagai
forward dengan sekuen 5’
AGGCGGAGCTACGAGTACCA 3’.
Primer AEX1F berukuran 231 bp dengan nilai Tm sebesar 62.2ºC. Primer AEX1R
merupakan primer reverse yang spesifik
untuk toleran dengan nilai Tm sebesar 62.4ºC. Sekuen dari primer AEX1R adalah
5’ GCAGAGCGGCTGCGA 3’.
Hasil elektroforesis sampel DNA
tanaman padi BC1F1 Ciherang/Swarna-Sub1
(Gambar 9) dan BC1F1 Ciherang/IR64-Sub1 (Gambar 10) merupakan visualisasi sampel DNA tanaman padi dengan menggunakan gel agarosa 2%. Pengujian terhadap gen Sub1 dengan marka AEX1 ini merupakan tanaman BC1F1 Ciherang-Sub1 yang positif toleran genangan berdasarkan hasil uji genangan dan memiliki tingkat pertumbuhan yang baik. Data yang menunjukkan adanya pita DNA tersebut memberikan informasi bahwa tanaman-tanaman padi tersebut
mengandung gen Sub1A sehingga bisa
diidentifikasi sebagai padi toleran genangan. Namun, pada tanaman padi yang tidak memperlihatkan adanya pita DNA seperti padi Ciherang dan IR42 menunjukkan bahwa padi tersebut tidak memiliki gen Sub1A (nontoleran genangan).
Padi BC1F1 Ciherang-Sub1
memperlihatkan hasil yang positif bahwa keberadaan gen Sub1A telah terintrogresi ke dalam padi Ciherang melalui persilangan terarah dengan ukuran pita DNA yang diperlihatkan pada ukuran 231 bp mengikuti
tetua donornya masing-masing yaitu
Swarna-Sub1 dan IR64-Sub1. Hasil ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yaitu hasil seleksi tanaman toleran genangan dengan menggunakan marka AEX1 pita DNA yang dihasilkan akan berukuran 231 bp (Septiningsih et al. 2008). Selanjutnya
tanaman padi BC1F1 Ciherang-Sub1 yang
telah positif mengandung gen Sub1 akan
disilangbalikkan (back cross) kembali
dengan padi Ciherang untuk menghasilkan