Dua ratus empat puluh sampel organ DOC (trakea, paru-paru, usus, hati dan ginjal) dibuat menjadi preparat histologi pada slide yang telah dilapisi oleh gelatin dan Khromium potasium sulfat (CrK(SOB4B). Selanjutnya dilakukan teknik
pewarnaan IHK menggunakan antibodi monoklonal H5N1 (CG1) sebagai antibodi primernya. Pewarnaan antigen dengan menggunakan kromogen (AEC) sehingga antigen akan terlihat berwarna kemerahan (Lampiran 3).
Hasil deteksi virus AI (antigen) pada 240 sampel organ DOC dengan teknik IHK diperoleh hasil positif sebanyak 158 sampel (65.8%)(Gambar 4). Sebanyak 104 sampel (65.8 %) dari hasil 158 sampel positif menunjukkan antigen hanya ditemukan pada organ trakea, paru-paru dan usus, sedangkan keberadaan antigen yang ditemukan pada semua organ (trakea, paru-paru, usus, hati dan ginjal) terdapat pada 54 sampel (34.2 %) (Tabel 1).
Persentase Hasil IHK
34.2
65.8
negatif positif
Gambar 4. Presentase hasil positif dan negatif IHK pada organ DOC Tabel 1. Persentase distribusi antigen AI subtipe H5N1 pada organ DOC dengan
metode IHK
No Distribusi antigen pada organ Jumlah Persentase
1. Trakea, paru-paru, usus 104 65.8 %
2. Semua organ (trakea, paru-paru, usus, hati, ginjal) 54 34.2 %
Total 158 100%
Virus influenza lebih menyukai bereplikasi pada saluran pencernaan dan menyebabkan tingginya titer virus pada feses (Horimoto & Kawaoka 2001). Kombinasi antara adanya reseptor sel terhadap antigen virus AI serta banyaknya enzim proteolitik memungkinkan efisiensi replikasi virus influenza pada organ usus dan proventrikulus (Slemons & Easterday 1998; Gambaryan et al. 2006). Banyaknya enzim proteolitik pada saluran pencernaan akan mengaktifkan pemotongan post translasi dari HA0 menjadi HA1 dan HA2 (Gurten & Klenk 1999). Pembelahan protein HA ini akan menyebabkan efisiensi replikasi virus AI pada usus.
Virulensi dari virus AI diperankan oleh glikoprotein HA yang memulai infeksi dengan memperantarai ikatan virus dengan sel reseptor dan dengan mendorong pembebasan virus RNP melalui fusi membran. Aktivasi proteolitik pasca-translasi dari prekursor molekul HA (HA0) menjadi subunit HA1 dan HA2 oleh protease hospes menghasilkan fusogenik domain pada terminal amino dari HA2 yang memperantarai fusi antara amplop virus dan membran endosomal,
sehingga aktivasi proteolitik dari molekul HA sangat penting untuk infektivitas dan penyebaran virus melalui tubuh hospes (Gurten & Klenk 1999; Steinbauer 1999), selanjutnya terjadi pergeseran kerusakan organ sesuai dengan masuknya virus ke dalam aliran darah. Kobayashi et al. (1996) menyatakan bahwa virus AI bereplikasi secara efisien di dalam endotelium pembuluh darah dan sel parenkhimal perivaskular yang tampaknya penting untuk penyebaran virus dan infeksi sistemik, sehingga keterlibatan sistem kardiovaskular memainkan peranan penting dalam patogenesis infeksi virus AI.
Banyaknya antigen yang terdeteksi pada organ paru-paru dan trakea karena virus AI memiliki kecenderungan berkembang biak pada sel epitel bersilia di saluran pernafasan. Organ saluran pernafasan merupakan sasaran utama virus AI, sel-sel epitel saluran pernafasan rentan terhadap infeksi virus. Reseptor virus adalah penentu tropism (respon organisme terhadap stimulus luar). Pada infeksi AI, tempat ikatan protein virus diperlukan untuk ikatan ke galaktosa mengikat asam sialik pada permukaan sel-sel hospes (Weis et al. 1988). Virus yang masuk melalui inhalasi akan menembus mukosa saluran pernafasan dan melekat pada reseptor galaktosa yang ada pada saluran pernafasan dilanjutkan dengan proses endositosis dan fusi virus. Pada saat proses fusi, genom virus dilepaskan ke sitoplasma sel terinfeksi selanjutnya genom akan bermigrasi ke nukleus. Di nukleus inilah terjadi trankripsi dan replikasi virus (Cross et al. 2001). Virus AI yang menginfeksi sel-sel epitel pernafasan akan bereplikasi dalam waktu berjam- jam dan memproduksi sejumlah virion (Behrens & Stoll 2007). Coleman (2007) menyatakan bahwa proses replikasi virus sangat cepat, sekitar 10 jam/siklus. Antigen virus AI jarang ditemukan pada hati, ginjal dan jantung kemungkinan karena infeksi virus AI masih pada tahap awal sehingga belum menyebar ke organ viseral lainnya. Mo et al. (1997) berpendapat bahwa antigen dapat dideteksi pada otak, jantung, paru-paru, pankreas dan ginjal dan diduga kuat virus HPAI menyerang saluran pernafasan untuk kemudian bereplikasi di sini dan menyebar ke semua organ viseral.
Derajad kerusakan akibat penyakit AI tergantung pada banyak faktor antara lain virulensi dari virus, status kekebalan dan diet dari hospes adanya infeksi bakterial dan stress yang dibebankan pada hospes. Virulensi virus AI juga sangat
dipengaruhi oleh peranan HA di mana memperantai ikatan virus dengan sel reseptor dan mendorong pembebasan ribonukleoprotein virus melalui fusi membran. HA virus AI yang tidak virulen biasanya hanya memecah dalam sejumlah sel tertentu, sehingga hanya menyebabkan infeksi lokal di dalam saluran pernafasan atau intestinal atau keduanya mengakibatkan infeksi yang ringan atau tanpa gejala sama sekali. HA virus AI yang virulen mampu memecah pada berbagi sel yang berbeda dari hospes, sehingga menyebabkan infeksi sistemik yang mematikan pada unggas (Easterday et al. 1997).
Teknik pewarnaan IHK dapat diaplikasikan terhadap sejumlah organ unggas. Sejumlah spesimen organ diproses sebagai preparat histopatologi dan jaringan organ yang diduga mengandung virus flu burung direaksikan dengan menggunakan kit DakoCytomation. Antigen yang terdapat pada jaringan organ dapat divisualisasikan dengan penambahan pewarna/substrat AEC yang menghasilkan warna coklat kemerahan. Teknik pewarnaan ini terbukti sangat cepat dan akurat untuk mengkonfirmasi diagnosis pada preparat histopatologi dan membuktikan bahwa hewan terinfeksi oleh virus AI subtipe H5N1. Antigen AI subtipe H5N1 dapat dideteksi dengan sangat jelas pada pangkal Esofagus, paru- paru, usus, limpa, ginjal dan ovarium. Antigen virus AI subtipe H5N1 ini dapat dideteksi dengan baik menggunakan antibodi monoklonal karena antibodi monoklonal hanya bereaksi dengan satu epitop struktur antigenik virus (Zheng et al. 2001; Vareckova et al. 2002; Ohnishi et al. 2005).
Antibodi monoklonal yang digunakan pada penelitian ini adalah anti antigen AI subtipe H5N1 yang diproduksi dari isolat Indonesia. Astawa et al. (2007) berhasil mengisolasi 12 monoklonal yang spesifik terhadap virus AI dan 8 monoklonal (AG8, BC12, CC5, CG1, DD9, DF11, EA11 dan EE8) dapat digunakan untuk mendeteksi virus AI pada organ bebek. Hasil uji dengan menggunakan western blot diketahui bahwa 2 monoklonal (DD9 dan CC5) dari 8 monoklonal tersebut mengenali 2 pita protein dengan berat molekul 76 dan 58 kDa, sedangkan 3 monoklonal (CG1, EE8, dan AG8) bereaksi kuat terhadap antigen AI pada organ bebek. Penggunaan antibodi monoklonal H5N1 (CG1) pada penelitian ini karena antibodi tersebut bereaksi kuat terhadap antigen AI organ DOC. Penggunaan antibodi monoklonal virus influenza manusia terhadap
protein HA virus dilaporkan memiliki senstifitas 100 % dan spesifisitas 99,1 % dalam mengikat subtipe HA virus (Vareckova et al. 2002). Sama seperti pada virus influenza manusia, antibodi monoklonal terhadap virus AI juga memiliki derajat sensitifitas dan spesifisitas yang sama ketika digunakan untuk mendeteksi antigen virus AI (Astawa et al. 2007).
Distribusi, lokasi dan jumlah antigen H5N1 yang terdapat pada organ dipengaruhi oleh spesies dan umur unggas, strain virus, konsentrasi virus, rute infeksi (Hooper et al. 1995; Suarez et al. 1998). Brown et al. (1992) melaporkan sebaran antigen yang dideteksi pada organ ayam yang terserang HPAI dapat dideteksi pada organ otak, jantung, ginjal terutama menempati area vaskular yaitu pada epitel endotel pembuluh darah. Hooper et al. (1995) juga menunjukkan bahwa virus HPAI dapat divisualisasikan pada kulit jengger, otak, jantung, paru- paru, otot, skeletal, ginjal, limpa dan ovarium, kerusakan yang terjadi terlihat menonjol pada daerah vaskuler semua pembuluh darah organ yang terinfeksi dan hal ini berkolerasi positif dengan antigen yang dideteksi pada area tersebut. Menurut Perkins & Swayne (2001), antigen HPAI juga dapat dijumpai pada otak, pankreas, limpa, kelenjar adrenal dan ovarium.
Perubahan patologis jaringan organ DOC terlihat adanya infiltrasi limfosit dan nekrosis (Setyawati 2008). Hal ini terjadi karena virus bereplikasi pada sel sehingga menyebabkan degenerasi dan kematian sel (Cheville 2006). Menurut Mo
et al (1997), antigen dalam jumlah tinggi terlihat mengelilingi area yang
mengalami nekrosis tetapi relatif sedikit pada pusat nekrosis. Suarez et al. (1998) juga membuktikan bahwa kapiler pembuluh darah mengalami hipertropi dan berisi masa protein serta sel radang. Fenomena ini menimbulkan hambatan suplai oksigen sehingga jaringan mengalami hipoksia yang berakibat nekrosis.
SIMPULAN
1. Sebanyak 158 sampel (65.8%) dari 240 sampel DOC yang dilalulintaskan melalui Bandar Udara Soekarno Hatta menunjukkan hasil positif AI dengan metode pemeriksaan IHK.
2. Antigen AI subtipe H5N1 yang ditemukan pada organ trakea, paru-paru dan usus sebanyak 104 sampel (65.8%) dari 158 sampel, sedangkan yang
ditemukan pada seluruh organ yang diperiksa (trakea, paru-paru, usus, hati dan ginjal) sebanyak 54 sampel (34.2%).
3. Infeksi virus AI yang menyerang DOC kemungkinan masih pada tahap awal infeksi karena lebih banyak ditemukan pada saluran pernafasan dan pencernaan daripada organ viseral lainnya.
SARAN
1. Perlu dilakukan deteksi keberadaan antigen AI subtipe H5N1 pada induk ayam menjelang bertelur sehingga diperoleh kepastian adanya penularan secara vertikal.
2. Perlu dilakukan deteksi keberadaan antigen AI subtipe H5N1 pada embrio telur dari berbagai umur embrio.
3. Perlu adanya monoklonal isolat Indonesia lainnya untuk dalam pengujian IHK mengingat virus AI mudah bermutasi.