Bakteri asam laktat yang digunakan merupakan hasil isolasi dari susu sapi segar dan produk olahannya. Bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar dan produk olahannya ini berpotensi untuk menjadi kandidat bakteri probiotik, dengan syarat tahan pada berbagai kondisi dalam saluran pencernaan.
Konfirmasi Kultur Starter Indigenous Susu Sapi Segar dan Bakteri Patogen Uji
Bakteri asam laktat dan bakteri patogen yang diujikan harus terbebas dari kontaminasi bakteri lain. Uji konfirmasi dilakukan dengan pewarnaan Gram dan uji katalase untuk melihat morfologi BAL dan bakteri patogen uji yang seragam, homogen dan murni. Pewarnaan Gram dilakukan untuk menggolongkan jenis bakteri Gram positif atau negatif. Uji katalase dilakukan untuk mengetahui BAL dan bakteri patogen uji termasuk sifat katalase negatif atau positif. Karakteristik BAL dan bakteri patogen uji melalui uji konfirmasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik BAL Indigenous Susu Sapi Segar dan Bakteri Patogen Uji
Bakteri Pewarnaan
Gram
Morfologi Bentuk dan Susunan
Sifat Katalase
S. thermophilus S-01* Positif Bulat rantai Negatif
L. bulgaricus S-01* Positif Batang panjang Negatif
B. longum Y-01 * Positif Batang pendek Negatif
L. acidophilus Y-01 * Positif Batang Negatif
S. aureus ATCC 25923** Positif Bulat Positif
E. coli ATCC 25922** Negatif Batang Positif
S. Typhimurium ATCC 14028 Negatif Batang Positif
Keterangan : * sesuai dengan Wardani (2009)
** sesuai dengan Ambarwati dan Gama (2009)
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengetahui bakteri tersebut termasuk Gram negatif atau Gram positif. Perbedaan ini dilihat berdasarkan komposisi dinding sel dan sifat pewarnaannya. Selain itu, juga berbeda dalam sifat sensiti- fitasnya terhadap kerusakan mekanis atau fisis, terhadap enzim, desinfektan dan antibiotik (Hadioetomo, 1993). S. thermophilus S-01, L. bulgaricus S-01, B. longum
24 positif, sedangkan E. coli ATCC 25922 dan S. Typhimurium ATCC 14028 adalah bakteri Gram negatif. Hasil pewarnaan menunjukkan bakteri-bakteri yang tergolong Gram positif tersebut terlihat berwarna biru (menyerap pewarna kristal violet), sedangkan bakteri-bakteri Gram negatif terlihat berwarna merah, karena lebih menyerap pewarna safranin.
Menurut Hadioetomo (1993), bakteri Gram negatif bersifat lebih konsisten terhadap reaksi pewarnaan, tetapi bakteri Gram positif sering berubah sifat pewarnaannya, sehingga bakteri Gram positif dapat menunjukkan reaksi Gram
variable. Kultur bakteri yang biasa digunakan dalam pewarnaan Gram adalah kultur
berumur 24 jam, jika kultur bakteri terlalu tua, maka bakteri tersebut akan kehilangan kemampuan untuk menyerap kristal violet dan lebih menyerap pewarna safranin. Perubahan ini dapat disebabkan juga oleh perubahan kondisi lingkungan dan modifikasi teknik pewarnaan.
Pewarnaan awal bakteri adalah dengan zat warna basa kristal violet, jika kelebihan warna, maka dicuci dengan air, kemudian diberi larutan yodium yang akan membentuk suatu kompleks antara kristal violet dan iodium. Pencucian dengan alkohol dimaksudkan untuk mencuci kompleks tersebut, sehingga kompleks tersebut keluar dari dinding sel bakteri Gram negatif, sehingga saat diberi pewarna safranin, dinding sel Gram negatif akan menyerap safranin dan menjadi berwarna merah. Gram positif tidak ada kompleks yang keluar karena lapisan peptidoglikan pada dinding selnya lebih tebal dan menyebabkan Gram positif tidak menyerap warna safranin dan tetap berwarna biru seperti Kristal violet (Hadioetomo, 1993).
Mekanisme pewarnaan Gram memang didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase tinggi daripada yang dikandung dari Gram positif. Dinding bakteri Gram negatif juga lebih tipis. Alkohol dalam pewarnaan menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya permeabilitas dinding sel Gram negatif. Pewarna Kristal violet dan iodium yang sudah masuk dalam dinding pun dapat diekstraksi. Gram positif dengan kandungan lemak lebih rendah, jika diberi alkohol justru membuat pori-pori mengecil dan permeabilitas berkurang, sehingga Kristal violet dan iodium tidak dapat terekstraksi (Pelczar dan Chan, 2007).
25 Pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap keempat bakteri asam laktat menunjukkan hasil bentuk bakteri B. longum Y-01, L. acidophilus Y-01 dan L. bulgaricus S-01 adalah batang, sedangkan S. thermophilus S-01 berbentuk bulat
seperti rantai. Seperti yang dikemukakan Tamime dan Robinson (2008),
S.thermophilus memang berbentuk batang yang membentuk susunan seperti rantai dan L. bulgaricus berbentuk batang panjang. Bentuk BAL hasil ewarnaan Gram
dapat dilihat pada Gambar 3.
a). Streptococcus thermophilus b). Lactobacillus bulgaricus
c). Bifidobacterium longum d). Lactobacillus acidophilus
Gambar 3. Bentuk Bakteri Asam Laktat Indigenous Susu Sapi Segar Hasil
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram bakteri patogen pada Gambar 4, menunjukkan bentuk masing-masing bakteri patogen setelah dilakukan pewarnaan Gram dan sesuai dengan Hadioetomo (1993). E. coli berbentuk batang lurus. S. Typhimurium
berbentuk batang, sedangkan S. aureus berbentuk kokus membentuk anggur.
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2
26 karena H2O2 bersifat racun terhadap sel mikroba. Beberapa bakteri yang termasuk
katalase negatif adalah Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus dan Clostridium.
Escherichia coli Salmonella Typhimurium Stapylococcus aureus
Gambar 4. Bentuk Bakteri Patogen Hasil Pewarnaan Gram
Bakteri katalase positif seperti S. aureus bisa menghasilkan gelembung- gelembung oksigen karena adanya pemecahan hidrogen peroksida (H2O2) oleh enzim
katalase yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Komponen H2O2 ini merupakan
salah satu hasil respirasi aerobik bakteri, misalnya S. aureus, dimana hasil respirasi tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik bagi bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen ini harus dipecah agar tidak bersifat toksik lagi. Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif, sehingga
tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim katalase yang menguraikan H2O2.
Ketahanan Kultur Starter BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada pH Berbeda
Daya tahan hidup bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan merupakan syarat mikroorganisme untuk dapat memberikan manfaat kesehatan setelah dikonsumsi. Stress yang pertama terjadi pada sel bakteri yang ada dalam saluran pencernaan adalah pada kondisi asam lambung. Chou dan Weimer (1999), waktu yang diperlukan mulai dari bakteri masuk sampai keluar lambung sekitar 90 menit. Jadi bakteri asam laktat yang diseleksi untuk digunakan sebagai probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan asam lambung (pH 2 dan 2,5) selama sedikitnya 90 menit. Ketahanan BAL pada pH berbeda pada penelitian ini dilakukan selama 180 menit atau 2 kali lebih lama dari waktu normal makanan masuk lambung sampai keluar lambung, untuk memastikan ketahanan BAL pada kondisi pH yang berbeda.
27 Pengaturan pH media pertumbuhan BAL untuk menyamakan dengan kondisi dalam lambung (2, 2,5 dan 3,2) dan usus halus (7,2) adalah dengan menambahkan HCl dan NaOH. HCl digunakan untuk menurunkan pH media hingga mencapai kondisi pH yang diinginkan. Alasan penggunaan HCl adalah karena HCl mempunyai karakteristik yang hampir sama dengan asam yang dihasilkan di lambung. HCl adalah asam kuat yang mudah terdisosiasi menghasilkan proton, yang menyebabkan penurunan pH medium di luar sel atau pH ekstraseluler. NaOH digunakan untuk menaikkan pH, hingga mencapai kondisi pH 7,2, karena merupakan basa kuat, mengandung Na (garam) yang sama dengan karakteristik garam empedu yang disekresikan di dalam duodenum. Jumlah populasi BAL sebelum dan sesudah inkubasi dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Jumlah Populasi BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada pH Berbeda
No .
Lama inkubasi
Populasi BAL (log10 cfu/ml) S. thermophilus S-01 L bulgaricus S-01 B. longum Y-01 L. acidophilus Y-01 ---pH 2,0 ± 0,1--- 1. P0 menit 7,83 ± 0,44 7,60 ± 0,22 7,15 ± 0,30 7,06 ± 0,12 P180 menit ND 7,42 ± 0,31 7,31 ± 0,3 7,15 ± 0,13 (P180- P0) -7,83 ±0,44 -0,18±0,13 0,16 ± 0,11 0,09 ± 0,06 ---pH 2,5 ± 0,1 --- 2. P0 menit 6,89 ± 0,87 7,69 ± 0,13 7,36 ± 0,09 b 7,25 ± 0,02 P180 menit ND 6,50 ± 0,73 7,62 ± 0,06 a 7,52 ± 0,12 (P180- P0) -6,89 ± 0,87 -1,19 ± 0,84 0,26 ± 0,18 0,29 ± 0,21 ---pH 3,2 ± 0,1 --- 3. P0 menit 8,12 a ± 0,71 7,87 ± 0,19 7,50 ± 0,33 7,12 b ± 0,03 P180 menit 6,09 b ± 0,71 7,43 ± 0,52 7,92 ± 0,29 7,43 a ± 0,08 (P180- P0) -2,03 ± 1,43 -0,45 ± 0,31 0,42 ± 0,30 0,31 ± 0,22 --- --pH 7,2 ± 0,1--- 4. P0 menit 6,90 ± 0,09 8,12 ± 0,14 7,01 b ± 0,17 7,45 b ± 0,08 P180 menit 7,32 ± 0,30 7,28 ± 0,40 7,45 a ±0,15 7,81 a ± 0,14 (P180- P0) 0,42 ± 0,30 -0,84 ± 0,60 0,44 ± 0,31 0,36 ± 0,25 Keterangan : * apabila hasilnya (-) menunjukan adanya kematian;
** huruf superskript (a dan b) yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05)
ND = not detected (tidak terdeteksi adanya pertumbuhan)
Ketahanan bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar dan produk olahannya yang akan dijadikan sebagai bakteri probiotik harus tahan pada kondisi
28 asam dalam saluran pencernaan, salah satunya adalah kondisi di lambung yang dalam keadaan kosong mempunyai pH sangat asam, sekitar 1–2,5. Hasil sekresi lambung yang dikenal dengan getah lambung merupakan cairan jernih berwarna kuning pucat yang mengandung HCL 0,2–0,5% dan asam lambung dengan pH 3,2 disekresikan di dalam lambung (Mitsuoka, 1990). Menurut Jacobsen et al. (1999), dalam saluran pencernaan manusia, pH asam lambung yaitu sekitar 2,5, sedangkan pengujian ketahanan BAL pada pH 7,2 diujikan karena garam empedu disekresikan di dalam duodenum yang mempunyai kondisi pH netral sekitar 6,9-7,2.
Hasil pada tabel 3, menunjukkan S. thermophilus S-01 pada pH 2 dan 2,5
tidak dapat bertahan, ini dibuktikan dengan tidak adanya pertumbuhan yang terdeteksi setelah akhir perlakuan. S. thermophilus pada pH 3,2 sudah mulai
bertahan, walaupun masih mengalami penurunan populasi sekitar 2,03 log10 cfu/ml,
sedangkan pada pH 7,2 S. thermophilus dapat bertahan, bahkan mengalami kenaikan
populasi sekitar 0,42 log10 cfu/ml. Hasil analisis ragam menunjukkan S.thermophilus
S-01 pada kondisi pH 3,2 sebelum dan sesudah inkubasi berpengaruh nyata (P<0,05). Walaupun S. thermophilus S-01 mengalami penurunan, namun populasi akhir setelah diinkubasi 3 jam masih pada populasi 6,09 log10 cfu/ml. Jika dibandingkan dengan
kondisi pH 2 dan 2,5, maka S. thermophilus S-01 lebih tahan pada kondisi 3,2 dan 7,2. Pada kondisi pH 3,2, S. thermophilus S-01 mampu mempertahankan pH intraseluler sitoplasma, sehingga pH sitoplasma lebih basa dibanding dengan pH ekstraseluler. Membran sel S. thermophilus S-01 juga lebih tahan terhadap kebocoran pada pH 3,2. Ketiga BAL yang lain mampu bertahan dalam semua kondisi pH, terutama B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01, bahkan mengalami
kenaikan populasi. L. bulgaricus S-01 juga mampu bertahan dalam semua kondisi
pH, walaupun mengalami penurunan populasi, mulai dari 0,18–0,8 log10 cfu/ml.
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa kondisi pH 7,2 berpengaruh nyata pada populasi awal dan akhir setelah inkubasi 3 jam bakteri asam laktat B. longum Y-01
dan L. acidophilus Y-01.
Tiap galur mempunyai ketahanan yang berbeda terhadap asam atau pH rendah, contohnya Lactobacillus lebih toleran terhadap pH rendah dibandingkan Lactococci dan Streptococci (Farida, 2006). Bifidobacteria juga dapat bertahan
29 tinggi dari Bifidobacteria sangat penting, karena mikroorganisme ini digunakan dalam formulasi atau ditambahkan dalam makanan dan harus tahan terhadap keasaman, terutama selama transit dalam lambung.
Toleransi terhadap asam pada bakteri asam laktat tergantung pada pH H+- ATPase dan komposisi membran sitoplasma, yang sangat dipengaruhi oleh jenis bakteri, media pertumbuhan dan kondisi inkubasi (Oh et al., 2000). Saat memasuki
saluran pencernaan dengan kondisi pH sangat asam, bakteri dapat mengalami stress. Stress yang dialami adalah karena pH intraseluler bakteri berbeda dengan pH ekstraseluler, sehingga bakteri asam laktat harus melakukan metabolisme agar dapat menyesuaikan kondisi intraseluler dengan ekstraselulernya. Menurut Siegumfeldt et al. (2000), pada bakteri asam laktat terjadi perubahan dinamis pH intraseluler seiring
dengan terjadinya penurunan pH ekstraseluler sehingga tidak terjadi gradien proton yang besar. Toleransi bakteri asam laktat yang cukup tinggi terhadap asam disebabkan oleh kemampuannya untuk mempertahankan pH sitoplasma lebih basa daripada pH ekstraseluler. Bila sel bakteri terpapar pada kondisi yang sangat asam, maka membran sel dapat mengalami kerusakan dan berakibat hilangnya komponen intraseluler. Biasanya kerusakan ini menyebabkan kematian pada sel. Bakteri yang toleran terhadap asam, membran selnya lebih tahan terhadap kebocoran akibat pH rendah dibandingkan dengan yang tidak tahan.
Secara in vitro ketahanan terhadap pH rendah tergantung pada tipe buffer dan tipe makanan yang digunakan. Menurut Hardiningsih et al. (2005), ketahanan fisiologis dari setiap bakteri berbeda-beda. Perbedaan ketahanan membran sel bakteri terhadap kerusakan akibat terjadinya penurunan pH ekstraseluler menyebabkan keragaman ketahanan sel pada pH rendah.
Jacobsen et al. (1999) melakukan pengujian ketahanan 47 isolat bakteri asam laktat dari berbagai sumber pada pH 2,5. Sebanyak 47 isolat tersebut hanya 29 isolat yang mampu bertahan pada pH 2,5 dan tidak ada satupun yang mampu tumbuh setelah inkubasi empat jam. Kondisi pH 2,5 bagi beberapa bakteri asam laktat memang sangat asam, sehingga banyak yang tidak dapat mempertahankan kondisi basa intraseluler dan terjadi kerusakan pada membran sel bakteri. Berdasarkan hasil ini, S. thermophilus S-01 dan L. bulgaricus S-01 diduga mengalami kerusakan
30 BAL mempunyai dinding sel yang tebal dengan lipid yang tipis sekitar 1-4%. Menurut (Fardiaz, 1989), bakteri Gram positif, 90% dari dinding selnya terdiri dari lapisan peptidoglikan, sedangkan lapisan tipis lainnya adalah asam teikoat. Asam teikoat mengandung unit-unit gliserol atau ribitol yang terikat satu sama lain oleh ester fosfat dan biasanya mengandung gula lain dan D-alanin. Peptidoglikan ini terdiri dari turunan gula yaitu N-asetilglukosamin dan N-asetilmuramat serta beberapa asam amino yaitu L-alanin, D-alanin, asam D-glutamat dan asam diaminopimelat (ADP). Peptidoglikan yang tebal dan ikatan rantai asam teikoat inilah yang dapat mempertahankan bentuk dinding sel dari kondisi asam ekstraseluler. Kondisi ektraseluler yang asam memang dapat menyebabkan dinding sel BAL menjadi lisis. Namun, dinding sel BAL ini dapat mempertahankan bentuknya, sehingga bagian dalam sel masih dapat terlindungi. Membran sel pun dapat mengangkut nutrien dan garam yang dibutuhkan untuk melakukan metabolisme dan tidak permeabel terhadap senyawa yang tidak dibutuhkan. Lapisan lipid yang tipis membuat pori-pori dinding menjadi mengecil, sehingga permeabilitas sel berkurang dan tidak terjadi ekstraksi komponen intraseluler. Asam dapat merusak lapisan lipid yang ada pada membran sel, namun lapisan lipid ini mengandung protein khusus. Beberapa dari protein membran merupakan enzim, sementara yang lainnya dapat mengikat nutrien dan mengangkutnya ke dalam sel.
Menurut Chou dan Weimer (1999), strain L. acidophilus pada pH sekitar 3,5 hanya tahan jangka pendek, terlihat dari pertumbuhannya yang sedikit melambat setelah inkubasi 90 menit. Tidak seperti bakteri netrofilik (yang dapat tumbuh pada kondisi pH mendekati netral) yang menjaga pH intraselulernya mendekati netral, pada bakteri asam laktat terjadi perubahan dinamis pH intraseluler seiring dengan perubahan pH lingkungannya (Siegumfeldt et al., 2000). Ini membuktikan, semua bakteri yang diisolasi memang mempunyai karakteristik yang berbeda dan metabolisme yang berbeda, bakteri-bakteri ini bersifat strain dependent.
Pertumbuhan optimal L. bulgaricus adalah pada kondisi asam, pH sekitar
5,2–5,8 dan akan terhenti pada pH sekitar 3,8. S. thermophilus S-01 tumbuh optimal
pada pH sekitar 6,5 dan akan terhenti pada pH 4,2–4,4. Pada pembuatan yogurt digunakan campuran S. thermophilus dan L. bulgaricus. S. thermophilus akan
31 folat, asam laktat piruvat dan asam format untuk menstimulir pertumbuhan
L.bulgaricus, sehingga proses fermentasi lebih cepat. Pada akhir proses fermentasi,
pertumbuhan S. thermophilus mulai berkurang seiring dengan meningkatnya L.bulgaricus (Surono, 2004; Silva et al., 2005).
Oh et al. (2000) menyatakan bahwa dalam proses fermentasi yogurt, terbukti
L. bulgaricus lebih optimal tumbuh pada kondisi asam, sedangkan S. thermophilus
lebih optimal tumbuh pada pH mendekati netral (6,5). B. longum dan L. acidophilus
adalah bakteri yang sering digunakan sebagai bakteri probiotik dalam produk susu, karena pada dasarnya kedua spesies ini dominan dalam saluran pencernaan manusia. Bahkan, kedua spesies ini terdapat secara alami dalam usus manusia.
Perubahan populasi BAL indigenous susu sapi segar selama pengamatan
180 menit pada kondisi pH berbeda dapat dilihat pada Gambar 6. S. thermophilus S-
01 pada kondisi 2, 2,5 dan 3,2 mengalami penurunan populasi setiap pengamatan, terutama setelah 60 menit inkubasi, terjadi penurunan populasi hingga akhir perlakuan. Sedangkan pada kondisi pH 7,2, terlihat grafik yang belum stabil pada 60 menit pertama, namun setelahnya grafik terlihat statis, yang menunjukkan ketahanan bakteri yang baik. L. bulgaricus S-01 pada kondisi pH rendah 2 dan 2,5 menunjukkan pergerakan yang tidak stabil, sedangkan pada kondisi pH 3,2 dan 7,2, grafik terlihat statis, yang menunjukkan L. bulgaricus S-01 lebih mampu bertahan pada pH 3,2 dan 7,2.
Perubahan populasi S. thermophilus S-01 pada pH 3,2 lebih tahan dibandingkan pada pH 2, 2,5 dan 7,2. Walaupun mengalami penurunan populasi, namun S. thermophilus S-01 masih dapat bertahan pada kisaran populasi 7-8 log10
cfu/ml. Sedangkan L. bulgaricus S-01 relatif stabil, bahkan mengalami peningkatan
populasi pada 60 menit pertama pada semua kondisi pH dan mulai mengalami penurunan populasi setelah 90 menit. BAL yang diseleksi untuk menjadi bakteri probiotik, setidaknya harus mampu bertahan pada kondisi pH rendah sekitar 90 menit.
B. longum Y-01 pada kondisi pH 2, menunjukkan grafik yang statis,
sedangkan pada pH 2,5, 3,2 dan 7,2 terlihat adanya kenaikan populasi setelah ±2 jam inkubasi. Perubahan populasi BAL selama inkubasi 180 menit dapat dilihat pada Gambar 5.
32
Keterangan : pH 2.0 ( ), pH 2.5 ( ), pH 3.2 ( ), pH 7.2 ( )
Gambar 5. Perubahan Populasi Kultur Starter BAL a). S. thermophilus S-01, b). L.bulgaricus S-01, c). B. longum Y-01, d). L. acidophilus Y-01 pada pH
33 Grafik L. acidophilus Y-01 pada pH 2, 2,5 dan 3,2 pada 90 menit pertama terlihat masih labil, namun setelah inkubasi 90 menit, grafik menunjukkan kenaikan populasi, sedangkan pada kondisi pH 7,2 L. acidophilus Y-01 lebih mampu bertahan
sehingga grafik menunjukkan kenaikan yang konsisten.
Waktu normal yang diperlukan makanan mulai dari masuk hingga keluar lambung adalah sekitar 90 menit, sedangkan waktu yang digunakan dalam penelitian ini adalah 180 menit, atau 2 kali dari waktu minimal yang diperlukan untuk menyeleksi BAL menjadi bakteri probiotik. Tujuannya adalah untuk memastikan BAL benar-benar mampu bertahan pada pH 2, 2,5, 3,2 dan 7,2.
Ketahanan Kultur Starter BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Garam Empedu
Bakteri asam laktat sebagai kultur probiotik harus mampu melewatikondisi saluran pencernaan yang menekan, agar dapat bertahan dan tumbuh. Salah satunya adalah pada saat bakteri memasuki bagian atau usus di mana empedu disekresikan di dalam usus. Populasi BAL indigenous susu sapi segar pada garam empedu sebelum dan sesudah inkubasi selama 24 jam disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Jumlah Populasi BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Garam Empedu
No Kultur bakteri Populasi BAL (Log CFU/ml)
P0 jam P24 jam (P24 - P0)*
1. S. thermophilus S-01 7,91 ± 0,19 ND -7,91 ± 0,19
2. L. bulgaricus S-01 8,08 a ± 0,10 5,84 b ± 0,054 -2,25 ± 1,50
3. B. longum Y-01 8,41 b ± 0,03 8,51 a ± 0,01 0,10 ± 0,07
4. L. acidophilus Y-01 7,54 b ± 0,01 7,78 a ± 0,07 0,24 ± 0,17
Keterangan : * apabila hasilnya (-) menunjukan adanya kematian;
** huruf superskript (a dan b) yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05)
ND = not detected (tidak terdeteksi adanya pertumbuhan)
Perlakuan secara in vitro, dimana media dikondisikan seperti di dalam saluran usus, yaitu dengan menambahkan oxgall sebanyak 0,3%. Penambahan 0,3% oxgall
merupakan konsentrasi kritis dan cukup tinggi untuk menseleksi galur resisten. Peningkatan konsentrasi garam empedu dapat menyebabkan penurunan jumlah koloni bakteri asam laktat yang lebih besar (Farida, 2006).
34 Populasi sebelum perlakuan dan setelah perlakuan pada setiap bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar sangat berbeda (P<0,01). Keragaman toleransi
bakteri asam laktat terhadap garam empedu tidak berhubungan dengan perbedaan spesies, tetapi tergantung dari masing-masing galur atau bersifat strain dependent.
Galur yang berbeda mempunyai mekanisme yang berbeda terhadap garam empedu. Galur bakteri asam laktat yang sama serta diisolasi dari sumber yang sama pun, mempunyai keragaman pada toleransi terhadap garam empedu (Chou dan Weimer, 1999). Menurut Sanders (2000), Lactobacillus dan Bifidobacterium secara umum
lebih resisten terhadap garam empedu dibandingkan dengan genus Streptococcus dan
genus lainnya, terutama bakteri asam laktat yang digunakan sebagai kultur starter yogurt. Toleransi terhadap garam empedu ini disebabkan oleh peranan polisakarida sebagai salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri Gram positif. Toleransi terhadap garam empedu yang rendah pada Streptococcus dibuktikan dengan hasil
populasi akhir S. thermophilus S-01 setelah mendapat perlakuan garam empedu, bakteri tidak tahan garam empedu sehingga pada saat akhir perlakuan, bakteri tersebut mati dan tidak terhitung populasinya.
Farida (2006) menambahkan, sel yang mati disebabkan karena peningkatan aktivitas enzim β-galactosidase terhadap garam empedu, enzim β-galactosidase pada bakteri asam laktat digunakan untuk menghasilkan asam laktat dari laktosa (Surono, 2004). Peningkatan aktivitas enzim ini adalah upaya bakteri untuk melakukan adaptasi terhadap kondisi ekstraseluler, sehingga kecepatan difusi molekul nutrien pun mengalami peningkatan dan membatasi sel untuk mengontrol metabolismenya Peningkatan permeabilitas sel ini mengakibatkan materi intraseluler, seperti sitoplasma dan ribosom terekstraksi dan sel mengalami lisis. Padahal sitoplasma berfungsi sebagai tempat berlangsungnya hanpir semua reaksi enzimatis dari metabolisme sel. Dalam sitoplasma, sel menggunakan energi kimia untuk membangun dan mempertahankan strukturnya serta melakukan pergerakan sel. Ribosom berfungsi mensintesa protein. Jika materi intraseluler ini, maka bakteri tidak bisa melakukan metabolisme, sehingga tidak dapat tumbuh dan bahkan mati (Lehninger, 2004).
Perubahan populasi BAL setiap 60 menit selama pengamatan 24 jam dapat dilihat pada Gambar 6.
35
Keterangan : kontrol ( ), garam empedu ( )
Gambar 6. Perubahan Populasi Kultur Starter a). S. thermophilus S-01, b).
L.bulgaricus S-01, c). B. longum Y-01, d). L. acidophilus Y-01 pada
36 Grafik di atas merupakan populasi BAL yang dihitung berdasarkan persamaan hubungan antara nilai absorbansi dan hasil pemupukan. Nilai optical density yang didapat merupakan populasi bakteri hidup dan mati yang ditangkap oleh
spektrum cahaya dalam spektrofotometer, namun dilakukan juga pemupukan, yang hasilnya merupakan populasi bakteri hidup
Pertumbuhan S. thermophilus S-01 yang diberi perlakuan garam empedu dan
kontrol dapat dilihat pada grafik pertama. Terlihat pada waktu pengamatan awal, populasi S. thermophilus S-01 masih dapat menyamai kontrol dan terlihat statis.
Terlihat dari kisaran populasi yang walaupun naik dan turun, namun masih pada kisaran 107-108 cfu/ml.
Populasi L. bulgaricus S-01 dengan penambahan garam empedu dapat
dikatakan stabil, seiring dengan pertumbuhan L. bulgaricus S-01 kontrol. Populasi L. bulgaricus S-01 ditambah garam empedu mulai mengalami kenaikan setelah 15
jam inkubasi. Dapat dikatakan, L. bulgaricus S-01 sudah mulai beradaptasi dengan kondisi garam empedu. Dari grafik tersebut menunjukkan bahwa L. bulgaricus S-01 dapat bertahan pada kondisi garam empedu, walaupun mengalami penurunan populasi.
Pertumbuhan bakteri B. longum Y-01 pada perlakuan garam empedu dan yang tidak ditambahkan garam empedu (kontrol). Populasi yang didapat antara kontrol dan perlakuan menunjukkan hasil yang tidak jauh berbeda. Terlihat pada kurva, bahwa populasi B. longum Y-01 pada garam empedu dapat bertahan, bahkan hampir menyamai populasi kontrol. Ini menunjukkan, bahwa B. longum Y-01 dapat