PENCERNAAN in vitro
TINJAUAN PUSTAKA Yogurt dan Kultur Starter Yogurt
Yogurt berdasarkan SNI 01-2981-1992 adalah produk yang diperoleh dari susu yang telah dipasteurisasi dan difermentasi dengan bakteri tertentu sehingga diperoleh keasaman, bau dan rasa khas, dengan atau tanpa penambahan bahan lain yang diizinkan (BSN, 1992). Yogurt adalah susu asam yang dihasilkan dari fermentasi susu oleh campuran bakteri asam laktat termofilik yaitu Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus dan Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Kedua bakteri ini bersama-sama membentuk rasa asam, kekentalan, memperbanyak asam laktat dan intensitas flavor (Rahman et al., 1992). Bakteri asam laktat sering
digunakan untuk menghasilkan produk akhir dengan karakteristik tertentu. Yogurt adalah salah satu pangan yang mengandung probiotik, dengan syarat produk akhir yogurt harus mengandung bakteri asam laktat ≥ 108 organisme/g (Adolfsson et al.,
2004).
Kultur starter merupakan bagian yang penting dalam pembuatan yogurt. Aspek yang harus diperhatikan untuk suatu mikroorganisme digunakan sebagai kultur yaitu bebas dari kontaminasi, pertumbuhan yang cepat, menghasilkan flavor
yang khas, tekstur dan bentuk yang bagus, tahan terhadap bakteriofage dan juga tahan terhadap antibiotik. Kultur starter yogurt terdiri atas bakteri asam laktat yang berperan dalam pengasaman dan fermentasi susu. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus dan Streptococcus salivarius ssp. thermophilus merupakan bakteri asam
laktat homofermentatif yang terutama memproduksi asam laktat. Perbandingan yang baik antara bakteri ini untuk memproduksi yogurt adalah 1:1 (Rahman et al., 1992).
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus dan Streptococcus salivarius ssp. thermophilus biasa digunakan dalam produk fermentasi. Kedua bakteri asam laktat
ini populasinya dalam saluran pencernaan manusia dan hewan masih sangat rendah jika dibandingkan dengan bakteri probiotik lainnya (Campo et al., 2005).
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (L. bulgaricus). L. bulgaricus adalah bakteri Gram positif, berbentuk batang panjang dengan ukuran 0,5-0,8 x 2-9 µm, tidak berspora, katalase negatif, bersifat termodurik, tidak tumbuh pada 10oC, tumbuh optimal pada 50-55oC dan pH 5,2-5,8 (Rahman et al., 1992; Tamime dan
4 Robinson, 2008). Kultur starter L. bulgaricus sering digunakan dalam kombinasi dengan starter bakteri lain untuk memproduksi yogurt. L. bulgaricus bersifat
homofermentatif, memecah gula laktosa terutama menjadi asam laktatyang termasuk asam laktat D(-). L. bulgaricus akan menyediakan peptida dan asam amino yang
menstimulir pertumbuhan S. thermophilus, mengingat bakteri ini kemampuan proteolitiknya lebih rendah bila dibandingkan dengan L. bulgaricus (Walstra et al.,
2006; Rahman et al., 1992).
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (S. thermophilus). S. thermophilus
dibedakan dari Genus Streptococcus lainnya berdasarkan pertumbuhannya pada suhu
45oC, tidak tumbuh pada 10oC, berbentuk kokus dengan diameter <1µm, dengan bentuk berpasangan atau membentuk rantai pendek dan panjang, termasuk kelompok Gram positif, tidak berspora dan dengan pH optimal untuk pertumbuhannya adalah 6,5. S. thermophilus tidak mati dengan pemanasan suhu rendah karena bersifat
termofilik. S. thermophilus tidak membutuhkan oksigen, meskipun tidak mati dengan adanya oksigen dan bersifat homofermentatif (Tamime dan Robinson, 2008; Walstra et al., 2006).
S. thermophilus menghasilkan asam folat yang dibutuhkan oleh L. bulgaricus,
yang sebagai imbalannya menghasilkan asam amino dan peptida yang dibutuhkan oleh S. thermophilus. S. thermophilus dan L. bulgaricus pada yogurt akan saling mendukung dalam menghasilkan asam laktat dan aroma. S. thermophilus menghasil- kan asam laktat, asam piruvat, asam format serta asam folat yang menstimulir pertumbuhan L. bulgaricus (Surono, 2004; Silva et al., 2005).
Bakteri Probiotik
Bakteri probiotik merupakan mikroorganisme hidup yang dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan keseimbangan populasi mikroba di dalam usus. Manfaat pro- biotik biasa dikaitkan dengan produk susu, yang secara nyata memberikan efek positif untuk kesehatan manusia, terutama dalam saluran pencernaan (Nowroozi et al., 2004). Kelompok Lactobacilli seperti L. bulgaricus, L. acidophilus dan
kelompok Bifidobacterium seperti B. bifidum dan B. longum merupakan strain yang
5 Naidu dan Clemens (2000) menambahkan bahwa suatu bakteri dapat dikatakan sebagai bakteri probiotik apabila memenuhi beberapa kriteria, yaitu 1) bersifat nonpatogenik dan mewakili mikrobiota normal usus dari inang tertentu serta masih aktif pada kondisi asam lambung dan konsentrasi garam empedu yang tinggi dalam usus halus, 2) mampu tumbuh dan melakukan metabolisme dengan cepat dan terdapat dalam jumlah yang banyak dalam usus, 3) dapat mengkolonisasi beberapa bagian dari saluran usus untuk sementara, 4) dapat memproduksi asam-asam organik secara efisien dan memiliki sifat antimikroba terhadap bakteri merugikan serta 5) mudah diproduksi, mampu tumbuh dalam sistem produksi skala besar dan hidup selama kondisi penyimpanan. Usus kecil dan usus besar adalah tempat yang paling banyak ditemukan bakteri probiotik, di mana mungkin probiotik juga menemukan lingkungan yang lebih menguntungkan.
Bifidobacterium longum. Beberapa jenis dari genus Bifidobacterium dianggap
probiotik dan digunakan sebagai bahan aktif dalam bahan dasar produk-produk susu fungsional. Mikroorganisme dari genus Bifidobacterium dapat mengkolonisasi usus dan merupakan komponen penting dari mikrobiota usus manusia, yang terdapat dalam konsentrasi 109-1010 sel per gram tinja. Bakteri ini harus mampu mengatasi hambatan biologis yang mencakup asam di lambung dan empedu dalam usus untuk mencapai kolonisasi ini (Madiedo et al., 2005).
Genus Bifidobacterium yang banyak digunakan sebagai probiotik adalah B. longum, B. animalis, B. adolescentes, B. infantis, B. thermophilum dan B. bifidum.
Bakteri B. longum memiliki bentuk batang, anaerob strict, Gram positif, tidak berspora, pertumbuhan optimal pada suhu 36-37oC dan menghasilkan asam laktat dan asam asetat (Naidu dan Clemens, 2000).
Lactobacillus acidophilus. Tamime dan Robinson (2008) mengemukakan bahwa L. acidophilus merupakan bakteri berbentuk batang, termasuk famili Lactobacillaceae
dan genus Lactobacillus. Bakteri ini tergolong bakteri Gram positif dan tidak
membentuk spora. L. acidophilus merupakan Lactobacili yang bersifat obligat
homofermentatif dan non motil.
Suhu optimum pertumbuhan L. acidophilus adalah 35-45oC, tidak tumbuh
6 6,0 serta memproduksi asam laktat sebesar 0,3%–1,9%. L. acidophilus mempunyai kemampuan koagregasi yang sangat baik setelah diinkubasi selama 25 jam. Koagregasi berperanan penting dalam usaha mencari bakteri probiotik yang baik karena dapat mencegah infeksi bakteri patogen (Natalia dan Priadi, 2006).
Waktu transit makanan melalui perut manusia adalah sekitar 90 menit. Menurut Chou dan Weimer (1999), beberapa strain L. acidophilus pada pH 3,5 hanya
dapat bertahan dalam jangka waktu yang pendek, hal ini dapat dilihat dari pertumbuhannya yang sedikit setelah diinkubasi selama 90 menit. L. acidophilus
menunjukkan kemampuannya untuk tumbuh denganpesat dalam media MRSB pada pH 3,5 yang mengandung 0,2% garam empedu. Isolat Lactobacillus spp. yang
diisolasi dari berbagai pangan fermentasi asalIndonesia, dinilai dapat bertahan hidup dan resisten terhadap pH rendah (Hardiningsih et al., 2005).
Bakteri Asam Laktat
Mikroba yang paling banyak digunakan dalam fermentasi susu adalah bakteri asam laktat. Menurut Surono (2004), bakteri asam laktat adalah bakteri Gram positif, bersifat katalase negatif, tidak mempunyai cytochrome, yang berbentuk batang atau kokus, tidak membentuk spora dan ada yang berbentuk rantai tunggal. Secara umum, bakteri asam laktat mempunyai toleransi terhadap konsentrasi asam tinggi. Bakteri asam laktat memerlukan nutrisi yang sangat kompleks, karena itu umumnya memerlukan habitat yang kaya akan nutrisi seperti susu dan daging.
Bakteri asam laktat yang bersifat sebagai probiotik pada pencernaan manusia, merupakan mikroflora normal usus, terdiri atas Bifidobacteria dan L. acidophilus. Genera Bifidobacteria dan Lactobacillus merupakan konsumsi probiotik yang utama
bagi manusia yang kebanyakan dikonsumsi dalam bentuk makanan berbasis susu. Peningkatan jumlah bakteri asam laktat di usus dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen, mengurangi infeksi dan efek antikarsinogenik. Bakteri asam laktat dengan demikian, mempunyai kemampuan untuk bertahan hidup dalam saluran pencernaan. Ketahanan bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan bervariasi dengan pH lambung. Kemampuan bakteri asam laktat bersaing dengan patogen untuk melakukan adesi ke dinding usus sangat mungkin dipengaruhi oleh membran fluiditas (Adolfsson et al., 2004). Diantara genus Lactobacillus, L. acidophilus
7 mempunyai ketahanan hidup yang lebih tinggi terhadap asam lambung daripada kultur bakteri lain, misalnya L. bulgaricus dan S. thermophilus. Meydani dan Ha
(2000) menyatakan, bahwa dari empat spesies Bifidobacterium (B. infantis, B. bifidum, B. adolescentis dan B. longum), B. longum adalah yang paling tahan
terhadap asam lambung.
Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Asam
Ketahanan terhadap kondisi asam merupakan syarat penting bakteri asam laktat untuk dapat dikelompokkan sebagai bakteri probiotik. Jika isolat bakteri asam laktat masuk ke dalam saluran pencernaan, maka harus mampu bertahan dalam lambung yang mempunyai pH sekitar 2,5 (Jacobsen et al., 1999), bahkan bila
lambung dalam keadaan kosong akan mempunyai pH sekitar 1,5–2. Menurut Mitsuoka (1990), nilai pH lambung dalam keadaan normal berkisar 3,2-3,5.
Chou dan Weimer (1999) menyatakan, bahwa waktu yang diperlukan mulai dari bakteri masuk sampai keluar lambung adalah sekitar 90 menit. Jadi bakteri asam laktat yang diseleksi untuk digunakan sebagai probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan asam lambung selama sedikitnya 90 menit. Toleransi yang tinggi dari bakteri asam laktat terhadap asam disebabkan oleh kemampuannya untuk mempertahankan pH sitoplasma dalam kondisi lebih basa daripada pH ekstraseluler. Menurut Siegumfeldt et al. (2000), pada bakteri asam laktat terjadi perubahan secara dinamis dari pH intraseluler seiring dengan terjadinya penurunan pH ekstraseluler, sehingga tidak terjadi gradien proton yang besar. Tiap galur bakteri memiliki ketahanan yang berbeda terhadap asam atau pH rendah, sebagai contohnya
Lactobacillus dan Bifidobacteria adalah lebih toleran terhadap pH rendah
dibandingkan Lactococci dan Streptococci (Farida, 2006; Zinedine dan Faid, 2007).
Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu
Toleransi isolat bakteri asam laktat terhadap garam empedu merupakan syarat penting untuk disebut sebagai probiotik. Bakteri asam laktat yang dapat bertahan dan tumbuh pada saluran pencernaan harus mampu melewati bagian atas saluran usus yang berisi cairan empedu yang disekresikan ke dalam usus. Asam empedu disintesa dalam hati dari kolesterol, menghasilkan senyawa yang disebut asam empedu primer. Asam empedu utama ini berkonjugasi dengan gliserin atau taurin
8 dan disekresikan ke dalam kantung empedu sebagai asam empedu terkonjugasi. Asam empedu di dalam kantung empedu dilepaskan ke dalam lumen duodenum dalam bentuk misel dengan asam lemak dan gliserol yang dihasilkan oleh pencernaan lipase pankreatik. Mekanisme saat asam empedu diserap dalam usus kecil dan kolon, lalu disintesa kembali dan disekresikan lagi dikenal sebagai sirkulasi hati (Corzo dan Gilliland, 1999).
Menurut Madiedo et al. (2005), garam empedu yang disintesis dalam hati dari
kolesterol dan disekresikan sebagai konjugat asam amino ke dalam duodenum, yang merupakan tempat memfasilitasi penyerapan lemak. Senyawa empedu bersifat racun untuk sel-sel mikroba, sehingga mikrobiota gastrointestinal asli harus telah mengembangkan strategi untuk mempertahankan diri terhadap aksi beracun dari empedu.
Seperti halnya ketahanan terhadap asam, menurut Jacobsen et al. (1990),
semua mikroba yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang ditambah 0,3% oxgall, dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu. Konsentrasi garam empedu sebesar 0,3% merupakan konsentrasi yang kritikal, serta merupakan nilai yang cukup tinggi untuk melakukan seleksi terhadap isolat yang resisten terhadap garam empedu. Ray (2004) dan Drouault et al. (1999) melaporkan, bahwa jumlah bakteri asam laktat yang terdapat pada jejunum lebih rendah dibanding
ileum, sekum dan kolon. Hal ini disebabkan konsentrasi garam empedu pada bagian
jejunum paling tinggi daripada ileum, karena lokasinya paling dekat bila garam empedu masuk ke dalam saluran usus.
Antibiotik
Antibiotik adalah salah satu jenis senyawa antibakteri, baik alami maupun sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Setiap antibiotik sangat beragam efektivitasnya dalam melawan berbagai jenis bakteri. Ada antibio- tik yang mempunyai sasaran hanya bakteri Gram negatif atau Gram positif, namun ada pula yang spektrumnya lebih luas. Antibiotika dapat digolongkan berdasarkan sasaran kerja senyawa tersebut dan susunan kimiawinya. Pelczar dan Chan (2008)
9 mengemukakan antibiotik adalah produk metabolik yang dihasilkan suatu organisme tertentu, yang dalam jumlah kecil dapat merusak atau menghambat organisme lain.
Kloramfenikol. Kloramfenikol adalah antibiotik yang mempunyai aktivitas bakteriostatik dan pada dosis tinggi bersifat bakterisidal. Aktivitas antibakterinya bekerja dengan cara menghambat sintesa protein dengan jalan mengikat ribosom subunit, yang merupakan langkah penting dalam pembentukan ikatan peptida (Pelczar dan Chan, 2008). Kloramfenikol adalah suatu antibiotik berspektrum luas dengan cara kerja bakteriostatik (Schunack et al., 1990). Aktivitas kloramfenikol
sangat nyata terhadap Salmonella (tergolong tifus dan paratipus) dan mempunyai
difusi ringan yang baik. Kloramfenikol efektif terhadap bakteri aerob Gram positif, termasuk Streptococcus pneumonia dan beberapa bakteri aerob Gram negatif,
termasuk Haemophilus influenzae, Neisseria meningitides, Salmonella, Proteus mirabilis, Pseudomonas mallei, Ps. cepacia, Vibrio cholera, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella dan Shigella.
Amoksisilin. Amoksisilin adalah antibiotik termasuk ke dalam golongan penisilin, dengan aktivitas membunuh bakteri secara langsung, tetapi dengan cara mencegah bakteri membentuk semacam lapisan yang melekat di sekujur tubuhnya. Lapisan ini mempunyai fungsi yang sangat vital bagi bakteri, yaitu untuk melindungi bakteri dari perubahan lingkungan dan menjaga agar tubuh bakteri tidak tercerai-berai. Amoksisilin sangat efektif untuk beberapa bakteri seperti H. influenza, N. gonorrhea, E.coli, Pneumococci, Streptococci dan beberapa strain dari Staphylococci (Schunack
et al., 1990). Pada penelitian didapatkan bahwa amoksisilin dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme Gram positif dan Gram negatif. Karena itu, amoksisilin biasa digunakan dalam pengobatan infeksi yang diduga disebabkan karena bakteri (Kline, 2009).
Antimikroba
Zat antimikroba adalah senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Menurut Fardiaz (1989), zat antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan
10 bakteri), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang) dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri).
Sifat antimikroba dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroba lain. Mekanisme merusak dinding sel dengan menghambat proses pembentukannya atau menyebabkan lisis pada dinding sel yang sudah terbentuk dan perubahan permeabilitas membran sitoplasma akan menyebabkan terhambatnya pertumbuhan atau matinya sel. Pada konsentrasi rendah, sebaiknya aktivitas mikroba harus dapat mematikan berbagai macam mikroba (Pelczar dan Chan, 2008).
Komponen antimikroba dari bakteri asam laktat antara lain adalah asam organik, hidrogen peroksida, karbondioksida, diasetil, reuterin dan bakteriosin. Asam organik yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat menghasilkan akumulasi asam pada produk akhir yang menyebabkan pH menjadi turun, yang berakibat pada penghambatan yang luas terhadap bakteri baik Gram positif maupun Gram negatif. Nilai pH yang rendah, konstanta disosiasi dan konsentrasi asam menentukan aktivitas penghambatan dari asam yang dihasilkan. Asam-asam lipofilik seperti asam laktat dan asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba dan pada pH intraseluler yang lebih tinggi, berdisosiasi menghasilkan ion-ion hidrogen dan mengganggu fungsi metabolik essensial seperti translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif, dengan demikian mereduksi pH intraseluler (Naidu dan Clemens, 2000). Hidrogen peroksida yang diproduksi oleh bakteri asam laktat dapat merusak susunan membran lipida mikroba, sehingga meningkatkan permeabilitas membran, kemudian akan merusak susunan asam nukleat dan protein sel. Bakteri asam laktat mampu memproduksi hidrogen peroksida melalui transport aktif dengan bantuan enzim flavin (Naidu dan Clemens, 2000). Senyawa antimikroba lain yang dihasilkan bakteri asam laktat adalah bakteriosin. Bakteriosin merupakan produk metabolit sekunder dari bakteri asam laktat. Bakteriosin mempunyai cara kerja yang sama seperti antibiotik, yaitu mampu menghambat pertumbuhan beberapa bakteri tertentu. Bakteriosin dalam melakukan aktivitas antimikrobanya akan menyerang sitoplasma.
11
Bakteri Patogen
Bakteri patogen adalah bakteri yang menimbulkan kerugian pada manusia. Cara penularan penyakit pada manusia, yaitu (1) intoksikasi, makanan mengandung toksin yang dihasilkan bakteri yang tumbuh pada makanan tersebut dan (2) infeksi, masuknya bakteri ke dalam tubuh melalui makanan yang terkontaminasi. Tiga bakteri patogen yang sering ditemukan dalam pangan dan ada secara alami dalam tubuh manusia adalah E. coli, S. Typhimuriumdan S. aureus (Todar, 2008).
Escherichia coli. Bakteri ini tumbuh pada kondisi aerobik ataupun anaerobik,
berbentuk batang, berukuran lebar 1,1-1,5 µm dan panjang 2,0-6,0 µm. Bakteri ini terdapat dalam bentuk berpasangan atau tunggal, bersifat motil dengan flagella peritrikal atau non motil. Tumbuh optimum pada pH 7-7,5 dengan pH mínimum 4 dan pH maksimum 8,5. Suhu pertumbuhan adalah 37oC dengan kisaran pertum- buhannya adalah pada suhu 10-40oC (Fardiaz, 1989). E. coli ditemukan di dalam
saluran usus hewan dan manusia, sehingga sering ditemukan dalam feses.
Menurut Todar (2008), terdapat lima kelas (virotipes) E. coli yang menyebabkan diare, yaitu E. enterotoxigenic coli (ETEC), E. enteroinvasive coli
(EIEC), E. enterohemorrhagic coli (EHEC), E. enteropathogenic coli (EPEC) dan E. enteroaggregative coli (EAEC). ETEC menyebabkan diare pada bayi dan beberapa masyarakat di negara-negara berkembang dengan sanitasi lingkungan yang buruk. Penyakit ini timbul akibat mengkonsumsi makanan dan air yang terkontaminasi, sayuran mentah, bahkan dari beberapa jenis keju lunak. EPEC menyebabkan diare, terutama pada anak-anak di negara berkembang. Penyakit ini disebabkan oleh air, daging dan produk daging yang terkontaminasi. EHEC menyebabkan diare berdarah atau kolitis hemorragik. Penyakit ini disebabkan oleh air atau makanan terkontaminasi, misalnya daging sapi, susu mentah, jus apel yang tidak dipasteurisasi dan sayuran mentah.
Staphylococcus aureus. Walstra et al. (2006) menyatakan bahwa S. aureus adalah
bakteri Gram positif berbentuk cocci, katalase positif, ukuran diameter 0,5-1,5 µm
dan berbentuk seperti anggur. Suhu optimum pertumbuhan S. aureus adalah 37oC
dengan kisaran 6-48oC. S. aureus mempunyai pH optimum pertumbuhan 7,0-7,5
12 organik pada medium pertumbuhannya. Bakteri ini mempunyai waktu generasi 27- 30 menit S. aureus dapat memproduksi senyawa beracun enterotoksin dan
menyebabkan gastroenteritis. Pertumbuhan S. aureus dapat dihambat dengan
menurunkan suhu, menurunkan pH dan karena adanya komponen antagonistik dari BAL. Pemanasan juga dapat membunuh S. aureus.
Salmonella enteridis serotipe Typhimurium (S. Typhimurium). Salmonella
termasuk Gram negatif dan bersifat anaerobik fakultatif. S. Typhimurium berbentuk
batang lurus, berukuran 0,7-1,5 x 2-5 µm, tidak membentuk spora, oksidase negatif, katalase positif dan memecah nitrat. Bakteri ini tumbuh pada pH netral 6,6–8,2. Nilai pH media yang lebih besar dari 9,0 atau lebih kecil dari 4,0 akan mengakibatkan kematian bakteri ini. Suhu optimum untuk pertumbuhan adalah 37oC, suhu maksimum 45,6oC. S. Typhimurium menyebabkan gejala gastrointestinal
13
MATERI dan METODE Lokasi dan Waktu
Lokasi penelitianbertempat di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Laboratorium Terpadu Departemen IPTP, Fakultas Peternakan IPB dan Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan IPB. Penelitian dilaksanakan selama tujuh bulan, dimulai bulan Maret sampai September 2010.
Materi
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Streptococcus thermophilus S-01, Lactobacillus bulgaricus S-01, Lactobacillus acidophilus Y-01, Bifidobacterium longum Y-01, S. Typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922
dan S. aureus ATCC 25923 (Koleksi Bagian THT, Fapet IPB). Bahan media pertumbuhan bakteri yang digunakan adalah de’Mann Rogosa Sharpe Broth
(MRSB), Bacteriological Agar (BA), Buffer Pepton Water (BPW), Phosphate Buffered Saline (PBS), Nutrient Broth (NB), NaCl fisiologis, HCl, NaOH, etanol,
kertas saring, bile salt, Mueller Hinton Agar (MHA), antibiotik jenis amoksisilin dan
kloramfenikol, larutan buffer pH 4 dan 7, phenoptalein, kristal violet, iodin, safranin,
minyak imersi, alkohol 70%, kapas dan alumunium foil.
Alat-alat yang digunakan diantaranya adalah flux laminaire (ruang steril),
inkubator, waterbath, evaporator, spektrofotometer, sentrifus, timbangan digital,
autoklaf, oven, tabung eppendorf, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, cawan Petri, pipet volumetrik, mikro pipet, refrigerator, gelas ukur, jarum Öse, cork borer, pemanas Bunsen, panci, sendok pengaduk, kompor, jangka sorong dan pH meter.
Prosedur Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan ini meliputi pemeriksaan kultur bakteri, baik bakteri asam laktat maupun bakteri patogen melalui pewarnaan Gram dan uji katalase untuk mengkonfirmasi keseragaman kultur .
Pewarnaan Gram (Pelczar dan Chan, 2007). Kultur uji sebanyak 0,25 ml disegarkan dalam media MRSB 5 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama
14 24 jam. Kultur segar tersebut kemudian dihomogenkan dengan menggunakan
vortex, lalu sebanyak satu mata jarum Öse kultur segar kemudian dioleskan pada
kaca objek, diratakan, dikeringudarakandan difiksasi panas. Kristal violet diteteskan pada olesan bakteri tersebut, diratakan dan didiamkan satu menit, lalu dibilas dengan aquadestilata dan dikeringudarakan. Olesan contoh tersebut ditetes iodium Gram selama dua menit, dibilas dengan aquadestilata dan dikeringudarakan, kemudian dicuci dengan alkohol 95% dengan cara diteteskan di atas olesan bakteri dan ditunggu selama 5 detik. Preparat kemudian dibilas dengan aquadestilata dan dikeringudarakan. Preparat olesan bakteri ditetes safranin, diratakan dan didiamkan selama 30 detik, lalu dibilas dengan aquadestilata dan dikeringkan. Preparat yang akan diamati dioleskan minyak imersi terlebih dahulu. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan pada perbesaran 10 x 100. Bakteri warna biru yang terlihat termasuk bakteri Gram positif, sedangkan bakteri Gram negatif terlihat berwarna merah.
Uji Katalase. Contoh bakteri asam laktat dan bakteri patogen segar berumur 24 jam, dioleskan pada kaca objek. Olesan bakteri ditetesi dengan H2O2. Jika terbentuk
gelembung udara, maka termasuk katalase positif, sedangkan jika hasil yang didapatkan tidak membentuk gelembung udara maka termasuk katalase negatif.
Penentuan Populasi Bakteri Asam Laktat (Pelczar dan Chan, 2007)
Tahap ini bertujuan untuk menentukan jumlah populasi BAL selama diberikan perlakuan (ketahanan dalam lingkungan pH yang berbeda, keberadaan garam empedu dan adanya antibiotik) yang dihitung dengan pendekatan dua metode yaitu metode pour plate (hitungan cawan) dan metode turbidimetrik dengan
spektrofotometer. Metode pour plate digunakan untuk penentuan populasi BAL
sebelum dan sesudah perlakuan, sedangkan metode turbidimetrik digunakan untuk penentuan perubahan populasi BAL selama perlakuan.
Metode Hitungan Cawan (Modifikasi Hadioetomo, 1993; FDA, 2001)
Metode hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang
15 terkandung dalam sampel. Pemupukan diawali dengan pengenceran biakan. Sebanyak 1 ml contoh dari biakan diencerkan ke dalam 9 ml larutan pengencer. Pengenceran selanjutnya dilakukan hingga P-1, P-2, dst. Sebanyak 1ml contoh dari