Hasil Amplifikasi Gen Stilbena Sintase dengan Primer Gateway
Langkah awal yang dilakukan dalam konstruksi gen STS pada vektor ekspresi adalah mendesain primer Gateway yang spesifik. Primer tersebut dirancang berdasarkan sekuen gen STS yang telah diperoleh pada penelitian sebelumnya. Primer yang digunakan, yaitu Gateway STS-Forward dan Gateway STS-Reverse, dirancang khusus untuk metode Gateway (Lampiran 3). Rancangan tersebut adalah empat basa nukleotida guanin (GGGG), diikuti situs attB (pada ujung Forwarddan Reverse), kemudian ditambahkan 18-25 urutan basa nukleotida spesifik gen STS (Invitrogen 2003). Situs attB disebut sebagai tempat pengikatan lambda (lambda attachment site), yaitu tempat integrasi DNA lambda ke dalam kromosom E. coli(Yuwono 2005).
Amplifikasi gen STS dengan proses PCR dilakukan untuk menggandakan gen tersebut secara in vitro. Hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi 1% untuk mengetahui apakah gen tersebut berhasil teramplifikasi. Hasil elektroforesis menunjukkan pita berukuran sekitar 1500 pb (Gambar 5). Berdasarkan ukuran pita yang dihasilkan dan dengan membandingkan tingkat homologi ukuran pita dengan menggunakan situs NCBI, gen tersebut merupakan gen STS (Lampiran 7). Salah satu hasil perbandingannya adalah dengan gen STS dari tanaman Vitis vinifera kultivar Carignane yang memiliki ukuran 1535 pb (Xu et al. 2011). Hasil ini juga memperkuat simpulan Lilis (2009) yang menyatakan ukuran gen STS sebesar 1500 pb. Gen STS yang telah teramplifikasi selanjutnya diekstraksi dan dimurnikan.
M a
Gambar 5 Elektroforegram ampl STS dengan primer (M) marker 1 Kb Plu
Ladder, (a) gen STS berukura 1500 pb.
Hasil Ekstraksi dan Purifikasi Gel Agarosa (Elusi Gel)
Ekstraksi dan purifikasi menggunakan kit PureLink Extractiondari Invitrogen. Gel mengandung hasil elektrofor sebelumnya diletakkan di atas UV untuk melihat pita yang Pita DNA yang terlihat dipoton scalpelkemudian diekstraksi da Gel agarosa mengandung berba yang dapat menghambat perlakuan selanjutnya terhadap tidak dihilangkan. Ekstraksi bertujuan memurnikan DNA pengotor lain yang tidak diinginkan komponen PCR, sehingga efisien terhadap DNA selanjutnya dapat (Lewis 2001).
Ukuran pita DNA hasil purifikasi seharusnya tidak dengan ukuran pita hasil am hanya menghilangkan pengotor Hasil ekstraksi dan purifikasi dengan gel agarosa 1% dan men berukuran sekitar 1500 pb (G ekstraksi dan purifikasi direkombinasikan ke dalam dengan menggunakan metode Gate
Hasil Rekombinasi Gen Stilbena pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi
Rekombinasi gen STS pada dan vektor destinasi pada merupakan teknik pengklonan.
regram amplikon gen STS dengan primer Gateway;
ker 1 Kb Plus DNA , (a) gen STS berukuran
Purifikasi DNA dari
purifikasi DNA dari gel PureLinkTM Quick Gel Gel agarosa yang elektroforesis dari tahap di atas transluminator pita yang akan dipotong. terlihat dipotong dengan diekstraksi dan dimurnikan. gandung berbagai pengotor menghambat reaksi dalam terhadap DNA jika Ekstraksi dan purifikasi DNA dari gel dan tidak diinginkan seperti gga efisiensi perlakuan njutnya dapat meningkat DNA hasil ekstraksi dan
tidak berbeda jauh hasil amplifikasi karena
pengotor dari DNA. purifikasi dielektroforesis dan menghasilkan pita pb (Gambar 6). Hasil purifikasi kemudian dalam vektor donor akan metode Gateway.
Gen Stilbena Sintase or dan Vektor Destinasi
STS pada vektor donor destinasi pada prinsipnya
gklonan. Pengklonan
bertujuan memperbanyak dan meng DNA yang diklon. Pengklonan metode Gateway terdiri atas dua yaitu rekombinasi BP dan rekombinasi Hasil elusi gel disisipkan ke dalam donor pada tahap rekombinasi BP. hasil amplifikasi yang telah memiliki attB1 (pada bagian forward) dan (pada bagian reverse) direaksika vektor donor yang memiliki situs situs attP2 sebagai tempat rekombinasi. rekombinasi tersebut memungkinkan adanya kesalahan orientasi
direkombinasikan. Reaksi rekombinasi dikatalisis oleh enzim BP Clonase
dalam metode Gateway reaksi rekombina pada donor vektor disebut juga rea
reaction). Reaksi BP menghasilkan entri (pENTR) yang diapit oleh dua (Lampiran 4).
Hasil rekombinasi gen STS pada donor kemudian ditransformasikan kompeten Escherichia coli galur dengan perlakuan kejut panas ( Sel kompeten adalah sel y mengalami perlakuan fisik atau sedemikian rupa sehingga menin kemampuannya untuk mengambil dapat dibuat kompeten biasanya perlakuan garam CaCl2 atau RbCl. CaCl2 menyebabkan presipitasi permukaan luar sel dan men perubahan tertentu pada dinding meningkatkan pengikatan DNA. DNA menuju ke dalam sel distimulasi menaikkan temperatur sampai 42
waktu singkat atau kejut panas (Brown 1991).
M a
Gambar 6 Elektroforegram hasil ekstrak dan purifikasi gen STS dari (M) marker 1 Kb Plus DNA
Ladder, (a) gen STS berukur 1500 pb.
9
dan mengisolasi gklonan dengan atas dua tahapan, rekombinasi LR. ke dalam vektor nasi BP. Gen STS telah memiliki situs ) dan situs attB2 direaksikan dengan memiliki situs attP1 dan rekombinasi. Situs memungkinkan tidak ntasi gen yang rekombinasi ini ClonaseTMsehingga reaksi rekombinasi juga reaksi BP (BP menghasilkan suatu klon oleh dua situs attL STS pada vektor ormasikan ke sel galur XL1-Blue panas (heat shock).
sel yang telah fisik atau kimiawi sehingga meningkatkan ngambil DNA. Sel biasanya dengan atau RbCl. Garam presipitasi DNA pada dan menyebabkan ing sel yang DNA. Gerakan distimulasi dengan
ai 42 oC dalam nas (Brown 1991).
oregram hasil ekstraksi en STS dari gel;
b Plus DNA gen STS berukuran
E. coli merupakan mikroorganisme paling umum digunakan
bioteknologi dan dalam sebagian eksperimen kloning gen. E. coli beberapa alasan, yaitu memiliki genom yang relatif kecil, pertumbuha sangat cepat, relatif aman, sifat telah banyak diketahui, dan mampu inang bagi DNA asing (Wea 1989).
Hasil transformasi ditumbuhkan media LA (Luria Agar) ditambahkan antibiotik kanamisin Penambahan kanamisin dil vektor donor yang digunakan 221) memiliki marka seleksi resiste antibiotik tersebut (Lampira transforman dilakukan denga koloni yang tahan terhadap sehingga tumbuh pada media ditambahkan kanamisin 50 diinkubasi. Koloni yang tumb berwarna putih (Gambar 7 dipastikan merupakan klon membawa gen STS, sedangkan (by product) tidak akan tumb koloni putih. Hal tersebut disebabka ccdB yang mengganggu kerja gyrase pada E. colisehingga pertumbuha terhambat (Bernard & Couturi Koloni yang tumbuh diduplik untuk memperbanyak jumlah rekombinan. Hasil duplikasi dengan metode PCR
membuktikan plasmid rekombina tersisipi gen STS.
Koloni yang terbukti me rekombinan kemudian diisol plasmidnya untuk direkombinasikan vektor destinasi melalui tahap LR. Plasmid rekombinan (pENTR) diapit oleh situs attL1 dan direaksikan dengan vektor memiliki situs attR1 dan situs ini dikatalisis oleh enzim LR Clonase
Gambar 7 Koloni yang tumbuh setelah re BP pada metode Gatewa
mikroorganisme yang digunakan dalam industri dalam sebagian besar E. colidipilih karena u memiliki ukuran ecil, pertumbuhannya , sifat genetiknya diketahui, dan mampu menjadi asing (Weaver & Hedrick ditumbuhkan pada Agar) yang telah k kanamisin 50 ppm. kanamisin dilakukan karena digunakan (pDONRTM seleksi resisten terhadap
Lampiran 6). Seleksi kukan dengan mengamati terhadap kanamisin media LA yang telah kanamisin 50 ppm setelah g tumbuh semuanya (Gambar 7) dan hampir kan klon entri yang sedangkan hasil samping akan tumbuh sebagai ut disebabkan oleh gen ggu kerja enzim DNA ngga pertumbuhannya Couturier 1992). diduplikasi dan dikultur ak jumlah plasmid duplikasi kemudian diuji PCR koloni untuk plasmid rekombinan telah kti membawa plasmid udian diisolasi DNA kombinasikan ke dalam melalui tahap rekombinasi inan (pENTR) yang telah L1 dan situs attL2 vektor destinasi yang dan situs attR2. Reaksi nzim LR ClonaseTMyang
g tumbuh setelah reaksi BP pada metode Gateway.
disebut juga reaksi LR (LR reaction LR menghasilkan suatu klon (pEXPR) yang diapit oleh dua (Lampiran 5).
Hasil rekombinasi gen STS pada destinasi kemudian ditransformasi kekanamisin sehingga seleksi transf juga dilakukan dengan melihat koloni yang dapat tumbuh pada media (Gambar 8). Koloni yang tumbuh sedikit disebabkan oleh sel kompeten digunakan telah berkurang keefektifan Koloni yang tumbuh diduplikasi menyimpan koloni yang membawa sisipan agar tidak terkontaminasi
juga dilakukan pengujian plasmid rekombina dengan metode PCR koloni.
Gambar 8 Koloni yang tumbuh sete reaksi LR pada metode Gateway.
Hasil Konfirmasi Koloni Transf Reaksi BP dengan Metode PCR Kolo Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
PCR koloni dilakukan untuk memastika bahwa koloni bakteri yang tumbuh transformasi ke dalam E. coli plasmid rekombinan. Metode PCR yang dilakukan setelah reaksi menggunakan sepasang primer universal karena peta vektor donor (pDONR menunjukkan bahwa amplifikasi denga koloni memerlukan primer M13-Forward primer M13-Reverse (Lampiran Elektroforegram PCR koloni setela menunjukkan bahwa ada 7 dari yang diujikan mengandung gen STS. ditunjukkan dengan adanya pita sekitar 1500 pb setelah elektroforesis. dari 7 koloni hanya 2 koloni saja y benar bersih dari pengotor, yaitu koloni 2 dan nomor 14 (Gambar 9).
Koloni bakteri yang telah plasmid rekombinan selanjutnya ke dalam media Luria Bertani (LB) berisi sumber nutrisi untuk pertumbuhan bakteri. Media LB mer
10
reaction). Reaksi klon ekspresi dua situs attB STS pada vektor ditransformasikan juga seleksi transforman melihat koloni putih ada media tersebut tumbuh relatif sel kompeten yang keefektifannya. diduplikasi untuk membawa gen kontaminasi, selanjutnya plasmid rekombinan tumbuh setelah da metode Koloni Transforman PCR Koloni dan mbinan untuk memastikan tumbuh setelah mengandung Metode PCR koloni setelah reaksi BP primer universal M13 (pDONRTM 221) plifikasi dengan PCR Forward dan Lampiran 6). CR koloni setelah reaksi BP 7 dari 14 koloni gen STS. Hal ini nya pita berukuran elektroforesis. Namun koloni saja yang benar-
aitu koloni nomor h membawa selanjutnya dikulturkan Bertani (LB) cair yang untuk membantu Media LB merupakan
12000 pb 1650 pb 1000 pb 100 pb M 1 2 3 4 Gambar 9 Elektroforegram PCR rekombinasi gen S vektor donor; (M) 1 Kb Plus DNA koloni bakteri. media kompleks karena terd ekstrak yeast (ragi), dan berfungsi sebagai sumber asam peptida, sedangkan ekstrak yeast kebutuhan nitrogen, gula, organik dan anorganik (Brown kultur koloni dalam media diisolasi DNA plasmidnya direkombinasikan pada vektor destinas
Isolasi DNA plasmid, y dengan kit GeneJETTM Plasmid Fermentas, pada prinsipnya dengan isolasi DNA Perbedaannya adalah ukuran lebih kecil dari DNA k konformasi keduanya berbeda. elektroforesis isolat DNA menghasilkan suatu pita, yan bahwa DNA plasmid telah berhasil Elektroforesis hasil isolasi sebenarnya bertujuan untuk mengece kualitatif keberhasilan isolasi plasmid yang telah diisolasi direkombinasikan ke dalam vekt
Hasil Konfirmasi Koloni Reaksi LR dengan Metode PCR Kol Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
Metode PCR koloni juga mengecek koloni bakteri yang transformasi ke dalam E. coli rekombinasi LR. Metode PCR dilakukan setelah reaksi LR sepasang primer spesifik Gatewa Gateway STS-Forward dan Reverse. Vektor destinasi y
2 3 4 5 ... 14
regram PCR koloni inasi gen STS pada vektor donor; (M) marker
us DNA Ladder, (1-14) koloni bakteri.
na terdiri atas tripton, dan NaCl. Tripton mber asam amino dan yeastmenyediakan gula, serta nutrien (Brown 1991). Hasil media LB kemudian plasmidnya untuk pada vektor destinasi.
plasmid, yang dilakukan Plasmid MiniPrepdari prinsipnya hampir sama DNA kromosom. ukuran DNA plasmid DNA kromosom, dan
a berbeda. Hasil DNA plasmid pita, yang menunjukkan telah berhasil diisolasi. isolasi plasmid untuk mengecek secara isolasi plasmid. DNA diisolasi selanjutnya ke dalam vektor destinasi.
Koloni Transforman ode PCR Koloni dan mid Rekombinan
koloni juga dilakukan untuk bakteri yang tumbuh setelah E. coli pada tahap Metode PCR koloni yang si LR menggunakan spesifik Gateway, yaitu dan Gateway STS- destinasi yang digunakan
pada tahap rekombinasi LR ini ada pGD625, pARC983, dan pDEST PCR koloni ini memungkinkan koloni bakteri yang tumbuh amplifikasi gen STS yang disisipka vektor destinasi dengan primer spesifik.
Elektroforegram PCR koloni setelah LR pada gen STS yang disisipka pGD625 menunjukkan bahwa 3 dari 3
M 1 2 3
Gambar 10 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen ST vektor destinasi pGD6 marker 1 Kb Plus, (1 bakteri. M 1 2 3 Gambar 11 Elektroforegram PCR rekombinasi gen ST vektor destinasi pARC9
(M) marker 1 Kb Plus, (1 koloni bakteri.
11
ini ada tiga, yaitu DEST. Tahapan mungkinkan konfirmasi tumbuh sekaligus disisipkan dalam gan primer spesifik.
koloni setelah reaksi disisipkan dalam jukkan bahwa 3 dari 3 koloni
oforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor destinasi pGD625; (M) marker 1 Kb Plus, (1-3) koloni
4
oregram PCR koloni si gen STS pada destinasi pARC983; ker 1 Kb Plus, (1-4)
12
1500 pb
1 2 3 4 5 M
Gambar 12 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor destinasi pDEST; (1-5) koloni bakteri, (M) marker 1 Kb Plus.
yang diujikan semuanya mengandung gen STS. Hal ini ditunjukkan dengan pita yang berukuran sekitar 1500 pb pada elektroforegram (Gambar 10).
Ukuran pita sekitar 1500 pb tersebut juga digunakan sebagai acuan untuk konfirmasi koloni bakteri yang mengandung gen STS pada vektor destinasi pARC983 dan pDEST. Elektroforegram menunjukkan bahwa 3 dari 4 koloni yang diujikan pada vektor destinasi pARC983 (Gambar 11) dan 5 dari 5 koloni yang diujikan pada vektor destinasi pDEST (Gambar 12) positif mengandung gen STS.
Isolasi DNA plasmid kemudian dilakukan terhadap koloni bakteri yang positif mengandung gen STS. Hasil elektroforesis isolat DNA plasmid menunjukkan bahwa DNA plasmid telah berhasil diisolasi. DNA plasmid yang telah diisolasi selanjutnya ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens.
Hasil Transformasi Klon Ekspresi ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGL0
Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciensdilakukan untuk menguji ekspresi pengaruh gen sisipan pada tanaman. Sel Agrobacterium digunakan sebagai wahana yang membawa plasmid rekombinan untuk menginfeksi sel tanaman.Agrobacteriumyang digunakan adalah galur AGL0 karena memiliki virulensi yang tinggi dibandingkan galurAgrobacteriumlainnya.
Transformasi klon ekspresi ke dalam A. tumefaciens menggunakan metode kejut dingin (cool shock) lalu dilanjutkan dengan metode kejut panas (heat shock). Lonjakan suhu dari sekitar -196 oC (inkubasi dalam N2 cair) ke suhu 37 oC (inkubasi dalam water bath) menyebabkan membran sel Agrobacteriummenjadi tidak selektif terhadap molekul asing sehingga plasmid rekombinan yang berisi gen sisipan dapat masuk. Campuran sel kompeten AGL0 dan klon ekspresi kemudian disebar ke media LA yang mengandung antibiotik kanamisin dan rifampisin lalu diinkubasi dalam kondisi gelap. Kanamisin digunakan karena vektor destinasi yang digunakan memiliki marka seleksi berupa resistensi terhadap antibiotik kanamisin, sedangkan rifampisin digunakan untuk membunuh E. coli. Inkubasi dalam keadaan gelap dilakukan karena A. tumefaciens merupakan bakteri tanah yang sensitif terhadap cahaya, sehingga perlu dikondisikan seperti habitat aslinya.
Hasil transformasi menunjukkan terbentuknya koloni berwarna putih pada media LA yang mengandung kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm (Gambar 13). Koloni yang tumbuh berjumlah masing- masing 1 koloni untuk setiap vektor destinasi yang digunakan. Koloni yang tumbuh merupakan koloni yang mengandung klon ekspresi, yaitu klon yang membawa gen STS. Jumlah koloni yang tumbuh di media saat transformasi ke A. tumefaciens lebih sedikit dibandingkan saat transformasi ke E. coli. Hal ini terjadi karena A. tumefaciens memiliki jumlah salinan (copy number) yang lebih sedikit dibandingkan dengan E. coli (Brown 1991).
Koloni bakteri yang tumbuh kemudian diuji dengan metode PCR koloni untuk memastikan bahwa koloni tersebut mengandung klon ekspresi. Primer yang digunakan adalah primer spesifik Gateway.
Gambar 13 Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens.
M 1 2 3
Gambar 14 Elektroforegram PCR koloni hasil transformasi gen STS ke dalam Agrobacterium tumefaciens; (M)
marker 1 Kb Plus, (1) koloni pGD625, (2) koloni pARC983, (3) koloni pDEST.
Elektroforegram PCR koloni menunjukkan bahwa setiap koloni yang diujikan mengandung gen STS yang disisipkan karena pita yang dihasilkan berada pada kisaran 1500 pb (Gambar 14). A. tumefaciens yang telah mengandung gen STS selanjutnya disimpan dalam stok gliserol pada suhu sekitar -70 oC untuk kemudian ditransfer ke dalam tanaman pada penelitian selanjutnya.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen stilbena sintase (STS) telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi dengan menggunakan metode Gateway. Hal tersebut ditunjukkan oleh hasil konfirmasi gen STS setelah reaksi BP maupun reaksi LR yang menunjukkan hasil sekitar 1500 pb. DNA plasmid dalam vektor ekspresi juga telah berhasil ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens sehingga siap ditransfer ke dalam tanaman.
Saran
Penelitian lebih lanjut tentang transformasi Agrobacterium tumefacienske dalam tanaman perlu dilakukan untuk mengetahui keberhasilan ekspresi gen stilbena sintase (STS) dalam hal membuat tanaman resisten terhadap penyakit busuk pangkal batang.
DAFTAR PUSTAKA
Bernard P, Couturier M. 1992. Cell killing by the F plasmid ccdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. J. Mol. Biol. 226:735-745. [Biotek UnUd] Bioteknologi Universitas
Udayana. 2008. Mekanisme molekuler induksi tumor crown gall oleh Agrobacterium tumefaciens. [terhubung berkala]. http://fp.unud.ac.id/. [4 April 2011].
Breuil AC et al. 1999. Characterization of a pterostilbene dehydrodimer produced by laccase of Botrytis cinerea. Phytopathology89:298-302.
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning Gena. Muhammad SA, penerjemah; Praseno, editor. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica. Terjemahan dari: Gene Cloning an Introduction.
Deacon J. 2002. Biology and control of crown gall (Agrobacterium tumefaciens). [terhubung berkala]. http://helios.bto.ed.ac.uk/. [4 April 2011]. Donepudi A. 2011. What is a PCR?
[terhubung berkala]. http://protocolpedia.com/. [2 April 2011]. Escobar MA, Dandekar AM. 2003.
Agrobacterium tumefaciensas an agent of disease. Plant Scie.8:380-386.
Ferguson KA. 1964. Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13(10):985- 1002.
Fermentas. 2006. GeneJETTM Plasmid MiniPrep Kit. Canada: Life Science. Hain R et al. 1993. Disease resistance results
from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature361:153-156.
Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. 2000. DNA cloning using in vitro site-spesific recombination. Genome Research 10:1788-95.
[HGP] Human Genome Project. 2009. Cloning fact sheet. [terhubung berkala]. http://www.ornl.gov/. [31 Maret 2011].
14
Invitrogen. 2003. Gateway® Technology: A universal technology to clone DNA sequence for functional analysis and expression in multiple systems. California: Life Technologies.
Invitrogen. 2010. Platinum® Taq DNA Polymerase. California: Life Technologies.
Invitrogen. 2010. PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit. California: Life Technologies.
Jones HD, Doherty A, Wu H. 2005. Review of methodologies and a protocol for the Agrobacterium-mediated transformation of wheat. Plant Methods. 1:5-14.
Karimi M, Depicker A, Hilson P. 2007. Recombinational cloning with plant gateway vectors. Plant Physiol. 145:1144- 54.
Kennedy S, Oswald N. 2011. PCR Troubleshooting and Optimization: The essential guide. Norwich: Caister Academic Pr.
Kolpack A, Loschelder H. 2008. Gateway- Technologie: potenzial und anwendungen in der molekularen pflanzenforschung. [terhubung berkala]. http://www.ruhr-uni- bochum.de/. [14 April 2011].
Landy A. 1989. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-spesific recombination. Ann. Rev. Biochem. 58:913-949.
Lewis M. 2001. DNA extraction from agarose gels (basic method). [terhubung berkala]. http://www.methodbook.net/. [14 Agustus 2011].
Lilis E. 2009. Konstruksi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase pencegah busuk akar kelapa sawit [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Lubis AU. 1992. Kelapa Sawit di Indonesia. Sumatera Utara: Pusat Penelitian Perkebunan Marihat.
McCullen CA, Binns AN. 2006. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for
interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.22:101-127. McPherson M, Moller S. 2006. PCR. Second
Edition. Abingdon: Taylor & Francis Group.
Nester E. 2008. Agrobacterium: the natural genetic engineer 100 years later. [terhubung berkala]. http://www.apsnet.org/. [4 April 2011]. [PPKS] Pusat Penelitian Kelapa Sawit. 2009.
Penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit (Ganoderma boninense) dan pengendaliannya. [terhubung berkala]. http://pustaka.litbang.deptan.go.id/. [24 Desember 2010].
Rolfs C, Kindl H. 1984. Stilbene synthase and chalcone synthase. Plant Physiol. 75:489- 492.
Rothman B. 2011. Agarose gel electrophoresis. [terhubung berkala]. http://people.rit.edu/. [3 April 2011]. Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular
Cloning: A laboratory manual. Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Sbaghi M, Jeandet P, Faivre B, Bessis R, Fournioux JC. 1995. Development of methods using phytoalexin (resveratrol) assessment as a selection criterion to screen grapevine in vitro cultures for resistance to grey mould (Bortrytis cinerea). Euphytica86:41-47.
Schubert R et al. 1997. An ozone-responsive region of the grapevine resveratrol synthase promoter differs from the basal pathogen-responsive sequence. Plant. Mol. Biol.34:417-426.
[SIB] Swiss Institute of Bioinformatics. 2007. Stilbene synthase. [terhubung berkala]. http://www.expasy.org/. [25 Januari 2011]. Smith JE. 2004. Biotechnology. Fourth
Edition. Inggris: Cambridge University Pr. Triastuti J. 2007. Pengklonan gen. [terhubung
berkala]. http://fpk.unair.ac.id/. [31 Maret 2011].
Weaver R, Hedrick P. 1989. Genetics. Iowa: Wm. C. Brown Publishers.
15
Winarno FG, Agustinah W. 2007. Pengantar Bioteknologi. Edisi Revisi. Bogor: M- BRIO Pr.
Xu W et al. 2011. Expression pattern, genomic structure, and promoter analysis of the gene encoding stilbene synthase from Chinese wild Vitis pseudoreticulata. J. Exp. Bot. 62(8):2745-61.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Penerbit ANDI.
17