Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi menggunakan kit Platinum dari Invitrogen adalah gen stilbena sintase (STS), primer spesifik Gateway STS-For, primer spesifik Gateway STS-Rev, larutan bufer PCR 10x, MgCl2, dNTPs, Taq polimerase, dan molecular water (MW). Bahan yang digunakan dalam elektroforesis yaitu gel agarosa (Fermentas), larutan bufer Tris-Borat- EDTA (TBE) 0.5x, etidium bromida (EtBr) 5 µL/100 mL, loading buffer (bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Ekstraksi dan purifikasi gel menggunakan kit dari Invitrogen (PureLinkTM Quick Gel Extraction). Bahan yang digunakan dalam proses rekombinasi adalah kit Gateway® Technology dari Invitrogen (vektor pDONRTM, vektor destinasi, enzim BP ClonaseTM, enzim proteinase K, enzim LR ClonaseTM). Tahap transformasi ke dalam sel kompeten menggunakan sel kompeten Escherichia coli XL1-Bluedan media Luria Agar (LA). Isolasi DNA plasmid menggunakan kit dari Fermentas (GeneJETTM Plasmid MiniPrep Kit). Tahap transformasi ke dalam Agrobacteriummenggunakan sel kompeten A. tumefaciens galur AGL0 dan media Yeast Extract Pepton (YEP). Bahan lainnya yang digunakan adalah primer M13-F, primer M13- R, larutan bufer 10x dream Taq, larutan bufer
6
TE, kanamisin 100.000 ppm, rifampisin 25.000 ppm, media Luria Bertani (LB) cair + glukosa 20 mM, nitrogen cair, dan gliserol.
Alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir, cetakan agar, bak elektroforesis (BioRad), pipet mikro, tabung mikro, microwave, adaptor 100 volt (Sigma), dan transluminator UV T2201 (Sigma). Alat lainnya yang digunakan adalah DNA speed vacuum110 savant, mesin PCR (ESCO Swift Maxi), Eppendorf Cenrifuge5417R, inkubator Certomat® HK, inkubator Thermolyne type 41900, shaker incubator (Environmental Shaker-Incubator ES-20 BIOSAN), shaker water bath(Techne SB-16), laminar air flow cabinet, neraca analitik, tusuk gigi, alumunium foil, scalpel, dan peralatan gelas seperti segitiga penyebar, cawan Petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, dan gelas ukur.
Metode
Amplifikasi Gen Stilbena Sintase dengan Primer Gateway (Invitrogen 2010)
Gen STS yang telah diisolasi dari tanaman anggur (Vitis vinifera) pada penelitian sebelumnya diamplifikasi dengan menggunakan kit dari Invitrogen. Amplifikasi tersebut menggunakan sepasang primer spesifik Gateway, yaitu Gateway STS- Forward dan Gateway STS-Reverse. Amplifikasi dimulai dengan menyiapkan campuran reaksi (reaction mix) yang terdiri atas 2.5 µL larutan bufer PCR 10x, 1 µL MgCl2, 1 µL dNTPs, 0.2 µL Taqpolimerase 5 unit, dan 14.3 µL molecular water (MW). DNA cetakan (template) dimasukkan ke dalam tabung mikro sebanyak 1 µL, selanjutnya primer F (STS-Forward) dan primer R (STS-Reverse) ditambahkan ke dalam tabung sebanyak masing-masing 1 µL lalu ditambahkan juga 3 µL MW. Reaction mix yang telah dipersiapkan sebelumnya kemudian ditambahkan ke dalam tabung mikro. Gen STS diamplifikasi dengan mesin PCR sebanyak 35 siklus dengan program PCR: predenaturasi pada suhu 94 oC selama 7 menit, denaturasi pada suhu 94 oC selama 45 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 55 oC selama 45 detik, pemanjangan primer (extension) pada suhu 70 oC selama 2 menit, dan pascapemanjangan pada suhu 70 o
C selama 5 menit.
Elektroforesis DNA
Serbuk agarosa ditimbang sebanyak 0.3 g, lalu dilarutkan dalam 30 mL larutan TBE
0.5x. Larutan tersebut dipanaskan dengan microwave selama ± 60 detik sampai larut. Larutan didiamkan sampai cukup hangat (± 50 o
C), lalu ditambahkan EtBr sebanyak 1.5 µL. Larutan agarosa kemudian dituang ke dalam cetakan dan sisir yang telah dipersiapkan sebelumnya, lalu dibiarkan hingga mengeras membentuk agar atau gel. Gel agarosa tersebut digunakan untuk elektroforesis hasil amplifikasi.
Gen yang telah diamplifikasi dengan PCR selanjutnya dielektroforesis untuk identifikasi gen. Gel agarosa yang sudah dibuat diletakkan di dalam bak elektroforesis, kemudian ditambahkan larutan bufer TBE 0.5x sampai gel terendam. Hasil amplifikasi diambil sebanyak 5 µL, kemudian dicampurkan dengan loading buffer sebanyak 1 µL. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa, sebanyak 0.8 µL marker 1 Kb Plus juga ditambahkan ke dalam salah satu sumur. Elektroforesis dijalankan pada tegangan 75 volt selama ± 1 jam.
Pita DNA visualisasi hasil elektroforesis kemudian ditentukan dengan tiga cara, yaitu dibandingkan ukuran pita tersebut dengan marker, dihitung dengan menggunakan rumus log (M) = log (Mo) –KRT (Ferguson 1964), dan dianalisis dengan software Photo- CaptMw.
Ekstraksi dan Purifikasi DNA dari Gel Agarosa (Invitrogen 2010)
Gel agarosa hasil elektroforesis diletakkan di atas transluminator UV. Gen STS yang telah berhasil diamplifikasi ditunjukkan dengan adanya pita yang kemudian diekstraksi dan dimurnikan. Pita yang terlihat pada gel dipotong menggunakan alat pemotong (scalpel). Gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro, kemudian ditambahkan larutan bufer pelarut (L3) sebanyak 3x volume. Larutan tersebut diinkubasi menggunakan water bathpada suhu 50 oC selama 10 menit, kemudian diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 5 menit. Gel yang telah larut dipindahkan ke dalam Quick Gel Extraction Column(kolom) yang berada di atas tabung pencuci (wash tube), kemudian disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dibuang, lalu sebanyak 500 µL larutan bufer pencuci (wash buffer) ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifus lagi pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang, kolom beserta wash tube kosong disentrifus
7
pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Wash tube dibuang dan kolom dipindahkan ke tabung pemulih (recovery tube), selanjutnya ditambahkan 30 µL larutan bufer elusi tepat di tengah kolom lalu diinkubasi selama 1 menit. Kolom beserta recovery tube disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang, kemudian buang kolom. Supernatan dalam recovery tubedisimpan dan diberi label.
Rekombinasi Gen STS pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi (Invitrogen 2003)
Gen STS yang telah diekstraksi dan dipurifikasi selanjutnya direkombinasikan ke vektor donor dan vektor destinasi secara berurutan dengan metode Gateway. Rekombinasi STS pada vektor donor dimulai dengan menyiapkan sebanyak 2 µL DNA hasil purifikasi, 1 µL vektor donor (pDONRTM 221), dan ditambahkan larutan bufer TE sampai volumenya menjadi 8 µL. Enzim BP ClonaseTM ditambahkan terakhir sebanyak 2 µL, kemudian diinkubasi pada suhu 25 oC selama 2 jam. Setelah inkubasi selesai ditambahkan enzim proteinase K sebanyak 1 µL, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 15 menit. Hasil rekombinasi pada vektor donor tersebut diambil sebanyak 5 µL kemudian ditransformasikan ke E. coli untuk menggandakan plasmid yang telah membawa gen STS. Koloni bakteri E. coliyang tumbuh pada media LA dikonfirmasi dengan metode PCR koloni. DNA plasmid koloni bakteri rekombinan tersebut selanjutnya diisolasi untuk direkombinasikan ke vektor destinasi.
Plasmid rekombinan sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam tabung mikro dan ditambahkan 1 µL vektor destinasi (pGD625, pARC983, dan pDEST), kemudian larutan bufer TE ditambahkan sampai volume menjadi 8 µL. Enzim LR ClonaseTM ditambahkan terakhir sebanyak 2 µL, kemudian diinkubasi pada suhu 25 oC selama 2 jam. Setelah inkubasi selesai ditambahkan enzim proteinase K sebanyak 1 µL, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 15 menit. Hasil rekombinasi pada vektor destinasi tersebut diambil sebanyak 5 µL untuk kemudian ditransformasikan ke E. coli. DNA plasmid koloni bakteri yang tumbuh kemudian diisolasi lalu dikonfirmasi dengan metode PCR. Plasmid rekombinan selanjutnya ditransformasikan ke A. tumefaciens.
Transformasi Gen Stilbena Sintase ke
Escherichia coli
Gen STS yang telah direkombinasikan ke vektor donor maupun vektor destinasi ditransformasi ke E. coliuntuk menggandakan sel yang membawa plasmid rekombinan. Hasil rekombinasi sebanyak 5 µL dicampurkan ke dalam 200 µL sel kompeten E. coli XL1-Blue kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Campuran tersebut kemudian diberi perlakuan kejut panas (heat shock) pada suhu 42 oC selama 50 detik menggunakan water bath, kemudian segera dimasukkan lagi ke dalam es selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 800 µL LB cair + glukosa 20 mM dan diinkubasi pada suhu 37 o
C selama 90 menit menggunakan shaker incubatorpada kecepatan 150 rpm.
Setelah dikocok dengan shaker incubator, sebanyak 100 µL hasil kultur dituang ke media LA yang telah ditambahkan kanamisin 50 ppm dan disebar dengan segitiga penyebar. Sisa kultur sebanyak 900 µL disentrifus pada kecepatan 3500 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dibuang sebanyak ± 800 µL, sedangkan sisa supernatan sebanyak 100 µL dan pelet diresuspensi kemudian disebar ke media LA yang lain. Media diinkubasi selama 16-20 jam pada suhu 37 oC kemudian koloni yang tumbuh diamati.
Konfirmasi Koloni Transforman dengan Metode PCR Koloni
Koloni yang tumbuh dipindahkan ke media LA yang baru untuk membuat duplikat koloni. Koloni tersebut setelah diduplikasi juga dipindahkan ke dalam tabung mikro yang berisi 10 µL MW dengan menggunakan tusuk gigi untuk persiapan PCR koloni. Pemindahan koloni harus dilakukan secara steril di dalam laminar air flow cabinet. PCR koloni dimulai dengan menyiapkan reaction mixyang terdiri atas 1.5 µL larutan bufer 10x dream Taq (Fermentas), 0.3 µL dNTPs, 0.15 µL primer F, 0.15 µL primer R, 0.15 µL Taqpolimerase, dan 2.75 µL MW. Konfirmasi koloni pada vektor donor menggunakan primer M13-F dan M13-R, sedangkan pada vektor destinasi menggunakan primer Gateway STS-For dan Gateway STS-Rev.
PCR koloni dilakukan dalam 30 siklus. Tahap pertama PCR koloni adalah melisis dinding sel koloni, yaitu dengan program lisis koloni PCR: 96 oC selama 5 menit, 50 oC selama 90 detik, 96 oC selama 90 detik, 45 oC selama 90 detik, 96 oC selama 1 menit, dan 40 o
C selama 1 menit. Program dihentikan sejenak untuk dilakukan penambahan 5 µL
reaction mix pada tabung mikro, kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR biasa: 94 oC selama 30 detik, 55 o
C selama 1 menit, dan 72 oC selama 2 menit. Hasil konfirmasi dicek dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006)
Isolasi DNA plasmid menggunakan GeneJETTM Plasmid MiniPrep Kit dari Fermentas. Koloni bakteri yang tumbuh pada media LA dikulturkan ke media LB cair yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Kultur diinkubasi dengan menggunakan shaker incubator pada suhu 37 oC selama semalam dengan kecepatan 220 rpm.
Kultur bakteri yang telah tumbuh kemudian dipindahkan ke tabung mikro sebanyak 2 mL, dan disentrifus pada 8000 rpm, 25 oC, selama 3 menit. Pelet yang terbentuk diambil dan dilarutkan dengan penambahan 250 µL larutan resuspensi. Pelet yang telah larut kemudian ditambahkan 250 µL larutan lisis, lalu tabung dibolak-balik sebanyak 6 kali. Sebanyak 350 µL larutan netralisasi kemudian ditambahkan ke dalam larutan tersebut dan tabung dibolak-balik lagi 6 kali, lalu disentrifus pada 12000 rpm, 25 oC, selama 5 menit.
Supernatan dipindahkan ke GeneJETYM Spin Column (kolom) dan disentrifus pada 12000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µL larutan pencuci ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifus pada 12000 rpm selama 1 menit (dilakukan dua kali). Tabung beserta kolom dalam keadaan kosong kemudian disentrifus lagi pada 12000 rpm selama 1 menit. Kolom dipindahkan ke dalam tabung baru, kemudian ditambahkan 30 µL larutan bufer elusi tepat di tengah kolom, lalu diinkubasi selama 2 menit dan disentrifus pada 12000 rpm selama 2 menit. Hasil isolasi dicek dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGL0
Transformasi ke A. tumefaciensdilakukan dengan sebanyak 10 µL hasil rekombinasi pada vektor destinasi dimasukkan ke dalam 500 µL sel kompeten A. tumefaciens galur AGL0 lalu didiamkan di dalam es selama 15 menit. Campuran tersebut kemudian diinkubasi di dalam nitrogen cair selama 5 menit, dilanjutkan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 menit di dalam water bath. Sebanyak 1 mL media Yeast Extract Pepton
(YEP) ditambahkan ke dalamnya kemudian dibungkus dengan koran sampai tidak terpapar cahaya. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 28 oC selama 3 jam di dalam shaker incubator. Hasil inkubasi kemudian disentrifus pada kecepatan 6000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang sebagian, dan sebanyak ± 100 µL supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet lalu disebar ke media LA yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm. Media diinkubasi selama 2 hari pada suhu 28 oC dalam kondisi gelap.