Keperluan dasar penelitian di bidang biologi molekuler adalah adanya DNA yang cukup. Oleh karenanya banyak metode ekstraksi DNA yang dilakukan untuk memperoleh cara yang lebih efektif dalam menghasilkan DNA. Sampel yang digunakan diperoleh dari darah segar sapi Friesian Holstein (FH) yang dikoleksi dari Laboratorium Lapang Hewan Pusat Bioteknologi-LIPI Cibinong. Sampel tersebut diekstraksi menggunakan metode Sambrook et al., (1989) yang telah dimodifikasi. Indikasi keberhasilan ekstraksi DNA perlu diketahui kuantitas dan kualitas DNA yang dihasilkan. Secara kuantitas bisa dilihat dari nilai konsentrasi DNA dan nilai OD 260/280. Sedangkan secara kualitas bisa dilihat dari hasil elektroforesis dan kemurnian DNA.
Kuantitas DNA Konsentrasi DNA
Hasil Perhitungan konsentrasi DNA dengan GeneQuant DNA calculator dari 24 sampel tergantung dari volume darah yang digunakan. Semakin banyak volume darah yang digunakan maka relatif semakin meningkat konsentrasi DNA yang dihasilkan. Konsentrasi DNA yang diperoleh berkisar antara 84,200 ± 24 ng/µl- 151,550 ± 29 ng/µl. Volume darah 300 µl menghasilkan konsentrasi DNA yang relatif lebih tinggi (151,550 ± 29 ng/µl) pada kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm. Demikian juga pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm menghasilkan DNA yang relatif tinggi pada volume darah 300 µl yaitu rata-rata 121,070 ± 26 ng/ul dibandingkan dengan volume darah 100 µl dan 200 µl . Konsentrasi DNA darah sapi segar Friesian Holstein FH secara lengkap disajikan pada Tabel 1.
Tabel. 1 Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan Sentrifugasi terhadap Konsentrasi DNA (Rataan ± SE)
Konsentrasi DNA (Rataan ± SE) Kecepatan
sentrifugasi
Volume Darah(µl) : Lisis Buffer(µl)
100 : 800 200 : 700 300 : 600
……….ng/µl ………
10000 rpm 113,020±32 120,850 ±46 151,550 ±29
Secara statistik konsentrasi DNA yang dihasilkan tidak berbeda nyata (p>0,05) pada masing-masing kecepatan sentrifugasi. Hal ini menunjukkan nilai konsentrasi DNA yang dihasilkan dari setiap perlakuan pada setiap kecepatan sentrifugasi hampir sama. Hasil statistik tidak ada interaksi antara perbandingan volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan. Namun, peningkatan konsentrasi DNA pada perbandingan volume darah : lisis buffer (300 µl : 600 µl) pada kecepatan sentrifugasi yang berbeda menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang dihasilkan relatif meningkat berbanding terbalik dengan volume lisis buffer yang digunakan.
DNA terdapat di dalam inti sel, pada darah mamalia dewasa inti sel berada di dalam sel darah putih (leukosit). Dellman dan Brown (1989) menyebutkan bahwa eritrosit pada mamalia dewasa tidak berinti dan leukosit memiliki inti sel. Volume darah yang digunakan lebih banyak menghasilkan leukosit yang lebih banyak dengan demikian menghasilkan konsentrasi DNA yang relatif lebih tinggi. Kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm menghasilkan rata-rata konsentrasi DNA yang relatif lebih tinggi dibandingkan pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm. Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan DNA dan komponen-komponen lain, tetapi kemungkinan DNA dapat tercampur dengan komponen yang lain seperti protein, RNA, lipid, dan polisakarida pada putaran sentrifugasi yang lebih cepat. Berdasarkan hasil ini menunjukkan kecepatan dan lama sentrifugasi harus benar-benar diperhatikan.
Rasio DNA
Tingkat kemurnian DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai 260 nm dan 280 nm pada sampel DNA yang diukur melalui GeneQuant DNA calculato. Nilai 260 merupakan nilai maksimal DNA dapat menyerap cahaya. Nilai absorbansi pada panjang gelombang (A260) dapat digunakan untuk memperkirakan konsentrasi DNA juga. Sedangkan nilai 280 merupakan nilai maksimal residu tirosin dapat menyerap cahaya. Nilai absorbansi pada panjang gelombang (A280) dapat digunakan untuk indikasi kontaminasi protein (Muladno, 2002). Nilai OD 260/280 menunjukkan kualitas DNA (tingkat kemurnian), DNA dikatakan murni apabila rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8-2,0 (Khosravinia dan Ramesha, 2006). Rasio OD 260/280 pada penelitian ini rata-rata berkisar antara 1,152 ± 0,052 sampai 1,394 ± 0,140, menunjukkan tingkat kemurnian
DNA masih rendah. Rasio kurang dari 1,8 mengindikasikan adanya kontaminasi protein dan phenol (Brown, 1996). Selain kontaminasi protein dan phenol, rasio DNA yang kurang dari 1,7 disebabkan adanya kontaminasi bahan kimia lainnya seperti Tris, EDTA, etanol, sodium asetat yang akan menyebabkan kontaminasi pada sempel (Khosravinia et al., 2007). Hasil kemurnian DNA pada rasio 260/280 disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dan Kecepatan Sentrifugasi terhadap Rasio OD 260/280 (Rataan ± SE)
Rasio OD 260/280 (Rataan ± SE) Kecepatan
sentrifugasi
Volume Darah(µl) : Lisis Buffer(µl)
100 : 800 200 : 700 300 : 600
10000 rpm 1,394a ±0,140 1,371a ±0,082 1,340a ±0,033 12000 rpm 1,258b ±0,073 1,153b ±0,120 1,152b ±0,052 Keterangan : huruf superskrip berbeda dalam kolom yang sama, berbeda nyata
(p<0,05) dan huruf superskrip sama dalam baris yang sama, tidak berbeda nyata (p>0,05).
SE : Standard Error
Secara statistik tidak ada interaksi antara perbandingan volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi terhadap kemurnian DNA (p>0,05). Kemurnian DNA juga tidak dipengaruhi oleh perbandingan volume darah dan lisis buffer. Sedangkan kecepatan sentrifugasi dapat mempengaruhi tingkat kemurnian DNA, dengan kecepatan 10.000 rpm telah mampu mengendapkan lebih banyak dan mampu memisahkan molekul DNA dengan molekul yang lainnya. Sedangkan pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm diperkirakan putaran terlalu cepat sehingga DNA kemungkinan dapat tercampur lagi dengan komponen yang lain. Kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm menghasilkan kemurnian DNA rata-rata (1,368) sedangkan pada putaran 12.000 rpm menghasilkan kemurnian DNA rata-rata (1,187).
Tingkat kemurnian relatif tinggi diperoleh pada perbandingan volume darah dan lisis buffer 100 µl : 800 µl dengan kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm (1,394 ± 0,140) dan relatif rendah pada perbandingan 300 µl: 600 µl (1,153 ± 0,052). Dengan dimikian, pada volume darah yang digunakan sedikit dengan penambahan lisis buffer yang lebih banyak (100 µl : 800 µl) menghasilkan kemurnian yang relatif lebih
tinggi. Lisis buffer pada penelitian ini berfungsi untuk melisis sel. Komposisi lisis buffer diantaranya EDTA dan SDS, EDTA untuk merusak dinding sel dengan cara mengikat ion magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Sedangkan SDS untuk merusak membran sel (Muladno, 2002). Penambahan lisis buffer yang lebih besar (800 µl) diduga lebih efektif melisis sel darah merah pada volume darah yang lebih sedikit (100 µl). Kemurnian DNA relatif menurun dari perbandingan volume darah dan lisis buffer 100 µl : 800 µl, 200 µl : 700 µl, dan 300 µl : 600 µl.
Banyak faktor yang menyebabkan kemurnian pada penelitian ini masih sedikit rendah. Selain terkontaminasi bahan kimia, sampel juga masih terdapat RNA dan protein, sehingga hasilnya bukan DNA murni. Dalam meningkatkan kemurnian DNA yang diperoleh masih harus dilakukan tahap pemurnian dengan cara pencucian dengan beberapa kali dan penambahan PCI dua kali (Khosravinia et al., 2007). Selain itu, ketelitian dalam bekerja merupakan salah satu hal yang harus diperhatikan karena dapat mempengaruhi kemurnian DNA yang dihasilkan juga.
Kualitas DNA
Kualitas DNA hasil ekstraksi bisa dilihat pada gel agarose 1% setelah dielektroforesis pada 100 voltage selama 1 jam. Pengukuran panjang molekul DNA diperlukan pengukur DNA yang disebut molecule weight dna marker (Muladno, 2002). Marker yang digunakan untuk membandingkan ukuran molekul DNA dalam penelitian ini adalah berukuran 1 kb (kilobasa) DNA Ladder N32325. Ukuran DNA sampel dapat diperkirakan dengan cara melihat posisi DNA terhadap DNA pengukur yang memang sudah diketahui panjangnya. Namun, pengukuran seperti ini masih bersifat perkiraan. Elektroforesis dalam penelitian ini tujuannya untuk melihat ekspresi DNA dan melihat keberhasilan ekstraksi DNA yang dilakukan.
Ukuran dan kemurnian DNA menurut (Albert et al., 2002) dapat ditentukan oleh elektroforsis. Satu sampel DNA diambil secara acak dari setiap perlakuan untuk dielektroforesis. Gambar 3 menunjukkan DNA yang berasal dari darah segar sapi FH berhasil diisolasi dengan baik, karena tidak ada pita-pita lainnya yang tampak di bawah gambar pada setiap sampel (single band).
Perkiraan ukuran DNA pada keenam perlakuan (Gambar 3) lebih dari 1.000 pasang basa (pb) atau 1 kilobasa (kb). Besar kecilnya konsentrasi DNA dapat ditunjukkan dengan tipis dan tebalnya pita DNA. Perbandingan darah dan lisis buffer (100 µl : 800 µl) dan (300µl : 600 µl) dengan kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm menunjukkan ukuran molekul besar. Pita-pita pada perlakuan tersebut terlihat smear memperlihatkan molekul DNA tidak turun ke bawah karena konsentrasi yang tinggi. Perbandingan darah dan lisis buffer 100 µl : 800 µl adalah 108.7 ng/ul dan 300 µl : 600 µl adalah 200 ng/ul. Pita yang paling tipis ditunjukkan pada perbandingan darah dan lisis buffer 100 µl : 800 µl pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm dengan konsentrasi DNA yang paling rendah (74,5 ng/µl).
M T1 T2 T3 T4 T5 T6
Gambar 3. Hasil Pemotretan Elektroforesis dari DNA Marker (M) I Kb dan Enam Sempel DNA (T1-T6)
DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung ukuran atau marker DNA. Molekul yang berukuran kecil dapat dengan mudah melewati gel karena bergerak lebih cepat dibandingkan molekul yang besar. Faktor lain yang menentukan keberhasilan elektroforesis adalah konsentrasi gel. Nicholl (1996) menyatakan konsentrasi gel yang normal untuk elektroforesis yaitu antara 0.3-2.0%. Molekul DNA yang tidak turun ke bawah dapat ditentukan juga karena konsentrasi agarose terlalu tinggi. Migrasi molekul DNA yang berkonsentrasi rendah lebih cepat dibandingkan dengan molekul yang bekonsentrasi tinggi (Muladno, 2002).