Penelitian ini dilaksanakan di Laboraturium Biologi Molekuler Hewan, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong. Penelitian dilaksanakan selama dua bulan dari bulan Februari-April 2009.
Materi Sampel dan Bahan
Sampel yang digunakan adalah darah segar sapi FH dari empat ekor sapi yang berasal dari Laboratorium Lapang Hewan Pusat Bioteknologi-LIPI Cibinong. Darah diambil dengan jarum G-18 pada pembuluh darah (vena) halus di ekor. Darah dikoleksi langsung ke dalam tabung 10 ml mengandung 15 % EDTA (Etilendiamin tetraaserat) sebagai antikoagulasi.
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA yaitu, 5 ml darah segar sapi FH, 16,8 ml lisis buffer (1M Tris HCl pH 8, 5M NaCl, 5M EDTA dan 1 % SDS), Proteinase-K (Progen) 0,48 ml, phenol-choroform-isoamyl alkohol (PCI) (25:24:1) 14,4 ml, 3M NaOAc (Natrium Acetat) pH 5,2 sebanyak 0,72 ml, 12 ml etanol 70 %, 14,4 ml etanol 96 % dan buffer TE pH 8 (1M Tris dan 0,5M EDTA) 1,2 ml.
Bahan-bahan yang digunakan untuk kuantifikasi DNA yaitu, DNA 5 µl tiap sempel, TE buffer, H2O steril dan etanol 70 %.
Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis yaitu, DNA 35 µl, gel agarose 1 % (Invitrogen ultra pure +M Agarose), TBE 1x, ethidium bromida, 14 µl loading dye (1 ml G190A 24267202), 10,5µl marker DNA 1 kb (Biolabs ladder N32325), alkohol, H2O dan film polaroid.
Peralatan
Alat-alat yang digunakan untuk penelitian diantaranya Jarum G-18 (B-D Precision Glidetm needle) , holder, venoject vacutainer cont EDTA 10 ml (Nesco), sentrifugasi (HERME 2300 k), vortex (Barnstead Thermolyne), mikrotube 1.5 ml, mikropipet (Biorad), autocolave, oven, pH meter (Thermo Orion), pengering pellet (Savant), thermometer, GeneQuant DNA calculator (Amersham Biosciences),
refrigerator, elektroforesis (Biorad), ultraviolet light, dan timbangan analitik (Precisa XT 120 A).
Rancangan Statistik
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial (3x2) dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu tiga kombinasi volume darah dan lisis buffer (µl darah : µl lisis buffer), yaitu 100 : 800, 200 : 700, dan 300 : 600. Faktor kedua yaitu kecepatan sentrifugasi, 10.000 rpm dan 12.000 rpm. Dengan demikian penelitian ini melibatkan enam perlakuan (3x2), tiap perlakuan diulang empat kali. Sebagai ulangan adalah sapi, sehingga penelitian ini menggunakan empat ekor sapi dan jumlah sempel sebanyak 24. Model rancangan tersebut menurut Steel dan Torrie (1991) adalah sebagai berikut:
Yijk = μ + Ai + Bj + ABij +
ε
ijk Keterangan :Yijk : Variabel respon akibat pengaruh komposisi lysis buffer ke-i dan taraf kecepatan sentrifugasi ke-j pada ulangan ke-k
µ : Nilai tengah umum
Ai : Pengaruh komposisi lysis buffer level ke-i Bj : Pengaruh kecepatan sentrifugasi levek ke-j
ABij : Pengaruh interaksi antara komposisi lsis buffer ke-i dengan kecepatan sentrifugasi ke-j
Εij : Galat percobaan pada unit percobaan ke-k dalam kombinasi perlakuan ke-ij
Analisis Data
Data berupa kuantitas dan kemurnian DNA yang diperoleh dari setiap perlakuan akan dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA). Sebelum dianalisis data diuji kehomogenan, kenormalan dan kebebasan galat terlebih dahulu, apabila data memenuhi uji asumsi maka data langsung dianalisis. Apabila data tidak memenuhi asumsi maka data di transformasi. Perbedaan antar perlakuan akan diuji dengan menggunakan Tukey pada taraf perbedaan 5 % (p<0,05).
Data berupa kualitas DNA yang diperoleh secara acak dari setiap perlakuan, dibandingkan antar perlakuan dengan melihat kemunculan pita tunggal. Ukuran
DNA yang digunakan adalah 1kb Biolabs DNA Ladder N32325, hanya sebagai kontrol ukuran berat molekul.
Prosedur
Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah modifikasi phenol-choroform- isoamyl alcohol (PCI) menurut Sambrook et al. (1989) adalah sebagai berikut:
Koleksi Darah Segar
Koleksi darah diperoleh sebanyak 5-6 ml dalam tabung 10 ml yang berisi EDTA sebagai antikoagulasi.
Koleksi Darah Putih
Koleksi darah putih dilakukan dengan menggunakan lysis buffer, komposisi yang digunakan adalah perbandingan volume darah segar dengan lisis buffer yaitu 100 µl : 800 µl, 200 µl : 700 µl, dan 300 µl : 600µl. Komposisi darah dan lisis buffer yang telah dicampurkan kemudian dihomogenkan. Selanjutnya dilakukan presipitasi protein.
Penghilangan Protein
Darah yang telah homogen ditambahkan 20 µl proteinase-K, diinkubasi pada suhu 56oC selama 1 jam setiap 20 menit tabung digoyangkan. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 600 µl phenol-choroform-isoamyl alkohol (PCI) dengan perbandingan (25:24:1), inkubasi kembali pada suhu -20 oC selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi sesuai perlakuan (10.000 rpm dan 12.000 rpm) selama 10 menit pada suhu 10 0C.
Presipitasi dan Koleksi DNA
Lapisan yang paling atas (supernatan) setelah disentrifugasi dipindahkan ke tabung baru, tambahkan 30 µl 3M NaOAc dan 600 µl etanol 96 % lalu goyangkan dan inkubasi pada suhu -20 oC selama 30 menit. Larutan disentrifugasi sesuai perlakuan (10.000 rpm dan 12.000 rpm) selama 10 menit pada suhu 10 0C. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan 500 µl etanol 70 % dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang sama, supernatan dibuang. Pelet DNA dikeringkan dengan vacum, kemudian dilarutkan dengan 50 µl TE buffer. DNA disimpan dalam suhu -20 oC sebagai stok untuk kuantifikasi dan elektroforesis.
Kuantifikasi DNA
DNA terkoleksi dikalkulasi dengan mesin GeneQuant DNA calculator. Dasar perhitungan kemurnian DNA tersebut dibandingkan pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm. Mesin GeneQuant DNA calculator dinyalakan tunggu sinyal sampai keluar instrument ready, tombol DNA ditekan dan dimasukan TE buffer sebagai blanko, ditekan tombol set ref ditunggu sampai muncul pada layar niai 0,000 pada semua peubah. Sampel DNA yang telah diterapkan dalam kuvet sebanyak 5 µl, kemudian tekan enter tunggu sampai nilai keluar. Nilai yang tertera pada layar yang dicatat yaitu nilai konsentrasi (ng/µl), nilai absorbansi 260 nm, 280 nm dan nilai rasio 260/280. Kuantifikasi dilanjutkan pada sampel berikutnya sebanyak 24 sampel.
Kualifikasi DNA
Gel agarosa 1% dilarutkan dalam TBE 1X (20 gram agarosa dan 200 ml TBE 1X) didihkan sampai larut, kemudian dibiarkan beberapa menit hingga suhunya turun 50-60 0C. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki, kemudian gel agarosa dituangkan ke dalam baki cetakan, tunggu hingga gel mengeras, dimasukkan ke dalam tanki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan buffer TBE 1X. Masing- masing 5 µl sampel dicampurkan dengan 2 µl loading dye. Sedangkan untuk DNA Ladder digunakan ladder 1 kb sebanyak 1.5 µ l yang dicampurkan dengan 2 µl loading dye. Selanjutnya dimasukkan ke dalam sumur, dicatat nomor sumur dan sampel DNA yang dimasukkan. Elektroforesis dijalankan dengan alir listrik 100 voltage, selama 60 menit, tekan tombol run. Setelah itu, gel direndam dalam larutan ethidium bromide selama 30 menit. Cuci gel yang telah direndam ethidium bromide pada air yang mengalir kemudian dilihat diatas UV illuminator, hasil visualisasi difoto dengan film Polaroid. Pita yang dihasilkan konfirmasikan dengan konsentrasi DNA yang dihasilkan dari mesin GeneQuant DNA calculator.