Uji Antagonisme T. harzianum terhadap B. theobromae secara In Vitro Pengamatan dilakukan mulai hari kedua, karena pada hari pertama pertumbuhan koloni T.harzianum belum dapat menghambat pertumbuhan
B.theobromae dan belum terjadi interaksi antar kedua koloni tersebut. Rata-rata persentase penghambatan hari kedua sampai dengan hari kelima berturut-turut 43.52%, 65.51%, 85.98%, dan 96.35%. Penghambatan T. harzianum dapat terlihat dari pertumbuhan B.theobromae yang sangat lambat saat di tumbuhkan secara bersamaan dengan T.harzianum pada media PDA.
Penghambatan T.harzianum terhadap B.theobromae dapat terlihat dari panjang jari-jari B.theobromae yang mendekati koloni T.harzianum lebih kecil daripada jari-jari yang mendekati tepi cawan, sedangkan pertumbuhan jari−jari koloni T.harzianum setiap harinya selalu berkembang dan tumbuh meluas hingga menutupi sebagian koloni dari B.theobromae (Gambar 1). Pada kontrol patogen,
B.theobromae dapat tumbuh optimal hingga dapat memenuhi cawan di hari ketiga. Koloni B.theobromae mulanya tumbuh berwarna putih pada hari pertama hingga hari keempat. Namun pada hari kelima koloni menjadi berwarna kehitaman.
Gambar 1 Uji antagonisme T.harzianum (Th) terhadap B.theobromae (Bt) pada 2 hsi-5 hsi: (A) pada 2 hsi, koloni T.harzianum mulai berinteraksi dengan koloni B.theobromae, (B) pada 3 hsi, koloni T.harzianum sebagian sudah menutupi bagian tepi koloni B.theobromae, (C) pada 4 hsi, koloni
T.harzianum semakin menghambat pertumbuhan dan mulai tumbuh di atas koloni B.theobromae, dan (D) pada 5 hsi, hifa koloni T.harzianum
sudah tumbuh di atas dan menutupi koloni B.theobromae.
Uji antagonisme pada 3 hsi terbentuk zona bening di antara patogen dan
T.harzianum. Hal ini menunjukkan adanya mekanisme antibiosis. Widyastuti (2007) mengemukakan bahwa Trichoderma spp. memiliki kemampuan dalam memproduksi enzim pengurai dinding sel yaitu glukanase, selulase dan kitinase. Pada 4 dan 5 hsi, sudah mulai nampak adanya hiperparasitisme. Uji antagonisme dengan agar block tidak dilakukan pada percobaan sehingga adanya mekanisme A C D B Bt Bt Bt Bt Bt Bt Bt Th Bt Th Th Th
9 lisis belum dapat dikonfirmasi. Oleh karena itu, mekanisme T. harzianum dalam menghambat pertumbuhan B.theobromae pada percobaan ini, yaitu melalui mekanisme persaingan tumbuh, antibiosis, dan hiperparasitisme. Proses hiperparasitisme diawali dari apresoria T. harzianum menempel pada hifa patogen kemudian terjadi penetrasi sehingga dinding sel hifa B. theobromae terdegradasi. Selain itu, T. harzianum terkadang membagi ujung hifanya menjadi dua cabang untuk menekan hifa patogen. Hifa utama dapat menghasilkan bentukan kait seperti cabang yang melakukan penetrasi sehingga terbentuk belitan dan mengakibatkan kerusakan pada miselia patogen (Gupta et al. 1999).
Keefektifan Mikoriza Arbuskular, Kitosan, dan T. harzianum dalam Pengendalian Penyakit Busuk Pangkal Batang Jeruk pada Uji In Planta
Patogen Botryodiplodia theobromae yang berhasil menginfeksi menyebabkan gejala yang muncul pada tanaman berupa blendok atau gummosis (gom) berwarna kuning keemasan (Gambar 2A dan B). Munculnya gom dari bagian batang yang dilukai sering disebut sebagai gejala busuk basah. Busuk basah ditunjukkan dengan reaksi tanaman setelah terinfeksi yaitu batang, cabang atau ranting yang terserang mengeluarkan gom berwarna kuning keemasan dan pada stadia lanjut, kulit tanaman mengelupas atau bahkan bisa mengakibatkan kematian. Cendawan berkembang di antara kulit dan kayu, merusak kambium, sehingga apabila serangan telah mengelilingi batang, tanaman akan mati. Pada tahap awal patogen masuk pada kulit di daerah ketiak cabang terutama kulit yang luka, serangan di antara kulit dan kayu mengakibatkan tanaman mengeluarkan gom sebagai reaksi tanaman atas serangan patogen (Naqvi 2004).
Gambar 2 Gejala penyakit busuk pangkal batang 21-63 hsi. Batang mengeluarkan gumosis (A dan B), nekrosis batang (C), bagian kulit batang pecah (D), bagian kulit batang mengelupas (E dan F), serta ranting mati (G). Gejala busuk kering yang ditemukan pada pengamatan diantaranya, nekrosis batang (Gambar 2C), kulit batang pecah (Gambar 2D), kulit batang kering dan
E F G
B
10
mengelupas (Gambar 2E dan 2F), hingga menyebabkan mati ranting (Gambar 2G). Gejala awal busuk kering lebih sulit diamati karena kulit batang atau cabang tanaman yang terserang tidak mengeluarkan gum tetapi akan mengelupas dan langsung mengering. Gejala nekrosis muncul di sekitar pelukaan yang dilakukan pada batang. Pada awal pengamatan gejala ini tidak nampak jelas namun semakin lama terlihat bercak berwarna coklat kehitaman dan disekelilingnya terdapat miselium berwarna hitam. Serangan pada batang utama lebih berbahaya dibanding pada cabang atau ranting. Serangan yang melingkar pada batang atau cabang mengakibatkan bagian tanaman di atas serangan akan kering atau mati dan berwarna hitam (Henuk 2010)
Pengamatan keparahan dan kejadian penyakit busuk pangkal batang dihitung berdasarkan luasan gejala yang muncul pada batang. Pengamatan dilakukan pada hari ke 21, 28, 35, 42, 49, 56, dan 63 setelah inokulasi patogen. Luasan gejala dihitung dengan mengukur panjang dan lebar dari gejala yang muncul. Hasil pengamatan luas gejala pada Gambar 3 menunjukkan bahwa perlakuan inokulasi B.theobromae tanpa aplikasi agens hayati memiliki nilai luas gejala yang paling besar dan perlakuan tunggal kitosan memiliki luas gejala terbesar kedua di antara perlakuan lainnya pada setiap minggunya. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan kitosan dengan konsentrasi 0.1% memiliki pengaruh yang kecil terhadap penghambatan pertumbuhan patogen. Perlakuan kitosan yang dikombinasi dengan mikoriza arbuskular dan T.harzianum memiliki luas gejala yang kecil karena adanya induksi ketahanan dari kedua agens tersebut.
Gambar 3 Perkembangan luas gejala penyakit busuk pangkal batang dari pengamatan 21-63 hsi.
Penelitian Nawar (2005) menunjukkan bahwa kitosan dapat menghambat perkecambahan spora. Penghambatan paling besar terjadi pada perlakuan kitosan konsentrasi 3 dan 6 mg/ml yang diduga memiliki sifat sebagai fungisida. Pemberian kitosan akan menghambat pertumbuhan miselia dan perkecambahan spora cendawan patogen dengan adanya akitivitas kitinase dan senyawa antifungi. Aktivitas kitinase dapat menghidrolisis berbagai bentuk kitin pada dinding sel yang dimanfaatkan mikoba sebagai sumber karbon (Yanai et al. 1992). Asetil amino dan glukosamin pada kitosan yang bermuatan positif akan berikatan dengan bagian negatif dari makromolekul cendawan dan menyebabkan cendawan
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 21 hsi 28 hsi 35 hsi 42 hsi 49 hsi 56 hsi 63 hsi L u as ge jala ( cm 2 ) Perlakuan
11 mengalami gangguan dalam pertumbuhannya (Hamdayanti et al. 2012). Namun demikian keefektifan dari aktivitas tersebut bergantung pada jenis kitosan (murni atau turunan), derajat polimerasi, inang, komposisi substrat, dan kondisi lingkungan (Jamilah 2011).
Perlakuan inokulasi patogen dengan kombinasi mikoriza arbuskular dan kitosan, inokulasi patogen dengan kombinasi T.harzianum dan kitosan serta perlakuan tunggal mikoriza arbuskular dan T.harzianum memiliki luas gejala yang kecil jika dibandingkan dengan perlakuan inokulasi patogen dengan kombinasi mikoriza arbuskular dan T.harzianum. Diduga adanya kompetisi nutrisi dalam tanah oleh mikoriza arbuskular dan T.harzianum tersebut, sehingga perkembangannya menjadi kurang optimal. Pengendalian busuk pangkal batang yang efektif dan efisien lebih direkomendasikan menggunakan infestasi tunggal
G. fimbriatum maupun mikoriza arbuskular. Hal ini diduga karena akan terjadi kompetisi antara G. fimbriatum dengan mikoriza arbuskular di dalam tanah untuk memperebutkan nutrisi, serta asosiasi mikoriza arbuskular berjalan lebih lambat dibandingkan G. Fimbriatum (Supraba 2014).
Tabel 2 menunjukkan seluruh perlakuan dengan agens hayati memiliki keparahan penyakit yang lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan inokulasi patogen tanpa agens hayati. Keparahan penyakit berhubungan erat dengan luas gejala. Semakin luas gejala yang muncul, maka semakin besar nilai keparahan penyakitnya. Keparahan penyakit tertinggi terjadi pada perlakuan inokulasi patogen tanpa agens hayati, yaitu 39.89%. Perlakuan tersebut menunjukkan nilai yang berbeda nyata dengan perlakuan tunggal mikoriza arbuskular dan
T.harzianum, perlakuan kombinasi mikoriza arbuskular dan kitosan, serta perlakuan kombinasi T.harzianum dan kitosan. Hal ini sesuai dengan penelitian Supraba (2014) yang menyebutkan bahwa perlakuan dengan inokulasi
B.theobromae tanpa agens hayati menunjukkan tingkat keparahan penyakit yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan yang diinfestasikan agens hayati
Gliocladium fimbriatum, mikoriza arbuskular, dan kombinasinya.
Tabel 2 Dampak pemberian mikoriza arbuskular, kitosan, T. harzianum, serta kombinasinya terhadap peubah yang diamati pada 63 hsi
Perlakuana
Peubah yang diamati Luas gejala (cm2)1 KpP (%)1 KjP(%)1 Periode laten(hsi)1 Laju infeksi TA-Bt 0.00c 0.00c 0.0b 00.00c 0.000
TA+Bt 2.81a 38.89a 100.0a 19.89b 0.219
Bt+M 0.82bc 19.45b 100.0a 28.11a 0.077
Bt+C 1.23b 27.78ab 100.0a 22.33ab 0.161
Bt+Th 0.90bc 20.22b 100.0a 27.89a 0.089
Bt+M+C 0.78bc 16.67b 100.0a 30.22a 0.070
Bt+M+Th 1.02b 25.00ab 100.0a 23.44ab 0.157
Bt+Th+C 0.79bc 19.44b 100.0a 29.89a 0.077
Bt+M+Th+C 0.98bc 25.00ab 100.0a 24.44ab 0.126
a
TA= tanpa agens; Bt= Botryodiplodia theobromae; M= Mikoriza arbuskular; C= Kitosan; Th= Trichoderma harzianum.
1
Rataan pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan Uji Nilai Tukey pada taraf nyata 5%.
12
Kejadian penyakit busuk pangkal batang pada perlakuan tanpa inokulasi patogen dan agens hayati menunjukkan nilai yang berbeda nyata dengan perlakuan lainnya. Hal tersebut menunjukkan bahwa tanaman memiliki ketahanan yang baik sehingga dari awal hingga akhir pengamatan tidak terinfeksi patogen. Hasil pengamatan kejadian penyakit busuk pangkal batang hingga minggu terakhir (63 hsi) menunjukkan bahwa kejadian penyakit pada semua perlakuan mencapai 100%.
Periode laten yang paling cepat terjadi pada perlakuan inokulasi patogen tanpa agens hayati, yaitu 19.89 hsi. Perlakuan tersebut menunjukkan nilai yang berbeda nyata dengan perlakuan tunggal mikoriza arbuskular dan T.harzianum, perlakuan kombinasi mikoriza arbuskular dan kitosan, serta perlakuan kombinasi
T.harzianum dan kitosan. Semakin lama periode laten, menunjukkan semakin baik pengaruh perlakuan agens hayati terhadap perkembangan patogen.
Laju infeksi pada perlakuan inokulasi patogen tanpa agens hayati memiliki nilai yang paling tinggi di antara perlakuan lainnya, yaitu 0.219. Nilai laju infeksi pada pengamatan memiliki nilai di bawah 0.5. Nilai laju infeksi yang kecil tersebut menunjukkan bahwa perkembangan gejala penyakit berjalan dengan lambat. Selain itu, adanya perlakuan agens hayati pada tanaman diduga dapat menghambat perkembangan patogen sehingga tanaman dengan perlakuan agens hayati memiliki nilai laju infeksi yang lebih rendah dibandingkan dengan tanaman tanpa perlakuan agens hayati. Nilai rata-rata laju infeksi setiap perlakuan yang lebih rendah dari 0.5 dapat disebabkan oleh varietas inang yang tahan dan faktor lingkungan internal serta eksternal yang tidak mendukung perkembangan patogen (Manengkey dan Senewe 2011). Kondisi rumah kaca yang terlalu panas dan kering diduga menjadi salah satu faktor kecilnya nilai laju infeksi. Berdasarkan pengamatan, rata-rata suhu dalam rumah kaca mencapai 350C dengan kelembaban rata-rata 50% pada siang hari. Kelembaban yang rendah dapat menyebabkan terhambatnya pertumbuhan patogen sehingga luas gejala penyakit yang muncul menjadi kecil dan laju infeksinya menjadi lambat.
Pengamatan tinggi tajuk tanaman dilakukan saat pindah tanam dan akhir pengamatan (63 hsi). Pengamatan tinggi tajuk dilakukan untuk mengetahui pengaruh mikoriza arbuskular, T.harzianum, dan kombinasinya dalam memperbaiki vigor tanaman. Pertumbuhan tajuk tanaman terlihat lebih baik jika diinfestasikan mikoriza arbuskular, T.harzianum, dan kombinasinya. Hal tersebut terlihat dari pertambahan tinggi tajuk tanaman yang semakin besar. Pertambahan tinggi tajuk tanaman menunjukkan bahwa agens yang diinfestasikan pada tanaman dapat berpengaruh terhadap pertumbuhan tanaman. Namun demikian, berdasarkan hasil pengamatan pertambahan tinggi tajuk tanaman terbesar terdapat pada perlakuan tunggal mikoriza arbuskular. Pemberian mikoriza mampu meningkatkan ketersediaan hara mineral bagi tanaman, baik berupa unsur makro maupun mikro, terutama meningkatkan ketersediaan fosfor dan nitrogen bagi tanaman yang terinfeksi (Yuliawati 2002).
Rerata tinggi tajuk tanaman dan jumlah tunas baru tertinggi terdapat pada perlakuan tunggal mikoriza, sedangkan nilai terendah pada perlakuan patogen tanpa agens (Tabel 3). Perhitungan jumlah tunas dilakukan pada akhir pengamatan (63 hsi). Tunas sudah mulai tumbuh pada pengamatan 14 hsi namun beberapa mengalami kerontokan. Rontoknya tunas-tunas tersebut diduga karena kondisi
13 rumah kaca yang terlalu panas, sehingga tanaman merontokkan tunas mudanya untuk mengurangi penguapan.
Tabel 3. Pengaruh agens terhadap rata-rata pertambahan tinggi tanaman dan jumlah tunas baru yang tumbuh
Perlakuan Rata-rata pertambahan tinggi tanaman pada 63 hsi (cm)
Rata-rata jumlah tunas baru pada 63 hsi
TA-Bt 10.07 2.89 TA+Bt 9.27 2.56 Bt+M 22.44 7.56 Bt+C 16.22 3.67 Bt+Th 10.66 3.00 Bt+M+C 17.99 7.00 Bt+M+Th 15.31 4.56 Bt+Th+C 15.84 5.00 Bt+M+Th+C 13.90 4.33 a
TA= tanpa agens; Bt= Botryodiplodia theobromae; M= Mikoriza arbuskular; C= Kitosan;
Th= Trichoderma harzianum.
Gambar 4 Tunas muda yang baru muncul pada pengamatan 14 hsi (a) dan tunas yang tumbuh (b) hingga 63 hsi
Tabel 4 menunjukkan tingkat asosiasi mikoriza arbuskular dalam jaringan akar jeruk. Tingkat asosiasi tertinggi berada pada tanaman dengan pemberian perlakuan tunggal mikoriza arbuskular di perakaran dan berbeda nyata dengan perlakuan mikoriza yang dikombinasikan dengan agens lain. Semakin besar tingkat asosiasi mikoriza menunjukkan semakin besar pula pengaruh mikoriza arbuskular terhadap vigor dan penghambatan perkembangan penyakit.
Asosiasi mikoriza juga ditemukan pada perlakuan tanpa mikoriza arbuskular. Adanya kolonisasi tersebut diduga karena terbawa dari tanah sebelumnya atau kolonisasi telah terbentuk sebelum bibit di pindah tanamkan. Selain itu, spora mikoriza juga bisa terbawa pada tanah steril yang digunakan selama pengamatan. Spora–spora endomikoriza dapat dorman di alam dan fase dormansinya dapat terpatahkan pada saat proses sterilisasi tanah (suhu 105oC) sehingga spora mikoriza akan berkecambah pada media tanah dan mengkolonisasi akar.
14
Tabel 4 Pengaruh perlakuan mikoriza arbuskular, kitosan, T.harzianum, dan kombinasinya terhadap tingkat asosiasi mikoriza arbuskular
Perlakuana
Asosiasi Mikoriza Arbuskular
Kolonisasi Mikoriza (%)1 Panjang akar terkolonisasi (cm) TA-Bt 00.00c 0.00 TA+Bt 00.00c 00.00 Bt+M 37.12a 35.63 Bt+C 00.97c 05.12 Bt+Th 01.13c 05.76 Bt+M+C 36.50a 35.20 Bt+M+Th 28.34b 31.14 Bt+Th+C 00.85c 04.91 Bt+M+Th+C 27.45b 30.29 a
TA= tanpa agens; Bt= Botryodiplodia theobromae; M= Mikoriza arbuskular; C= Kitosan; Th= Trichoderma harzianum.
1
Rataan pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan Uji Nilai Tukey pada taraf nyata 5%.
Besarnya tingkat asosiasi mikoriza didukung dengan ditemukannya struktur mikoriza arbuskular yang terdapat dalam jaringan akar (Gambar 5). Tingkat asosiasi mikoriza ditentukan dari kemampuan mikoriza arbuskular dalam mengkoloni akar jeruk. Asosiasi mikoriza dalam akar ditandai dengan adanya warna lebih gelap pada jaringan akar. Apresorium terbentuk dari spora mikoriza yang kemudian tumbuh dan menembus dinding sel akar kemudian hifa menyebar dan mengkolonisasi dalam jaringan akar. Hifa mikoriza tersebar secara inter maupun intraseluler dalam korteks akar dan membentuk struktur khas di dalam sel akar, yaitu arbuskular dan vesikel (Brundrett 2004).
Gambar 5 Bentuk asosiasi mikoriza pada akar sekunder jeruk. Jaringan akar yang terinfeksi mikoriza (a), jaringan akar yang tidak terinfeksi mikoriza (b), hifa mikoriza yang tersebar dalam korteks (c-d), struktur vesikel mikoriza (e) struktur arbuskula (f).
15 Adanya kolonisasi mikoriza arbuskular tersebut menyebabkan jaringan akar menjadi kuat. Mikoriza dapat berperan sebagai barier akar sehingga tidak mudah diinfeksi patogen tular tanah. Selain itu, Hifa mikoriza juga dapat berperan sebagai serabut akar sehingga dapat memperluas permukaan akar untuk penyerapan unsur hara dalam tanah. Fungi mikoriza arbuskular (FMA) berasal dari golongan endomikoriza. Endomikoriza membentuk struktur khas di dalam sel akar, yaitu arbuskular dan vesikel. Arbuskular adalah hifa bercabang yang berkembang di dalam sel korteks akar. Fungsi dari arbuskular adalah sebagai jembatan transfer unsur hara antar inang dan mikrosimbion. Vesikel adalah struktur mikoriza yang terbentuk setelah pembentukan arbuskular pada ujung hifa, di dalam vesikel terdapat nutrisi cadangan bagi FMA saat penyuplaian metabolit dari tanaman (Brundrett 2004).
16