SECARA IN VITRO
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahap sterilisasi merupakan langkah awal untuk mendapatkan kultur asenik (steril). Bahan tanam berupa shoot tip diperoleh dari anakan sagu dengan bobot 2.5-4 kg dan diperkirakan berumur 1-2 tahun. Shoot tip merupakan tunas termuda yang disusun oleh jaringan meristem yang aktif membelah.
Ukuran shoot tip tanaman sagu yang digunakan sekitar lebar 2.5 cm dan panjang 4 cm. Eksplan berupa shoot tip tanaman sagu diberi perlakuan sterilisasi. Perlakuan sterilisasi menggunakan clorox dengan konsentrasi 10, 20, dan 30% telah dilakukan. Kombinasi bahan sterilan berupa fungisida, bakterisida dan antibiotik juga telah dilakukan, namun persentase eksplan steril yang tinggi belum diperoleh.
Permasalahan yang dihadapi yaitu bahan sucker (anakan tanaman sagu) yang digunakan telah terinfeksi cendawan, sehingga sulit mendapatkan eksplan steril sebagai bahan untuk perlakuan embriogenesis dan organogenesis. Penggunaan bahan sterilan berupa antibiotik telah dilakukan, namun belum memberikan hasil yang maskimal. Berbagai metode sterilisasi dan perolehan kultur asenik disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Metode sterilisasi menggunakan eksplan shoot tip No Kegiatan ∑ Eksplan awal ∑ Eksplan steril Eksplan steril (%) 1 Sterilisasi 1: Luar : Detergen 100 g.L-1 30 m, clorox 30% 30 m, fungi sida +bakterisida 2 g.L-1 15 m Dalam : Clorox 5% 10 m 7 eksplan Kontaminasi cendawan dan bakteri 0% 2 Sterilisasi 2: Luar : Detergen 100 g.L-1 15 m, fungisida+bakteri sida 2 g.L-1 30 m, bilas dan shaker dengan aquades 10 m, clorox 10% 25 m Dalam : Clorox 5% 10 m 40 eksplan (2 tahap sterilisasi) Sagu berduri dan Sagu molat
Kontaminasi cendawan dan bakteri (5 HST) 0% 3 Sterilisasi 3: Luar :
Detergen cair 100ml.L-1 20 m, fungisida + bakteri sida 2g.L-1 30 m, amoxilin 5 mg/125mg 15 m, clorox 30% 15 m Dalam : Clorox 20% 5 m 40 eksplan (2 tahap sterilisasi) Sagu berduri dan Sagu molat
Eksplan (browning) amoxilin, Kontaminasi bakteri 0% 4 Sterilisasi 4: Luar :
Detergen cair 100ml.L-1 15 m, fungisida+ bakteri sida 2g.L-1 30 m, clorox 30% 20 m Dalam :
Fungisida+bakterisida 2g.L-1 10 m, clorox 20% 5 m, eksplan dibersihkan dengan pisau di dalam laminar, fungisida+bakterisida 2g.L-1 20 m, iodine 3 tetes/50 ml 33 eksplan Bakteri Sterlisasi ulang bakteri putih tetap ada. 0% 5 Sterilisasi 5: Luar :
Detergen 100 gr.L-1 2 j, kupas kulit, air mengalir fungisida+bakterisida1 + strep 3g.L-1 15 m
Dalam :
HgCl 2g.L-1, clorox 20% tisu steril, belah, tanam 10 eksplan leuwiliang Sterilisasi ulang tetap kontaminasi bakteri 0% 6 Sterilisasi 6: Luar :
Detergen 120 m, sikat bagian coklat dengan air mengalir, bilas dengan air mengalir 30 m, fungisida + bakterisida 2 g.L-1 60 m bilas air mengalir
33 eksplan Sterilisasi ulang tetap kontam bakteri 0% Dalam:
Clorox 30% + 170 ml air steril 15 m, kupas kulit berwarna coklat, bilas air steril 3 kali, clorox 10% + 190 ml air steril 30 m, bilas air steril 3 kali, Iodine 5 tetes 5 m, bilas/tanpa bilas air steril 3 kali, ekplan dibelah 2 bagian, keringkan dengan tissue steril, tanam
24
Tabel 2 Metode sterilisasi menggunakan eksplan shoot tip (lanjutan)
No Kegiatan ∑ Eksplan awal ∑ Eksplan steril Eksplan steril (%) 7 Sterilisasi 7: Luar :
Detergen cair 30ml.L-1 30 m, shaker manual, sikat kulit yang menghitam karena getah sampai bersih, bersihkan di air mengalir sampai bersih, fungisida+bakteri sida 2g.L-1 60 m,{10 shaker}, {11 tanpa shaker})
Dalam :
Iris tipis bagian yang menghitam, clorox 20% 10 menit, clorox 10% 5 m, iodine 60 tetesL-1 5 m, bilas air steril, tanam
21 eksplan Sterilisasi ulang tetap kontam bakteri 0% 8 Sterilisasi 8: Luar :
Detergen 10 g/600 ml, kupas bagian hitam + bilas 3x
Dalam :
1) Cloramfenicol 1 capsul/600ml 1 j Shaker air bersih 15 m
Dalam :
Clorox 20% 10 m
Belah + alkohol + bakar, tanam Belah + vitamin c 1
tablet/100ml 15 m, tanam 2) Rimpaficin 1 capsul/600ml 1 j, shaker air
bersih 15 m Dalam :
Clorox 20% 10 m
Belah + alkohol + bakar, tanam Belah + vitamin c 1
tablet/100ml 15 m, tanam 3) Fungisida +bakterisida 2g/600ml 1 j, shaker
air bersih 15 m Dalam :
Kupas bagian hitam sampai bersih, clorox 20% 10 m, vitamin c 1 tablet/100ml 15 m
Belah, tanam
Belah + alkohol + bakar, tanam
4 eksplan 4 eksplan 4 eksplan Sterilisasi ulang tetap kontaminasi bakteri Eksplan steril 0 Eksplan steril 2 Eksplan steril 0 0% 50% 0% 9 Sterilisasi 9: Luar :
Eksplan besar, detergen 20 gL-1, fungisida + bakterisida 2 g/600ml 1 j Dalam : Sterilisasi ulang tetap kontaminasi bakteri 1) Cloramfenicol 1 capsul/600ml 15 m Dalam :
Kupas sampai besaran tanam, clorox 4ml/ 30ml 10 m,
Belah eksplan, lap tisu, tanam Eksplan utuh, belah, lap tisu, tanam
Eksplan utuh, belah + alkohol + bakar, tanam
Tabel 2 Metode sterilisasi menggunakan eksplan shoot tip (lanjutan) Kegiatan ∑ Eksplan awal ∑ Eksplan steril Eksplan steril (%) 2) Rimpaficin 1 capsul/600ml 15 m Dalam :
Kupas sampai besaran tanam, vitamin c 1 tablet/100ml 15 m
Belah, alkohol, bakar, tanam Belah, tanam
6 eksplan Steril 0 0%
Sterilisasi 10: Luar :
Detergen 1 j, kupas bagian hitam, cloram fenicol 1 tablet/600ml, rimpaficin 1 kapsul/ 600ml, fungisida+bakterisida 2 g/600ml, bilas air bersih
Dalam :
Dikupas kecil, HgCl 0.1g/50ml 3 m, clorox 10% 15 m, clorox 10% 10 m, tanam
6 eksplan utuh Sterilisasi ulang tetap kontaminasi bakteri
0%
Eksplan yang sudah disterilisasi ditanam pada media MS (media prakondisi) untuk perkembangan selanjutnya. Penanaman eksplan pada media MS tersebut dimaksudkan untuk mendapatkan eksplan yang tetap steril dalam jangka waktu 2 MST (minggu setelah tanam), kemudian dapat ditanam pada media perlakuan. Eksplan yang berasal dari shoot tip mulai terkontaminasi bakteri (Gambar 2).
Setelah 2 MST, eksplan yang telah steril dibelah menjadi 2 bagian untuk memperoleh eksplan yang lebih banyak. Pembelahan eksplan juga bertujuan jaringan meristem pada titik tumbuh shoot tip dapat segera tumbuh ketika menyentuh media tanam. Dengan demikian, perlakuan tahap induksi kalus dapat segera dilakukan setelah 4 MST. Eksplan asal shoot tip yang tetap steril hingga 3 BST (Gambar 3).
Keberhasilan tahap sterilisasi dilihat dari tingginya persentase eksplan yang steril, kemudian eksplan tersebut diberi perlakuan induksi kalus. Namun demikian, keseluruhan tahap sterilisasi untuk shoot tip dengan menggunakan berbagai sterilan (antibiotik, clorox, dan HgCl) belum mampu menghasilkan persentase eksplan steril yang tinggi. Hal tersebut diduga disebabkan eksplan dari kebun sudah membawa penyakit terbawa bibit. Oleh karena itu, meskipun ekplan yang ditanam pada media prakondisi sudah terlihat steril selama 2 MST, namun ketika dilkukan pembelahan untuk masuk ke media perlakuan kontaminasi bakteri
Gambar 2Eksplan asal shoot tip yang terkontaminasi bakteri
26
dan cendawan kembali muncul. Secara umum, kontaminasi yang ditemukan berasal dari cendawan dan bakteri.
Tanaman tingkat tinggi, seperti sagu, memiliki kecenderungan menghasilkan senyawa fenolik yang lebih banyak. Pada umumnya, senyawa fenolik yang teroksidasi pada kultur jaringan menyebabkan kematian jaringan (Arnaldos et al. 2001). Browning merupakan kendala utama pada kultur jaringan secara in vitro. Eksplan daun muda sagu yang ditanam pada media induksi kalus 2.4-D 100 mgL-1 yang dikombinasikan dengan 2-iP (1, 3, 5 mgL-1) belum mampu menginisiasi kalus dari ekplan tersebut sampai dengan 4 BST. Pada 5 BST, eksplan mengalami pencoklatan yang disebabkan senyawa fenolik yang dihasilkan eksplan itu sendiri. Eksplan yang berasal dari daun muda yang mulai sedikit kecoklatan (Gambar 4).
Senyawa fenolik yang dihasilkan oleh eksplan dan teroksidasi di media kultur merupakan penyebab eksplan mengalami browning. Senyawa tersebut mampu menghambat aktivitas enzim dan mengakibatkan pencoklatan media yang kemudian berdampak pada kematian jaringan (Laukkanen et al. 1999). Konsentrasi senyawa fenolik tersebut dipengaruhi oleh beberapa bahan organic, terutama karbohidrat yang ditambahkan pada media (Lux-Endrich et al. 2000).
Gambar 3 Eksplan steril asal shoot tip
Gambar 4 Eksplan steril daun muda
Tunas dari eksplan shoot tip
Ketidakmampuan eksplan yang berasal dari daun muda untuk menghasilkan kalus disebabkan karena konsentasi zat pengatur tumbuh yang diberikan (eksogen) belum dapat mengubah konsentrasi zat pengatur tumbuh endogen. Skirvin et al. (1994) menyatakan bahwa faktor-faktor penunjang terjadinya keragaman selama kultur jaringan adalah jenis eksplan, pemilihan kultivar dan umur kultivar, level ploidi, metode dan kondisi spesifik dari kultur termasuk zat pengtur tumbuh, tekanan seleksi, lamanya waktu in vitro dan kecepatan proliferasi, sedangkan Karp (1995) menyatakan bahwa terdapat empat faktor yang menyebabkan keragaman dalam kultur in vitro yaitu 1) derajat awal dari pertumbuhan meristematik, 2) konstitusi genetik, 3)zat pengatur tumbuh pada media, dan 4) sumber jaringan.
Induksi embriogenesis somatik pada tumbuhan monokotil, kebanyakan diperoleh dari eksplan generatif. Eksplan generatif misalnya biji (n). Sementara itu, sebaliknya pada tanaman dikotil, kebanyakan induksi embriogenesis somatik didapatkan dari eksplan vegetatif, seperti daun. Eksplan daun secara umum diaplikasikan untuk memperoleh embrio somatik yang pada akhirnya dihasilkan planlet. Eksplan dari tanaman orchard grass embrio somatik terbentuk melalui pembentukan kalus ebriogenik dengan penambahan auksin kuat, seperti dicamba (Bhojwani dan Razdan 1983).
Periode sub kultur dapat memberikan pengaruh negatif pada eksplan. Selain itu jumlah eksplan dalam satu botol kultur juga berpengaruh pada kematian jaringan. Jumlah eksplan yang semakin banyak dengan tingkat senyawa fenolik semakin meningkat, maka kemungkinan kematian jaringan juga akan semakin besar. Menurut Sukendah (2009) periode subkultur yang lebih sering akan mempercepat pertumbuhan dan meningkatkan jumlah planlet pada kelapa kopyor.
Simpulan
Penelitian mengenai embriogenesis dan organogenesis pada tanaman sagu belum memperoleh hasil yang optimal. Proses sterilisasi untuk mendapatkan persentase eksplan steril yang tinggi masih harus diusahakan. Rendahnya perolehan eksplan steril dari penelitian yang telah dilakukan diduga disebabkan adanya penyakit terbawa eksplan (shoot tip) dari pengambilan bibit di lapangan, sedangkan eksplan daun muda tidak mengalami masalah dalam proses sterilisasi. Daya regenerasi eksplan yang berasal dari daun muda sangat lambat. Sampai dengan akhir pengamatan 4 bulan setelah tanam, eksplan dari daun muda belum memberikan perubahan pada ukuran dan bentuk. Konsentrasi zat pengatur tumbuh yang diberikan yaitu 100 mgL-1 2.4-D yang dikombinasikan dengan 2-iP belum mampu mengubah konsentrasi ZPT endogen dari eksplan daun muda sagu.
PENGARUH JENIS AUKSIN DAN BOBOT SUCKER TERHADAP