Hasil
Persiapan Bahan dan Pembuatan Simplisia
Bahan yang digunakan adalah daun binahong segar sebanyak 400 gram kemudian setelah proses pengeringan diperoleh daun kering sebanyak 50 gram. Daun kering dihaluskan menjadi serbuk (simplisia) dan diperoleh serbuk kering sebanyak 50 gram.
Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan secara maserasi. Ekstrak yang diperoleh berupa ekstrak pekat berwarna cokelat tua dengan bau seperti jamu sebanyak 20 gram. (Lampiran 4).
Skrining Fitokimia
Berdasarkan skrining fitokimia didapatkan hasil bahwa ekstrak mengandung senyawa metabolit sekunder yaitu fenolik, flavonoida, terpenoida/steroida (triterpenoida dan β-sitosterol), alkaloid dan saponin seperti pada Tabel 1 dan hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada Gambar 2.
Tabel 1. Hasil skrining fitokimia metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak daun binahong (A. cordifolia)
Skrining fitokimia Pereaksi Hasil
Fenolik FeCl3 +++
Steroid/Terpenoid Libermann-Bouchard +++ Cerium sulfat (CeSO4)
Triterpenoid (TLC) + β-sitosterol (TLC) + Alkaloid Bouchardat - Wagner - Mayer - Dragendroff ++
Saponin Aquades-HCl +++ Keterangan :
+ : berubah warna (reaksi positif) berlangsung lama pada penambahan pereaksi tetes pertama.
++ : berubah warna (reaksi positif) berlangsung perlahan-lahan pada penambahan pereaksi pertama kali tetes (diperkirakan 1 tetes = 0,05 ml). +++ : langsung berubah warna (reaksi positif) pada penambahan pereaksi
pertama kali tetes (diperkirakan 1 tetes = 0,05 ml).
Gambar 2. Ekstrak daun binahong yang mengandung senyawa (A) triterpenoid/steroid, (B) saponin, (D) alkaloid, (F) fenolik
Berdasarkan hasil skrining fitokimia fenolik (Tabel 1) diperoleh reaksi positif terhadap pereaksi FeCl3 ditandai adanya warna hitam. Menurut Nugrahaningtyas (2005) pereaksi FeCl3 merupakan pereaksi spesifik untuk senyawa yang merupakan turunan dari fenol, dan flavonoid yang merupakan turunan dari fenol. Untuk menguji adanya flavonoid dengan pereaksi FeCl3 1% dan diperoleh hasil positif flavonoida ditandai adanya perubahan warna menjadi hitam seperti pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil uji fenolik dan flavonoida menunjukkan adanya senyawa fenolik dan flavonoida ditandai perubahan warna hijau ekstrak asli (A) menjadi warna hitam (B dan C)
Hasil skrining fitokimia steroid/terpenoid (Tabel 1) diperoleh hasil positif terhadap pereaksi Liebermann-Bouchard ditandai dengan adanya perubahan warna biru-kehijauan dan adanya reaksi positif pada pereaksi Liebermann-Bouchard menunjukkan adanya senyawa steroid/terpenoid. Selanjutnya ekstrak di uji dengan metode TLC menggunakan pereaksi CeSO4 1% untuk mengetahui golongan steroid dan terpenoid. Hasil yang diperoleh yaitu positif triterpenoida dan β-sitosterol ditandai dengan adanya perubahan warna pada ekstrak yang menyerupai warna standar triterpenoida dan β-sitosterol seperti pada Gambar 4.
Gambar 4. Hasil uji TLC pada ekstrak daun binahong yang menunjukkan adanya senyawa triterpenoida dan β-sitosterol
Hasil skrining fitokimia alkaloid (Tabel 1) diperoleh hasil negatif (tidak ada perubahan warna) pada pereaksi Bouchardat, pereaksi Wagner, pereaksi Mayer, tetapi bereaksi positif pada pereaksi Dragendroff ditandai adanya endapan seperti pada Gambar 5A.
Hasil skrining fitokimia saponin (Tabel 1) diperoleh hasil positif ditandai dengan adanya buih stabil selama 10 menit dengan ketinggian 1-10 cm dan buih tidak hilang jika ditambahkan 1 tetes (0,05 ml) HCl 2N. Hasil skrining fitokimia saponin dapat dilihat pada Gambar 5B.
A B
Gambar 5. Hasil skrining fitokimia : (A) alkaloid dengan pereaksi Dragendroff menunjukkan adanya endapan dan (B) saponin menunjukkan adanya buih.
Analisis Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila
Hasil analisis kriteria bakteri A. hydrophila menunjukkan bahwa kultur murni bakteri merupakan bakteri A. hydrophila. Hasil analisis bakteri dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil analisa kriteria bakteri A. hydrophila
Uji Hasil
Pewarnaan Gram Gram negatif, bentuk batang pendek
Uji Motilitas Motil
Uji Oksidase Positif Oksidatif
Uji Oksidatif/Fermentatif Positif O/F
Uji RS Positif RS
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan sifat bakteri Gram negatif ditandai dengan sel bakteri berwarna merah/pink. Hal ini karena bakteri Gram negatif melepaskan warna pertama ungu crystal violet dan mengikat zat warna kedua yaitu safranin (countestain) (Kumala, 2006). Hasil pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bakteri Gram negatif dengan
adanya sel bakteri berwarna merah.
Hasil uji O/F menunjukkan adanya reaksi fermentatif/oksidatif dengan perubahan warna kuning pada kedua tabung baik yang berisi parafin maupun tidak berisi parafin seperti pada Gambar 7.
Gambar 7. Hasil uji motilitas dan uji O/F menunjukkan reaksi positif pada uji motilitas ditandai tidak terlihat bekas tusukkan (A) dan reaksi fermentatif/oksidatif pada uji O/F ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning (B dan C).
Hasil uji oksidase menunjukkan adanya reaksi oksidase positif ditandai dengan adanya warna biru keunguan pada goresan kertas oksidase seperti pada Gambar 8.
Gambar 8. Hasil uji oksidase menunjukkan reaksi positif oksidase ditandai dengan warna biru-keunguan pada goresan di kertas oksidase.
Hasil uji Rimmler-Shoots (RS) menunjukkan hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan koloni yang berwarna kuning seperti pada Gambar 9.
Gambar 9. Hasil uji RS menunjukkan hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan koloni bakteri berwarna kuning.
Pengujian Antibakteri
Pengujian antibakteri menggunakan metode difusi disk menggunakan kertas cakram dengan diameter 6 mm. Pengamatan dilakukan setelah masa inkubasi selama 24 jam dan diperoleh hasil sebagai berikut yang terdapat pada Tabel 3 dan Gambar 10.
Tabel 3. Hasil pengukuran diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila
Konsentrasi Larutan Uji (%)
Diameter Zona Hambat (mm) Rata-Rata Diameter Zona
Hambat (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3
0 Aquades Steril (Kontrol negatif) 0 0 0 0 Oksitetrasiklin (Kontrol positif) 27,4 27,6 27,4 27,5 0,2 8,1 8,6 8,5 8,4 0,4 9,2 9,6 9,4 9,4 0,6 10,3 10,5 10,7 10,5 0,8 12,4 11,6 11,6 11,9
Gambar 10. Hasil zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila
Pembahasan
Hasil pengukuran diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap bakteri A. hydrophila menunjukkan kertas cakram yang tidak mengandung ekstrak daun binahong (kontrol negatif dengan akuades) tidak terhambat, terbukti dari diameter zona bening/hambat 0 mm diakibatkan karena akuades tidak memilki zat aktif yang mampu menghambat bakteri. Kertas cakram yang mengandung antibiotik oksitetrasiklin (kontrol positif) menunjukkan zona hambat yang luas. Oksitetrasiklin merupakan antibiotik bagian dari golongan Tetrasiklin. Tetrasiklin merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat menghambat sintesis protein (Katzung, 2004). Kertas cakram yang mengadung ekstrak daun binahong dengan konsentrasi berbeda menunjukkan hasil diameter zona hambat yang juga berbeda. Diameter zona hambat terkecil diperoleh pada konsentrasi ekstrak daun binahong 0,2 % (8,4 mm) dan yang terbesar 0,8 % (11,9 mm).
Hasil diameter zona hambat yang terbentuk menunjukkan semakin bertambah konsentrasi ekstrak daun binahong yang digunakan, maka kemampuan ekstrak dalam menghambat pertumbuhan bakteri juga semakin meningkat.
Hasil pengukuran diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila kemudian dianalisis secara statistik dengan Analisis Sidik Ragam. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil analisis sidik ragam diameter zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila
Sumber Keragaman Derajat Bebas Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F Hitung F Tabel 5% 1% Ulangan 2 0.02 0.01 0.14 4.10 7.56 Konsentrasi 5 1206.08 241.22 3294.31** 3.33 5.64 Galat 10 0.73 0.073 Total 17 1206.84
Keterangan: ** = sangat nyata
Berdasarkan hasil analisis sidik ragam zona hambat ekstrak daun binahong terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila dapat dinyatakan bahwa konsentrasi ekstrak daun binahong memberikan pengaruh sangat nyata (P > 0,01) terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
Analisis terhadap perbedaan diameter zona hambat berbagai konsentrasi ekstrak daun binahong terhadap bakteri A. hydrophila dapat dilanjutkan dengan uji Dunnett dengan membandingkan diameter zona hambat yang terbentuk pada
berbagai konsentrasi dengan kontrol positif dan kontrol negatif. Hasil perhitungan uji Dunnett dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil uji Dunnett diameter zona hambat berbagai konsentrasi ekstrak daun binahong terhadap kontrol positif dan kontrol negatif
Konsentrasi
Rata-rata Rendemen
Beda dengan Kontrol negatif
Beda dengan kontrol positif Akuades (Kontrol Negatif) 0 - -27.5tn Oksitetrasiklin (Kontrol Positif) 27.5 27.5 - 0.2 8.4 8.4** -19.1tn 0.4 9.4 9.4** -18.1tn 0.6 10.5 10.5** -17.0tn 0.8 11.87 11.87** -15.6tn d0.05 = 0.56 d0.01 = 0.78 d0.01 = 0.78 Keterangan : tn = tidak nyata
** = sangat nyata
Hasil analisis uji Dunnett menunjukkan bahwa berbagai konsentrasi ekstrak daun binahong ( 0,2 %; 0,4 %; 0,6 %; 0,8%) mempunyai perbedaan yang sangat nyata terhadap kontrol negatif yaitu kertas cakram yang diberi akuades yang dapat dilihat dari semua nilai konsentrasi ekstrak daun binahong (P > 0,01). Sedangkan konsentrasi ekstrak daun binahong ( 0,2 %; 0,4 %; 0,6 %; 0,8%) menunjukkan hasil tidak nyata terhadap kontrol positif yaitu kertas cakram yang
diberi oksitetrasiklin dapat dilihat dari nilai konsentrasi ekstrak daun binahong (P < 0,01).
Kertas cakram yang diberi berbagai konsentrasi larutan dibandingkan dengan kertas cakram yang diberi akuades menunjukkan ekstrak daun binahong dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang dipengaruhi senyawa metabolit sekunder yang terkandung didalamnya, seperti flavonoid, fenolik, alkaloid, saponin, triterpenoid dan β-sitosterol.
Flavonoid dapat berperan langsung sebagai antibiotik dengan menggangu fungsi kerja dari mikroorganisme seperti bakteri (Manoi, 2009). Flavonoid yang telah di uji secara in vitro lebih efektif sebagai zat antimikroba terhadap berbagai macam mikroorganisme. Flavonoid lipofilik juga dapat mengganggu membran mikroba (Tsuchiya, dkk, 1996). Menurut Robinson (1991) saponin dapat bekerja sebagai antimikroba. Menurut Murphy (1999) alkaloid merupakan golongan senyawa nitrogen heterosiklik. Alkaloid juga memiliki sifat antibakteri, karena memiliki kemampuan menginterkalasi DNA. Adanya senyawa fenol juga dapat mempengaruhi daya hambat bakteri. Senyawa fenol bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel dan merusak dinding sel bakteri tanpa dapat diperbaiki lagi sehingga pertumbuhan bakteri terhambat (Pelczar dan Chan, 1988).
Kertas cakram yang mengandung Oksitetrasiklin digunakan sebagai kontrol positif berfungsi sebagai kontrol bakteri yang di tanam apakah benar terhambat atau tidak dan sebagai pembanding untuk perlakuan lain (Darsana, dkk., 2012). Daerah bening yang terbentuk disekitar kertas cakram menunjukkan bakteri mengalami penghambatan dan zona bening ini menunjukan bahwa pertumbhan bakteri terhambat.
Hasil uji in vitro ekstrak daun binahong terhadap bakteri A. hydrophila menunjukkan bahwa ekstrak daun binahong dapat menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila penyebab penyakit pada ikan. Hasil penelitian dapat dilihat bahan alami yaitu daun binahong dapat dijadikan alternatif dalam pengobatan ikan karena daun binahong dapat menghambat pertumbuhan bakteri penyebab penyakit ikan secara in vitro.