HASIL PENELITIAN
5.1. Gambaran Umum Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Stem Cell, Institute of Tropical Disease (ITD) Universitas Airlangga dalam kurun waktu Februari - Juli 2016 menggunakan purposive sampling terhadap penderita yanga memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Sebagai kontrol digunakan darah tepi sampel tersebut yang tidak diberikan perlakuan berupa pemberian statin. Sampel kemudian dibagi menjadi 10 kelompok. Ikhtisar pelakuan tiap kelompok adalah sebagai berikut:
X1 : sampel diberikan simvastatin 0.1 µmol/L X2 : sampel diberikan simvastatin 0.5 µmol/L X3 : sampel diberikan simvastatin 2.5 µmol/L X4 : sampel diberikan atorvastatin 0.1 µmol/L X5 : sampel diberikan atorvastatin 0.5 µmol/L X6 : sampel diberikan atorvastatin 2.5 µmol/L X7 : sampel diberikan rosuvastatin 0.1 µmol/L X8 : sampel diberikan rosuvastatin 0.5 µmol/L X9 : sampel diberikan rosuvastatin 2.5 µmol/L C : kelompok kontrol
Darah dipisahkan dengan Ficoll histopaque. Sel hasil pemisahan tersebut ditanamkan selama 3 hari untuk mendapatkan sel mononuklear. Sel mononuklear dihitung dan ditanamkan dengan jumlah yang sama pada setiap kelompok. Masing-masing kelompok kemudian diberikan perlakuan, dan pemeriksaan proliferasi EPC dilakukan 2 hari kemudian.
5.2. Karakteristik Subjek Penelitian
Subjek penelitian ini adalah 8 sampel darah. Karakteristik dasar subjek penelitian dapat dilihat pada tabel 5.1.
Variabel Rerata ± Simpang baku
Usia (tahun) 54,5 ± 4,31
Tekanan darah sistolik (mmHg) 137,5 ± 24,35
Tekanan darah diastolik (mmHg) 80 ± 7,56
Detak jantung (kali/menit) Indeks massa tubuh (kg/m2) Kolesterol total (mg/dL) LDL-kolesterol (mg/dL) Trigliserida (mg/dL) HDL- kolesterol (mg/dL) Fraksi ejeksi ventrikel kiri (%)
86 ± 8,68 25,39 ± 2,13 200,5 ± 74,75 145 ± 61,11 97 ± 11,64 35 ± 7,64 53,5 ± 4,11
Tabel 5.1. Karakteristik dasar subjek penelitian
Pada subjek penelitian didapatkan rerata usia 54,5 ± 4,31. Usia subjek termuda 48 tahun, dan tertua adalah 59 tahun. Faktor risiko kardiovaskular yang didapatkan pada subjek penelitian yaitu hipertensi dan dislipidemia. Seluruh subjek mendapat obat anti hipertensi dan statin golongan simvastatin. Rata-rata tekanan darah sistolik subjek yaitu 137,5 ± 24,35 mmHg, dan tekanan darah diastolik 80 ± 7,56 mmHg. Pemeriksaan lipid didapatkan rerata kolesterol total 200,5 ± 74,75 mg/dL, LDL-kolesterol 145 ± 61,11 g/dL, trigliserida 97 ± 11,64 mg/dL, dan HDL-kolesterol 35 ± 7,64 mg/dL. Hasil ekokardiografi menunjukkan rerata fraksi ejeksi ventrikel kiri subjek penelitian yaitu 53,5 ± 4,11 %.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.000 Kontrol Simvastatin 0.1 µmol/L 0,170 0,237
5.3. Proliferasi EPC antara Kelompok Simvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin, dan Kontrol
5.3.1. Perbandingan Proliferasi EPC antara Kelompok yang Diberikan Simvastatin dan Kontrol
Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok yang diberikan simvastatin dan kontrol dapat dilihat pada Gambar 5.1. Proliferasi EPC dikuantifikasi menggunakan metode MTT dan didapatkan hasil absorbansi sel dalam optical density (O.D). Perlakuan pada EPC sampel dan kontrol sesuai dengan kriteria kelompok eksperimen.
Gambar 5.1. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok Simvastatin dan kontrol
Proliferasi EPC pada kelompok yang diberikan simvastatin lebih tinggi daripada kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan proliferasi EPC dengan pemberian simvastatin. Setelah dilakukan uji signifikansi didapatkan nilai sebesar 0.000 menggunakan T test, berarti ada perbedaan yang bermakna antara proliferasi EPC kelompok yang tidak diberikan statin dan kelompok yang diberikan simvastatin.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.000 Kontrol Atorvastatin 0.1 µmol/L 0,170 0,248
5.3.2. Perbandingan Proliferasi EPC antara Kelompok yang Diberikan Atorvastatin dan Kontrol
Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok yang diberikan atorvastatin dan kontrol dapat dilihat pada Gambar 5.2.
Gambar 5.2. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok Atorvastatin dan kontrol
Proliferasi EPC pada kelompok yang diberikan atorvastatin lebih tinggi daripada kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan proliferasi EPC dengan pemberian atorvastatin. Setelah dilakukan uji signifikansi menggunakan T test didapatkan nilai sebesar 0.000, menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antara proliferasi EPC kelompok yang tidak diberikan statin dan kelompok yang diberikan atorvastatin.
5.3.3. Perbandingan Proliferasi EPC antara Kelompok yang Diberikan Rosuvastatin dan Kontrol
Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok yang diberikan rosuvastatin dan kontrol dapat dilihat pada Gambar 5.3.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.000 Kontrol Rosuvastatin 0.1 µmol/L 0,231 0,170
Gambar 5.3. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok Rosuvastatin dan kontrol
Proliferasi EPC pada kelompok yang diberikan rosuvastatin lebih tinggi daripada kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan proliferasi EPC dengan pemberian rosuvastatin. Setelah dilakukan uji signifikansi menggunakan T test didapatkan nilai sebesar 0.000, berarti ada perbedaan yang bermakna antara proliferasi EPC kelompok yang tidak diberikan statin dan kelompok yang diberikan rosuvastatin.
Hasil proliferasi EPC kelompok simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin dibandingkan dengan kelompok kontrol disimpulkan pada tabel di 5.1.
Proliferasi EPC Kelompok kontrol (Rerata ± simpang baku)
Proliferasi EPC Kelompok perlakuan (Rerata ± simpang baku)
p 0.019 ± 0.008 Simvastatin (0.237 ± 0.007) Atorvastatin (0.248 ± 0.01) Rosuvastatin (0.231 ± 0.008) 0.000 0.000 0.000 Tabel 5.2. Perbandingan proliferasi EPC antara kelompok
0.22 0.225 0.23 0.235 0.24 0.245 0.25 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.025 Rosuvastatin Simvastatin Atorvastatin 0.000 0.000 0.237 0.248 0.231
5.4. Perbedaan Proliferasi EPC antara Kelompok Simvastatin, Atorvastatin, dan Rosuvastatin
Perbedaan proliferasi EPC antara kelompok simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin tampak pada gambar 5.4.
Gambar 5.4. Perbedaan proliferasi EPC antara kelompok Simvastatin, Atorvastatin, dan Rosuvastatin
Hasil analisis ini menunjukkan perbedaan proliferasi EPC antara kelompok simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin. Proliferasi EPC pada kelompok simvastatin lebih tinggi daripada rosuvastatin dan kelompok atorvastatin lebih tinggi daripada simvastatin. Proliferasi EPC antar kelompok telah dilakukan uji statistik menggunakan ANOVA dan dilanjutkan dengan uji signifikansi dengan LSD. Didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok rosuvastatin dan simvastatin dengan nilai 0.025. Proliferasi EPC antara kelompok simvastatin dan atorvastatin juga berbeda bermakna dengan nilai signifikansi 0.000. Hasil analisis proliferasi EPC antara rosuvastatin dan atorvastatin juga menunjukkan hasil yang bermakna dengan nilai signifikansi sebesar 0.000.
0.225 0.23 0.235 0.24 0.245 0.25 0.255 0.26 0.265 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.016 Simvastatin 0.1 µmol/L Simvastatin 0.5 µmol/L Simvastatin 2.5 µmol/L 0.000 0.000 0.244 0.260 0.237
5.5. Perbedaan Proliferasi EPC Pada Dosis Rendah, Sedang, dan Tinggi dari Simvastatin, Atorvastatin, dan Rosuvastatin
5.5.1. Perbedaan Proliferasi EPC pada Simvastatin Dosis Rendah, Sedang, dan Tinggi
Pada kelompok simvastatin, perbedaan proliferasi pada dosis rendah, sedang, dan tinggi tampak pada gambar 5.5.
Gambar 5.5. Perbedaan proliferasi EPC pada Simvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi
Analisis ini menunjukkan ada perbedaan proliferasi EPC dengan pemberian simvastatin antara dosis rendah, sedang, dan tinggi. Proliferasi EPC antar kelompok telah dilakukan uji statistik menggunakan ANOVA dan dilanjutkan dengan uji signifikansi dengan LSD, didapatkan bahwa proliferasi EPC meningkat secara signifikan dengan pemberian simvastatin 0.5 µmol/L dibandingkan dengan dosis 0.1 µmol/L dengan nilai signifikansi 0.016, juga meningkat signifikan dengan dosis 2.5 µmol/L dibandingkan dengan 0.5 µmol/L dengan nilai sebesar 0.000. Perbandingan proliferasi EPC antara dosis 0.1 µmol/L dan 2.5 µmol/L juga berbeda bermakna dengan nilai 0.000.
0.235 0.24 0.245 0.25 0.255 0.26 0.265 0.27 0.275 0.28 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.000 Atorvastatin 0.1 µmol/L Atorvastatin 0.5 µmol/L Atorvastatin 2.5 µmol/L 0.000 0.000 0.263 0.274 0.248
5.5.2. Perbedaan Proliferasi EPC pada Atorvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi
Pada kelompok atorvastatin, perbedaan proliferasi pada dosis rendah, sedang, dan tinggi tampak pada gambar 5.6.
Gambar 5.6. Perbedaan proliferasi EPC pada Atorvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi
Analisis ini menunjukkan ada perbedaan proliferasi EPC dengan pemberian atorvastatin antara dosis rendah, sedang, dan tinggi. Setelah dilakukan uji statistik menggunakan ANOVA dan dilanjutkan dengan signifikansi dengan LSD, didapatkan bahwa proliferasi EPC meningkat secara signifikan dengan pemberian atorvastatin 0.5 µmol/L dibandingkan dengan dosis 0.1 µmol/L dengan nilai signifikansi 0.000, juga meningkat signifikan dengan dosis 2.5 µmol/L dibandingkan dengan 0.5 µmol/L dengan nilai sebesar 0.000. Perbandingan proliferasi EPC antara dosis 0.1 µmol/L dan 2.5 µmol/L juga berbeda bermakna dengan nilai 0.000.
0.224 0.226 0.228 0.23 0.232 0.234 0.236 0.238 0.24 0.242 0.244 Pr o li fer asi Sel (O.D ) 0.593 Rosuvastatin 0.1 µmol/L Rosuvastatin 0.5 µmol/L Rosuvastatin 2.5 µmol/L 0.000 0.000 0.244 0.260 0.237
5.5.3. Perbedaan Proliferasi EPC pada Rosuvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi
Pada kelompok rosuvastatin, perbedaan proliferasi pada dosis rendah, sedang, dan tinggi tampak pada gambar 5.7.
Gambar 5.7. Perbedaan proliferasi EPC pada Rosuvastatin dosis rendah, sedang, dan tinggi
Analisis ini menunjukkan ada perbedaan proliferasi EPC dengan pemberian rosuvastatin antara dosis rendah, sedang, dan tinggi. Ternyata setelah dilakukan uji statistik menggunakan ANOVA dan dilanjutkan dengan signifikansi dengan LSD, didapatkan bahwa proliferasi EPC meningkat tidak bermakna dengan pemberian rosuvastatin 0.5 µmol/L dibandingkan dengan dosis 0.1 µmol/L dengan nilai signifikansi 0.593, namun meningkat signifikan dengan dosis 2.5 µmol/L dibandingkan dengan 0.5 µmol/L dengan nilai sebesar 0.000. Perbandingan proliferasi EPC antara dosis 0.1 µmol/L dan 2.5 µmol/L juga berbeda bermakna dengan nilai 0.000.
5.6. Pemeriksaan CFU pada Kelompok Simvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin, dan Kontrol
Pengamatan dan kuantifikasi CFU dilakukan untuk menilai fungsi EPC yang hidup. Sel EPC yang berfungsi dengan baik cenderung akan membentuk koloni hingga akhirnya dapat berdiferensiasi menjadi sel endotel. Pengamatan dilakukan pada kelompok statin dengan dosis rendah dan dosis tinggi, serta kelompok kontrol pada hari ke-6. Gambar 5.8 hingga 5.11 menunjukkan gambaran mikroskopis CFU kelompok kontrol, simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin.
Gambar 5.8. Gambaran mikroskopis CFU kelompok kontrol
Gambar 5.9. Gambaran mikroskopis CFU kelompok simvastatin a. dosis 0.1 µmol/L b. dosis 2.5 µmol/L
b a
Gambar 5.10. Gambaran mikroskopis CFU kelompok atorvastatin a. dosis 0.1 µmol/L b. dosis 2.5 µmol/L
Gambar 5.11. Gambaran mikroskopis CFU kelompok rosuvastatin a. dosis 0.1 µmol/L b. dosis 2.5 µmol/L
Jumlah koloni yang terbentuk pada kelompok kontrol, simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin berbeda, seperti tampak pada tabel berikut.
Tabel 5.3. Jumlah CFU pada kelompok kontrol, simvastatin, atorvastatin, dan rosuvastatin
Jumlah koloni pada kelompok statin lebih tinggi daripada kelompok yang kontrol. Jumlah koloni yang terbentuk pada kelompok atorvastatin lebih banyak
Kelompok Jumlah CFU
Dosis 0.1 µmol/L Jumlah CFU Dosis 2.5 µmol/L Kontrol 34 Simvastatin 76 172 Atorvastatin 142 175 Rosuvastatin 109 210 a b b a
daripada kelompok simvastatin, dan kelompok rosuvastatin paling tinggi dibandingkan 2 kelompok lainnya.
5.7. Pemeriksaan Imunofluoresensi
CD34 merupakan salah satu marker positif untuk EPC. Ekspresi CD34 didapatkan pada sel EPC yang masih muda hingga lebih matur. Pemeriksaan dilakukan pada salah satu well yang digunakan untuk menumbuhkan CFU, setelah dilakukan hitung koloni, dicuci dengan PBS dan disiapkan untuk pemeriksaan imunofluoresensi menggunakan CD34. Dari pengamatan menggunakan mikroskop fluorescence, didapatkan ekspresi CD34 ditandai dengan adanya sel EPC yang berpendar hijau seperti tampak pada gambar berikut.
BAB 6