commit to user a Fase Adaptasi (Lag phase)
D. Identifikasi Bakter
Setelah mendapatkan informasi sifat morfologi bakteri, selanjutnya dilakukan identifikasi dengan marka gen 16s rRNA. Gen 16s rRNA terdapat pada sub unit ribosom 30s. Gen 16s rRNA ditemukan pada semua prokariotik, memiliki jumlah nukleotida yang cukup banyak, terdapat basa- basa yang bersifat lestari sehingga dapat disusun sebuah primer universal untuk mengamplifikasi gen 16s rRNA suatu organisme.
Analisis gen 16s rRNA untuk identifikasi bakteri membutuhkan jumlah gen yang cukup dengan cara mengamplifikasi fragmen gen 16s rRNA menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA kromosom terlebih dahulu diekstraksi dari isolat RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl 5. Profil DNA kromosom yang telah diisolasi dianalisis dengan elektroforesis agarosa 1%. Elektroforegram hasil elektroforesis DNA kromosom ketiga isolat (Gambar 19) menunjukkan adanya 1 pita tunggal. Kuantitas DNA (Dioksiribo Nukleotida) diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280. Kuantitas DNA merupakan perbandingan hasil absorbansi yang terbaca pada kedua panjang gelombang tersebut. Kuantitas
commit to user
1
2
3
DNA sebesar 1,7 menunjukkan kuantitas yang cukup, DNA kromosom berhasil diisolasi dengan baik.
Ekstraksi DNA untuk mendapatkan DNA dari isolat bakteri, menggunakan langkah kerja sesuai dengan protokol dari promega. Proses ekstraksi DNA diawali dengan proses lisis dinding bakteri, melarutkan DNA, mengendapkan DNA dan RNA. Setelah itu RNA dihilangkan dengan RNAse. Protein didetanasi dengan protein presipitasion. DNA yang telah diperoleh diendapkan dalam bentuk benang-benang dengan isopropanol. DNA yang telah ter-ekstrak kemudian di elektroforesis dalam gel agarosa 1%.
Prinsip dasar teknik elektroforesis adalah pemisahan molekul DNA oleh medan listrik. Molekul DNA dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Sampel molekul DNA ditempatkan dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan didalam larutan penyangga (TBE), kemudian dialirkan medan listrik. Molekul DNA akan bergerak di dalam matriks gel kearah elektroda positif, karena adanya muatan negatif pada rangka gula-fosfat.
Gambar 19. A. Elektroforesis DNA, B. Elektroforegram agarosa 1%. (1, 2 & 3) Hasil isolasi DNA kromosom Isolat RW Sm A, RW Sm C, dan RW Sl 5 (dilihat dengan bantuan sinar UV)
A
commit to user
Gen 16s rRNA berukuran 710 pb pada isolat RW Sm A, RW Sm C, dan RW Sl 5 berhasil diamplifikasi dengan primer universal; forward Bact F1 (5'-
GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3’), primer reverse Uni B1
(5‘CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘) (gambar 20).
Lisdiyanti (1997) menjelaskan bahwa hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan primer adalah :
a. Panjang urutan basa primer yang optimal adalah 18-20 basa dan tidak terdapat duplikasi antara kedua primer untuk mendeteksi gen target.
b. Spesifitas urutan basa harus tinggi untuk menghindari bergabungnya primer pada daerah yang tidak diiinginkan, terutama pada daerah terminal 3’.
c. Persentase kandungan basa G + C kedua primer antara 40-60%. d. Nilai Tm (melting temperature) kedua primer antara 55-800C.
e. Konsentrasi optimal dari primer antara 0,1-0,5 µM. Konsentrasi yang tinggi akan mengakibatkan kesalahan menempel sehingga mensintesis produk yang tidak diiinginkan.
Nilai Tm dari kedua primer adalah sebagai berikut : Forward Primer; Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) = 2 (4 + 5) + 4 (7 + 4) = 18 + 44 = 62 0C Reverse Primer; Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) = 2 (1 + 8) + 4 (3 + 8) = 18 + 44 = 62 0C
commit to user
Kedua primer mempunyai Tm (melting temperature) 62 0C sehingga diperoleh suhu annealing 62 0C dan presentase kandungan basa G dan C kedua primer 55%. Kandungan basa G dan C yang rendah menyebabkan nilai Tm (melting temperature) rendah.
Reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) dalam penelitian menggunakan master mix gotaq green (Promega). Program PCR (Polymerase Chain Reaction) yang digunakan berdasarkan optimasi alat PCR (Polymerase Chain Reaction) yang akan digunakan. Komposisi larutan dalam 1 mikrotubr reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) terdiri dari; 2 µL DNA, 2 µL Primer Forward, 2 µL Primer reverse, 12,5 µL gotaq green master mix PCR (Promega) dan 6,5 µL dH2O filter. Reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) dimulai pada
kondisi Pra PCR (predenaturasi) pada suhu 94oC selama 2 menit, 30 siklus meliputi denaturasi pada suhu 94oC selama 1 menit, annealing (penempelan) pada suhu 50oC selama 45 detik, pemanjangan 72oC selama 1,5 menit, dilanjutkan pasca PCR 72oC selama 5 menit, pendinginan pada suhu 4oC selama 1 menit.
Dalam satu siklus PCR (Polymerase Chain Reaction) mempunyai tiga tahap yaitu:
a. Pemisahan (Denaturation).
Tahap pertama dalam proses penggandaan adalah pemisahan utas ganda menjadi utas tunggal dengan temperatur tinggi, yaitu 90-95oC selama 30 detik hingga 1,5 menit.
b. Penempelan primer (Renaturation/Annealing).
Tahap penempelan primer terjadi pada suhu yang lebih dingin dibanding dengan tahap denaturasi, yaitu antara 55-70oC. Pada suhu tersebut primer akan menempel pada komplemen DNA target yang spesifik.
commit to user
1500500
700
1000
±710 bp
1
2
3
4
c. Sintesa (Synthesis/Ekstension).Pada tahap sintesa atau ekstensi, temperatur dinaikkan menjadi 72oC, suhu ini merupakan kondisi optimum untuk proses katalisa taq DNA polimerase. Enzim polimerase mulai bekerja dengan cara menyusun pasangan untai DNA baru dengan nukelotida-nukleotida dari dNTPs yang telah tersedia dalam larutan. Sintesa DNA dimulai dari ujung 3’-hidroksi pada tiap primer.
Produk PCR yang berukuran 710 pb tersebut kemudian disekuensing (1st base Singapura). Setiap urutan DNA yang diperoleh dari masing-masing primer untuk masing-masing isolat disejajarkan dengan program bioedit sehingga diperoleh satu urutan DNA utuh. Berdasarkan analisis penyusunan gen, diperoleh 317 pasang basa untuk isolat RW Sm A, 351 pasang basa untuk isolat RW Sm C dan 353 pasang basa untuk isolat RW Sl 5 (Lampiran C).
Gambar 20. Elektroforegram hasil amplifikasi gen 16s rRNA isolat RW Sm A (2), RW Sm C (3),RW Sl 5 (4)
commit to user
Urutan DNA yang telah berhasil disekuensing kemudian dianalisis dengan program BLASTn. Data sekuen DNA isolat RW Sm A, RW Sm C, RW Sl 5 dibandingkan dengan data sekuen DNA yang tersedia di genebank. Identifikasi ditentukan dari kemiripan urutan nukleotida penyusun gen 16s rRNA. Hasil analisis BLASTn terhadap gen 16s rRNA yang mempunyai homologi urutan yang kurang dari 98% menunjukkan bahwa spesies yang dibandingkan merupakan spesies berbeda, homologi antara 93–95% menunjukkan bahwa spesies yang dibandingkan berada pada genus yang berbeda dan homologi antara 89–93% menunjukkan spesies yang dibandingkan berada pada famili yang berbeda. Analisis BLASTn pada isolate RW Sm A, RW Sm C, RW Sl 5 menunjukkan homologi 99%, sehingga ketiga isolat tersebut merupakan kelompok Bacillus (Tabel 5, tabel 6 dan tabel 7). Perbandingan urutan DNA ketiga isolat RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl 5 dengan DNA bakteri dari gen bank, Bacillus cereus acc no. EU621383.1 dan Bacillus aryabattai acc no. JF939025.1) (gambar 21).
Tabel 5. Hasil Homologi urutan nukleotida isolat RW Sm A
No Deskripsi Total Nilai %
kemiripan
1 Bacillus sp. 3 599 99%
2 Bacillus cereus strain AIMST PV6.0 599 99%
3 Bacillus sp. Clone RS2 599 99%
4 Bacillus cereus strain CM100B 1165 99%
5 Bacillus cereus strain 6 599 99%
6 Bacillus cereus 599 99%
7 Bacillus sp. Cp-h45 599 99%
8 Bacillus subtilis strain AIMST 1.Dl.3 597 99% 9 Bacillus subtilis strain AIMST 1.All.14 597 99% 10 Bacillus cereus strain AIMST Saf2 597 99%
commit to user
Tabel 6. Hasil Homologi urutan nukleotida isolat RW Sm C
No Deskripsi Total Nilai %
kemiripan 1 Bacillus aryabhattai strain AIMST Ngse11 542 100%
2 Bacillus sp. TBRh7 542 100%
3 Bacillus aryabhattai strain starin Z7B-11 542 100%
4 Bacillus aryabhattai PSB53 542 100%
5 Bacillus megaterium strain AIMST Hli2 542 100% 6 Bacillus megaterium strain AIMST 2.Hb.5 542 100% 7 Bacillus megaterium strain AIMST 1.Ic.3 542 100%
8 Bacillus sp. PL18-1 542 100%
9 Bacillus sp. 210_33 542 100%
10 Bacillus sp. 210_27 542 100%
Tabel 7. Hasil Homologi urutan nukleotida isolat RW Sl 5
No Deskripsi Total Nilai %
kemiripan
1 Bacillus sp. ATY3 597 99%
2 Bacillus sp. ATY2 597 99%
3 Bacillus cereus starin Hs2-17 595 99% 4 Bacillus sp. IBA 33 isolat 1 595 99%
5 Bacillus sp 2 595 99%
6 Bacillus cereus strain TBLs6 595 99%
7 Bacillus cereus strain C4 595 99%
8 Bacillus anthracis strain H7B-47 595 99% 9 Bacillus anthracis strain G7Ba-66 595 99% 10 Bacillus cereus strain J9B-45 595 99%
Analisis homologi mikroorganisme memberikan informasi kemiripan tertinggi isolat yang diuji dengan data yang tersedia pada genebank. Sedangkan analisis mikroorganisme berdasarkan hubungan kekerabatan pada sistem klasifikasi organisme dilakukan melalui analisis filogenetik.
commit to user
RW_Sm_A GGGAAATAAA AAGANAACCA AAACGGGTGC TATACATGCA AGTCGAGCGA 50
RW_Sl_5 N..G...C.. .GAGA...T. ...-AAC... ... ... 50
RW_Sm_C -..GGCCT.. ....G...A. ....A... ... ... 50
Bacillus_a --- --- --GG... ... ... 50
Bacillus_c --- ----T.G.-- .TG... ... ... 50
RW_Sm_A ATGGATTAAG AGCTTGCTCT TATGAAGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC 100 RW_Sl_5 ... ... ... ... ... 100
RW_Sm_C .CT...GA ...TC ...C.... ... ... 100
Bacillus_a .CT...GA ...TC ...C.... ... ... 100
Bacillus_c ... ... ... ... ... 100
RW_Sm_A ACGTGGGTAA CCTGCCCATA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT 150 RW_Sl_5 ... ... ... ... ... 150
RW_Sm_C ...C.. ...TG.. ... ....T... ...AA... 150
Bacillus_a ...C.. ...TG.. ... ....T... ...AA... 150
Bacillus_c ... ... ... ... ... 150
RW_Sm_A AATACCGGAT AACATTTTGA ACCGCATGGT TCGAAATTGA AAGGCGGCTT 200 RW_Sl_5 ... ... ... ... ... 200
RW_Sm_C ... .GG..C..CT C.TT...G AGATG... ...AT..T.. 200
Bacillus_a ... .GG..C..CT C.TT...G AGATG... ...AT..T.. 200
Bacillus_c ... ... ... ... ... 200
RW_Sm_A CGGCTGTCAC TTATGGATGG ACCCGCGTCG CATTAGCTAG TTGGTGAGGT 250 RW_Sl_5 ... ... ... ... ... 250
RW_Sm_C ...A.... ...CA... G...GT. ... ... 250
Bacillus_a ...A.... ...CA... G...GT. ... ... 250
Bacillus_c ... ... ... ... ... 250
RW_Sm_A AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC 300 RW_Sl_5 ... ... ... ... ... 300
RW_Sm_C ... ... ....A... ... ... 300
Bacillus_a ... ... ....A... ... ... 300
Bacillus_c ... ... ... ... ... 300
RW_Sm_A CACAC TGGGACTGAG ACGCGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTAGGGAA-- 355
RW_Sl_5 ... ...C ..A... T... ... ...TC 355 RW_Sm_C ... ... ..A--- --- --- --- 355 Bacillus_a ... ... ..A... ... ... ...TC 355 Bacillus_c ... ... ..A... ... ...CAGCA GTAGG...TC 355
Gambar 21. Perbandingan urutan basa DNA dari Bacillus sp (i. RW Sm A, ii. RW Sm C dan iii. RW Sl 5) dengan data gen bank Bacillus aryabattai no.akses JF939025.1 dan Bacillus cereus no.akses EU621383.1
(Keterangan : Tanda titik (.) menunjukkan adanya kesamaan basa DNA antar spesies)